CN108727479B - 调控叶倾角的f-box蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及调控叶倾角的F‑BOX蛋白及其应用。本发明首次发现F‑BOX蛋白可以调控禾本科植物的叶倾角，通过敲除或下调F‑BOX基因可以减小叶倾角，优化株型，进而可以实现合理密植，增加单位面积内产量。F‑BOX基因可被应用于直立株型的分子育种中，选育出高产的品种。

Description

调控叶倾角的F-BOX蛋白及其应用

技术领域

本发明属于植物学和基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种调控叶倾角的F-BOX蛋白及其应用。

背景技术

禾本科植物(作物)，特别是水稻，为重要的粮食作物。水稻等作物的株型是决定其产量的核心因素之一。水稻株型的形成主要取决于植株高度、叶倾角以及分蘖角度等因素。在水稻育种中，株型的改良对水稻产量的提高发挥了重要作用，并一直是品种选育的重要指标。

目前研究发现了一些调控水稻株高，分蘖，叶倾角的突变体，比如LC1，SLR1，MOC1等。

目前的研究发现，激素信号的调控对于植物的叶倾角有重要的作用，比如生长素和油菜素内酯，对于调控水稻叶倾角和分蘖数目等有重要作用。

油菜素内酯(brassinosteroids，BRs)是一类重要的类固醇激素，参与调控植物生长发育的许多过程。结合应用遗传学、生物化学以及蛋白质组学等研究手段现已基本阐明了在拟南芥中BR信号转导的主要过程。BRI1作为受体在细胞表面感知BR，BRI1抑制子BKI1从质膜上解离下来，使BRI1与其共受体BAK1结合。BRI1和BAK1通过顺序磷酸化将BR信号完全激活。活化的BRI1将BSK磷酸化激活，BSK活化BSU1，BSU1将BIN2去磷酸化使其失活，解除BIN2对BES1/BZR1的抑制功能。PP2A可以将BES1/BZR1去磷酸化激活，又可以将受体BRI1去磷酸化促使其降解。BR信号的传递最终使去磷酸化状态的BES1/BZR1在细胞内累积，激活BR信号通路下游的转录调控。

目前已经发现BR对于水稻中株型改变，产量提高有重要的作用，由于水稻是一种重要的粮食作物，也是单子叶植物进行分子遗传学研究的模式植物，在水稻BR信号的研究深入将会对农业生产带来实际意义。目前的研究发现生长素信号对水稻叶倾角也有一定的调控作用，当植物体内生长素含量降低或信号减弱时叶倾角会有相应的变大，反之变小。

尽管激素对水稻叶倾角的调控研究比较多，关于水稻中OsmiRNA或其靶基因对叶倾角是否有调控作用还没有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调节禾本科植物的叶倾角大小的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节(包括：上调或下调)禾本科植物株型的方法，所述方法包括：调节禾本科植物中F-BOX蛋白的表达。

在一个优选例中，所述的植物选自：水稻、小麦、玉米。

在另一优选例中，所述的F-BOX蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述方法包括：下调F-BOX蛋白的表达，从而：

减小叶倾角；或

优化获得直立株型或高产株型。

在另一优选例中，所述下调F-BOX蛋白的表达包括：下调或敲除植物中F-BOX蛋白的编码基因，或下调植物中F-BOX蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除F-BOX蛋白的编码基因。

在另一优选例中，敲除F-BOX蛋白的编码基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转入植物细胞中；其中，所述的sgRNA靶向F-BOX蛋白的编码基因。

在另一优选例中，所述的sgRNA靶向于SEQ ID NO:1序列，在第648和649位核苷酸中间插入一个腺苷酸A。

在另一优选例中，所述的sgRNA由SEQ ID NO:8和(SEQ ID NO:9的引物序列退火获得。

在另一优选例中，所述方法包括：上调F-BOX蛋白的表达，从而增大叶倾角。

在另一优选例中，所述上调F-BOX蛋白的表达包括：将过量表达所述F-BOX蛋白的过量表达分子转入植物细胞、组织、器官或种子，从而上调F-BOX蛋白的表达。

在本发明的另一方面，提供一种F-BOX蛋白或其编码基因的用途，用于调节禾本科植物的叶倾角大小；或调节禾本科植物株型。

在一个优选例中，所述的F-BOX蛋白选自下组：

(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在另一优选例中，所述的F-BOX的编码基因包含如下序列：SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2。

在本发明的另一方面，提供一种F-BOX蛋白或其编码基因用途，用于作为禾本科植物叶倾角角度大小及株型的分子标记。

在一个优选例中，若经检测F-BOX蛋白表达低于一个特定值，则相对而言，所述植物的叶倾角变小，株型紧凑；反之，若经检测F-BOX蛋白表达高于一个特定值，则相对而言，所述植物的叶倾角增大。其中，除非另外说明，所述的“特定值”是指植物中F-BOX蛋白表达量的平均值。

在本发明的另一方面，提供sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸的用途，用于与Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转入植物细胞中；其中，所述的sgRNA靶向F-BOX蛋白的编码基因。

在一个优选例中，所述的sgRNA靶向于SEQ ID NO:1序列中的片段，在第648和649位核苷酸中间插入一个腺苷酸A。

在本发明的另一方面，提供一种sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸，所述的sgRNA靶向于SEQ ID NO:1序列中的片段，在第648和649位核苷酸中间插入一个腺苷酸A。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、F-BOX过量表达材料表型分析。F-BOX过量表达水稻材料叶倾角较野生型(中花11)变大。其中，F-BOX-OX-1、F-BOX-OX-2、F-BOX-OX-3为所获得的部分F-BOX过量表达转基因植物。各转基因株系中，F-BOX相对表达已在图中标注(下图)。

图2、F-BOX基因敲除材料表型分析。F-BOX缺失表达水稻材料叶倾角较中花11变小(上图)。其中，F-box-crispr-1、F-box-crispr-2为所获得的部分F-BOX基因敲除的转基因植物。各转基因株系中，F-BOX相对表达已在图中标注(下图)。

图3、F-BOX蛋白结构及抗OsmiR394剪切的碱基替换设计示意图。其中，mF-box为抗OsmiR394剪切设计后的序列。

图4、F-BOX抗OsmiR394剪切材料表型分析。F-BOX抗OsmiR394剪切水稻材料同F-BOX过量表达材料表型相似，叶倾角较野生型(中花11)明显变大(上图)。其中，RMF-BOX-1、RMF-BOX-2、RMF-BOX-3为所获得的部分F-BOX抗OsmiR394剪切的转基因植物。各转基因株系中，F-BOX相对表达已在图中标注(下图)。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现F-BOX基因可以调节水稻叶倾角的大小，从而优化水稻株型，合理密植，提高单位面积水稻产量。因此，可以将F-BOX基因应用于禾本科植物的分子培育中，选育出具有特定株型的植物品种。

在研究过程中，本发明人首先筛选了水稻中响应生长素的OsmiRNA，发现OsmiR394可以被生长素诱导表达，进而通过相关的分子生物学定位到OsmiR394的靶基因是一个F-BOX基因，通过观察F-BOX蛋白过量表达的转基因水稻材料，发现其叶倾角较野生型明显增大。进一步通过基因编辑技术将F-BOX基因敲除后观察到叶倾角较野生型明显变小。说明miR394的靶基因F-BOX基因可以调控水稻叶倾角的变化。而叶倾角变小植物株型紧凑，有利于合理密植，增大光合利用效率，提高单位面积作物产量。所以，F-BOX蛋白可以作为水稻等禾本科植物理想株型的分子标记，应用于水稻等禾本科植物的分子育种中。

如本文所用，所述的“植物”包括但不限于：禾本科植物。比如，所述的“植物”包括但不限于：水稻、小麦、玉米、马铃薯、木薯等。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，所述的“目标基因”是指植物基因组中需要进行敲除操作的感兴趣的基因，本发明中为F-BOX基因。

如本文所用，所述的目标基因上的“靶序列”是指“目标基因”中的一个片段，基于该目标基因上的“靶序列”设计的sgRNA可识别该“靶序列”，由此在该位置发生Cas9编码的蛋白的切割。所述的目标基因上的“靶位点”的长度为18-26个核苷酸。

如本文所用，所述的“sgRNA”即“单独导向RNA(Single-guide RNA，sgRNA)”或“单导向RNA”，其是基于“目标基因上的靶位点”设计，其包含的序列足以与内切核酸酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA双链断裂。

本发明所述的F-BOX蛋白还包括F-BOX蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的F-BOX蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种F-BOX蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，F-BOX蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的F-BOX蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长F-BOX蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长F-BOX蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。较佳地，所述的生物活性片段具有SEQ ID NO:3中第240-690位氨基酸序列。

在本发明中，术语“F-BOX蛋白”指具有F-BOX蛋白活性的SEQ ID NO:3序列的蛋白。该术语还包括具有与F-BOX蛋白相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括F-BOX蛋白的活性片段和活性衍生物。

编码F-BOX蛋白或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟F-BOX蛋白的编码区序列可以与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO:3的蛋白质，但与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

应理解，虽然本发明的F-BOX基因优选获自水稻，但是获自其它植物的与水稻F-BOX基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的F-BOX蛋白的编码序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或F-BOX蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含F-BOX蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的F-BOX蛋白或其编码基因的用途，用于调节(包括：上调或下调)禾本科植物株型。在一种方式下，过表达正义F-BOX蛋白可以增大叶倾角。在另一种方式下，敲除F-BOX基因或沉默(如采用基因干扰的方法)F-BOX基因(或基因片段)后可减小叶倾角，优化获得直立株型或高产株型。因此，可基于F-BOX蛋白对于植物性状的影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。较佳地，所述的植物是禾本科植物。

本发明还涉及F-BOX蛋白或其编码基因的上调剂或下调剂(如基因敲除试剂，又如反义的F-BOX基因或，又如miRNA、shRNA)及其用途。由于F-BOX的上调剂或下调剂可调节F-BOX的表达和/或调节F-BOX的活性等，因此，所述的F-BOX的上调剂或下调剂也可通过对F-BOX的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。

任何可调节F-BOX蛋白的活性、调节F-BOX蛋白的稳定性、促进或抑制F-BOX蛋白的表达、延长或减少F-BOX蛋白有效作用时间、或促进或降低F-BOX基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节叶倾角，改变株型特征或获得高产株型的有效物质。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中F-BOX蛋白的表达。

一方面，本发明提供了一种增大叶倾角的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达F-BOX蛋白。

在得知了所述的F-BOX蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的F-BOX蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带F-BOX编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的F-BOX蛋白。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低F-BOX蛋白的表达或使之缺失表达，比例利用基因编辑技术来敲除F-BOX基因，又比如将携带反义F-BOX基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达F-BOX蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将F-BOX蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将带有外源基因的重组载体导入到可表达所述F-BOX蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达F-BOX蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达F-BOX蛋白的植物。优选的，利用农杆菌转化法将F-BOX蛋白的编码基因转入植物中。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加F-BOX表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强F-BOX的表达。或者通过增强子来增强该F-BOX基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

另一方面，本发明还提供了一种减小叶倾角，促进株型直立的方法，所述的方法包括：降低所述植物中F-BOX蛋白的表达(包括使F-BOX蛋白不表达或低表达)。

作为本发明的优选方式，通过敲除F-BOX基因，从而下调植物中F-BOX基因的表达。较佳地，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除F-BOX基因。

合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

作为本发明的优选方式，敲除F-BOX基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转入植物细胞中；获得转基因植物；其中，所述的sgRNA的靶序列是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在第648和649位核苷酸中间插入一个腺苷酸A。

在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。

作为一种选择，所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9mRNA。此外，可以体外转录获得携带有启动子的Cas9mRNA以及携带有启动子的sgRNA。

本发明所述的方法可用于制备基因敲除植物，其中目标基因F-BOX的基因功能消失。

本发明还提供了用于制备F-BOX基因被敲除、从而株型发生改变的植物的试剂盒，所述的试剂盒中包含针对于F-BOX基因的、应用于进行C-CRISPR方法操作的sgRNA及Cas9mRNA或能够在体内或体外形成该sgRNA及Cas9mRNA的试剂。

其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。

此外，本发明还涉及利用强F-BOX蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用强F-BOX蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中F-BOX蛋白的表达情况，早期确定植物的叶倾角和/或株型特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、F-BOX基因的分离和过量材料表型分析

本发明人在水稻叶倾角调控的研究中，发现F-BOX基因可以调控水稻叶倾角。

通过构建F-BOX过量表达载体F-BOX-over转入水稻材料获得F-BOX过量表达的水稻材料。

载体构建方法如下：通过使用载体pCAMBIA1301。以ZH11水稻基因组为模板，通过引物P1和引物P2扩增F-BOX cDNA基因，均含有KpnI的酶切位点。

P1：C GGGGTACCATGGGGGAGGTGGCGGCGCTGC(SEQ ID NO:4)；

P2：CGGGGTACCTCAGGCCAAGGCAGAGGGGCAT(SEQ ID NO:5)；

用KpnI进行酶切并进行去磷处理，将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，连入到经同样酶切处理后的pCAMBIA1301载体中。

采用电击转化方法将载体质粒导入根癌农杆菌EHA105，并采用农杆菌介导法(参见Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Plant J 1994；6:271-282)，对野生型水稻ZH11(Zhonghua11(获自上海市农业科学院)背景)进行转化。从获得的T0代转基因植株中提取RNA并进行反转录。

用F-BOX基因特异的引物F-BOX-RT-s以及F-BOX-RT-a对该基因的表达进行检测：

F-BOX-RT-s:ATTATGAAGTCTATGATTCTAT(SEQ ID NO:6)，

F-BOX-RT-a:GACGAATTGTCTCCAT ATCCCA(SEQ ID NO:7)；

最终，获得了3个独立的F-BOX基因表达不同程度上调的转基因株系F-BOX-1，F-BOX-2，F-BOX-3。

3个T0代植株收种后进行扩繁，并将T2代的种子分别单株收种，每个单株的种子取30粒，在含潮霉素素(30mg/L)的水中进行萌发，全萌发的单株被鉴定为纯系。所得的3个转基因株系的纯系种子，用于后续的表型分析。如图1所示。

如图1上图可见，与野生型的ZH11相比，转基因株系F-BOX-1的叶倾角明显增大。

实施例2、F-BOX基因敲除材料的构建及表型分析

本发明人进一步通过Crispr-cas9技术对F-BOX基因进行基因编辑，通过Crisprdesigner软件设计一对引物F-BOX-gRNA-L和F-BOX-gRNA-R，构建F-BOX-Crispr-cas9载体实现对F-BOX基因的敲除。

F-BOX-gRNA-L:GGCACACTCAAGGAAATTCCGCGC(SEQ ID NO:8)，

F-BOX-gRNA-R:AAACGCGCGGAATTTCCTTGAGTG(SEQ ID NO:9)；

该基因敲除材料的载体构建分两步完成。采用两个载体即中间载体pOs-sgRNA和终载体Ph-UBI-cas9-7(均获自北京大学，参见Cell Research(2013)23:1233-1236)进行载体构建。首先，将引物F-BOX-gRNA-L和F-BOX-gRNA-R稀释成10Um，各取10ul溶解于0.5XTE溶液中，100ul体系98℃退火5分钟，待用。中间载体pOs-sgRNA用BsaI酶切回收产物。将退火后的引物混合物与酶切回收后的中间载体连接。中间载体构建成功后采用gateway体系，将已构建成功的中间载体和终载体Ph-UBI-cas9-7重组在一起。sgRNA(single-guide RNA)可以引导Cas9内切酶对DNA的定点切割，切割TGG前的2-3个碱基。DNA双链发生断裂后，其在修复的过程中可实现定点插入、缺失、突变或修饰。测序正确即完成F-BOX-Crispr-cas9载体构建。

所述的sgRNA靶向于SEQ ID NO:1序列，在第648和649位核苷酸之间插入一个腺苷酸A。

采用电击转化方法，将载体质粒导入根癌农杆菌EHA105，并采用农杆菌介导法(参见Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Plant J 1994；6:271-282)，对野生型水稻ZH11(Zhonghua11(获自上海市农业科学院))进行转化。

对转化出来的T0代水稻植株进行测序。对基因敲除的材料获得纯系后进行表型观察，如图2所示。图2显示，与野生型的ZH11相比，基因敲除的材料F–Crispr-1的叶倾角明显减小。

根据计算，这种叶倾角的减小使得水稻实现密植，与野生型的ZH11相比，基因敲除的材料F–Crispr-1每平方米能够多野生型栽种约10株，从而可以实现单位面积产量显著提高。

实施例3、F-BOX抗剪切版本材料构建及表型分析

因为F-BOX基因是OsmiR394剪切的靶基因，所以本发明人根据密码子的简并性原则对核苷酸碱基进行替换实现氨基酸的同义突变，如图3所示。根据密码子的简并性即同一种氨基酸可对应多种密码子，在不改变氨基酸序列的前提下，将同种氨基酸的密码子替换，从而破坏OsmiR394的剪切位点。如图3，本发明人将代表赖氨酸的密码子AAG突变为AAA，同理，对后续氨基酸的密码子进行同义替换。将替换后的序列连入载体后转化ZH11、制备转基因植物，构建抗OsmiR394剪切版本的水稻材料。

该版本材料获得纯系后的表型观察及统计如图4所示。F-BOX抗OsmiR394剪切水稻材料同F-BOX过量表达材料表型相似，叶倾角较野生型(中花11)明显变大。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调控叶倾角的F-BOX蛋白及其应用

<130> 171558

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4928

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 1

gcaaacccac cacttctcgc agcagcagca gcagcagcag cagcagaaga agaagagaaa 60

agaaaagaaa agaaaagaaa atattttttg ttgttgttct gggggaagag gaggaggagg 120

agaggggcgc cgctgcggcg gcggcgggag gagggaggat gggggaggtg gcggcgctgc 180

ggcagctggt cggcgaggtg caggagctct gggacctcta cggcgccaac tcccaccccc 240

tcccaaggca agcaactctt ctccctctat cacttcttgc tcctccaatc gattcctccg 300

cccggatctg tgcctgcgat tctccccccg attcgattcg attcgcctct ctctggggtt 360

cttcttcatc atctggcgtc ccctatgtgt aaagaaattt tttttagatc tttcactaac 420

acgctcatgc gattttggct ccccttcttg attggttatt attattactg tatttccgtt 480

gcaaaaaatc ttttattttt ttggcttcct tgtgctggtg gatttggtag ggtaggaagg 540

atcaattcga ggaaacggtg gcgtgcgtga cagaaatggg agaatttcgt gcatatgctt 600

gttgttgttt gttaattaaa ttgattataa ttacccgtct ccaagtttca agccttgaca 660

ttgcccgaag cgataggaca agattcttta cgtatatcca tggtattaag cgcaacaaag 720

tccaccactt gggggttgtt tttgcaccat gcgaggctct ctgctcatct taagatatcc 780

taattaagtt gacttcgggt gttgcactgt ttctactgct atgtaagcaa gggatcaaga 840

caaaaatgaa aacaccgatt attttgacgc cggtttcgat gaaaagaaat ataccagttg 900

caacgttttt ttaactcgaa atccaaagga aatacacgat tactcgatta ccaaggctaa 960

agtgtggttg ccatacaaaa ctaatgtaat ttgttgagca actgcaatct atcttatgta 1020

tatgaacgac agagtggtgc ttgtttcggt gcattatcag gcactccgca cacgatgatt 1080

ataatattga tgctatattt ttagttggac attttagaaa acaaagtata cagttttctg 1140

ttgatttgcg catatcttct gtgataaaat aatgcaattc tattggctac agttggtctc 1200

ataatctcag cagtatcgga tcgcttaatc tgcttgcaat ccgttttggg catattagga 1260

atttgcgcgc cattggaagc tgaggggcat aactacatac ctcaaacagc atgatgttat 1320

tagtgcagtg ctctcctgtt cagttatatc ggtcagagag atagagcatg tgtttatggt 1380

ggatacactt gcactcaagg gttatgtatg agtaatctag tttcgaaatg tgaaaacctg 1440

cagcgcacgt gttttccatc tttgtcatca aactttccat ccacacatgg agtgatagtc 1500

cctagactcc atttgacgct actattgcgt gaaaaggtca tttgcgtgac tgataccccc 1560

cctcccccca taagtcaggt gctctagttc atcaacactt ttggagactt tgagtagact 1620

agttcatcat attgatcatt ccagcgtctg tagatagaat catgcatttc ctgctgtaca 1680

aagctgtgga tcatcttatc tctcttcact ttaaaagttc ttgtgcagtt gtgcctactc 1740

tccagaactt ctttgctagt aaataagatg gactaattgg ttttagtgat atcttgcagg 1800

tggtatttac tggactttga gcatggttca atcaaagatg atcattgtag agcaaggact 1860

ggatacaact cagaattact aaagatcatg gaagctaacc aatctcctcc tcgcaagcgc 1920

tcacggaggg acaaaaaccg tgagaaagca cccaactcaa actcaactga agaaatgcaa 1980

caggagattt ggagtgagtt ccctggagac ctttttgaaa ccgttgttgc aagacttcca 2040

gttgctgcaa ttttccgatt tcgcactgtt tgccggaatt ggtattctat gttgggctca 2100

gaaagtttct ctcagcagta ctcagaagtt ccacagaggc tgccatggtt ctatacaatc 2160

acccatgaga atgccagcaa caatgtagcg atgtatgacc cttcgctgaa aaaatggcac 2220

cacccatcag ttcccctggc tcctgcaaag atagtaattc cagtggcatc tgcaggtggc 2280

cttgtctgtt tattggatct tagccacagg aacttctaca tatgcaatcc gctaacacaa 2340

tcactcaagg aaattccgcg caggtcagtc caggcatggt caagagtggc agtagggatg 2400

gtgatgaacg gaggaacctc taatgaaggt tacaaagtaa tgtggttagg aaatgatggg 2460

aattatgaag tctatgattc tatgaagaat atgtggtctt gtccaggcac ttttcctcca 2520

agcatcaaac ttccgcttgc tctaaatttt aggtcacagc ctgtggcggt tggcagcatg 2580

ctatacttca tgtgtgcaga accagagggt gttttgtcgt atgatgtaag cactgggata 2640

tggagacaat tcgtcatccc actgccactt catctgactg accacacact tgccgagttc 2700

cagggaaggg ttatgctggt gggtctgctc tgcaaaaatg cagcgacatg tgtctgcatt 2760

tgggagttgc agaagatgac tctcctctgg aaggaggtgg acagaatgcc aaatatctgg 2820

tgcttagaat tctacggtaa gcacatgaag atgacatgcc tgggcaacag tggtttgctc 2880

atgctctcct tgaaggcgaa gcggatgaac cgcctcgtga catacaacct tttgaacaag 2940

gagtggcaga aggttcctga ttgcatgctc ccatgcagcc gcaaaaagca gtggatagca 3000

tgtggcacag catttggtcc atgcccctct gccttggcct gacagttttt tttcactttc 3060

ttcaccaaag gtggttgaga tttcacacat tccggatcat tggcctatcc ttagatattt 3120

ccgtcttacc gtgagaaggt tatctgtcat gtacaaaatc atgtaacctg tggttgtttt 3180

tgtatctcgc tgaagcaatc gatatcgttt ggtctatcat ctagaggaat ttggggtcgg 3240

cactacacca actggtttaa gtcttcttag agatattaag gtccttgcca gaaggctgga 3300

cagaagacat ctgtttagtc ttggtttttt gcttgttttc attatcatga tatcgtctcg 3360

tcttcagtgt gtattactta tttctgaatc tgcagtcatc tgcccaaaaa ctgagtatgt 3420

actctctata gtaataactg gggctgaact gatgctcctg ggtcttgatg atacttcttt 3480

atcaatcact agttgcttca attgttctcg gcagatatgt taattcctgt tgctagcaac 3540

catgaaatga tggcatgtgc caggttgcct gatactgaaa ctaccagata tcatttatgg 3600

gggaggtggc ggcgctgcgg cagctggtcg gcgaggtgca ggagctctgg gacctctacg 3660

gcgccaactc ccaccccctc ccaaggtggt atttactgga ctttgagcat ggttcaatca 3720

aagatgatca ttgtagagca aggactggat acaactcaga attactaaag atcatggaag 3780

ctaaccaatc tcctcctcgc aagcgctcac ggagggacaa aaaccgtgag aaagcaccca 3840

actcaaactc aactgaagaa atgcaacagg agatttggag tgagttccct ggagaccttt 3900

ttgaaaccgt tgttgcaaga cttccagttg ctgcaatttt ccgatttcgc actgtttgcc 3960

ggaattggta ttctatgttg ggctcagaaa gtttctctca gcagtactca gaagttccac 4020

agaggctgcc atggttctat acaatcaccc atgagaatgc cagcaacaat gtagcgatgt 4080

atgacccttc gctgaaaaaa tggcaccacc catcagttcc cctggctcct gcaaagatag 4140

taattccagt ggcatctgca ggtggccttg tctgtttatt ggatcttagc cacaggaact 4200

tctacatatg caatccgcta acacaatcac tcaaggaaat tccgcgcagg tcagtccagg 4260

catggtcaag agtggcagta gggatggtga tgaacggagg aacctctaat gaaggttaca 4320

aagtaatgtg gttaggaaat gatgggaatt atgaagtcta tgattctatg aagaatatgt 4380

ggtcttgtcc aggcactttt cctccaagca tcaaacttcc gcttgctcta aattttaggt 4440

cacagcctgt ggcggttggc agcatgctat acttcatgtg tgcagaacca gagggtgttt 4500

tgtcgtatga tgtaagcact gggatatgga gacaattcgt catcccactg ccacttcatc 4560

tgactgacca cacacttgcc gagttccagg gaagggttat gctggtgggt ctgctctgca 4620

aaaatgcagc gacatgtgtc tgcatttggg agttgcagaa gatgactctc ctctggaagg 4680

aggtggacag aatgccaaat atctggtgct tagaattcta cggtaagcac atgaagatga 4740

catgcctggg caacagtggt ttgctcatgc tctccttgaa ggcgaagcgg atgaaccgcc 4800

tcgtgacata caaccttttg aacaaggagt ggcagaaggt tcctgattgc atgctcccat 4860

gcagccgcaa aaagcagtgg atagcatgtg gcacagcatt tggtccatgc ccctctgcct 4920

tggcctga 4928

<210> 2

<211> 1332

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 2

atgggggagg tggcggcgct gcggcagctg gtcggcgagg tgcaggagct ctgggacctc 60

tacggcgcca actcccaccc cctcccaagg tggtatttac tggactttga gcatggttca 120

atcaaagatg atcattgtag agcaaggact ggatacaact cagaattact aaagatcatg 180

gaagctaacc aatctcctcc tcgcaagcgc tcacggaggg acaaaaaccg tgagaaagca 240

cccaactcaa actcaactga agaaatgcaa caggagattt ggagtgagtt ccctggagac 300

ctttttgaaa ccgttgttgc aagacttcca gttgctgcaa ttttccgatt tcgcactgtt 360

tgccggaatt ggtattctat gttgggctca gaaagtttct ctcagcagta ctcagaagtt 420

ccacagaggc tgccatggtt ctatacaatc acccatgaga atgccagcaa caatgtagcg 480

atgtatgacc cttcgctgaa aaaatggcac cacccatcag ttcccctggc tcctgcaaag 540

atagtaattc cagtggcatc tgcaggtggc cttgtctgtt tattggatct tagccacagg 600

aacttctaca tatgcaatcc gctaacacaa tcactcaagg aaattccgcg caggtcagtc 660

caggcatggt caagagtggc agtagggatg gtgatgaacg gaggaacctc taatgaaggt 720

tacaaagtaa tgtggttagg aaatgatggg aattatgaag tctatgattc tatgaagaat 780

atgtggtctt gtccaggcac ttttcctcca agcatcaaac ttccgcttgc tctaaatttt 840

aggtcacagc ctgtggcggt tggcagcatg ctatacttca tgtgtgcaga accagagggt 900

gttttgtcgt atgatgtaag cactgggata tggagacaat tcgtcatccc actgccactt 960

catctgactg accacacact tgccgagttc cagggaaggg ttatgctggt gggtctgctc 1020

tgcaaaaatg cagcgacatg tgtctgcatt tgggagttgc agaagatgac tctcctctgg 1080

aaggaggtgg acagaatgcc aaatatctgg tgcttagaat tctacggtaa gcacatgaag 1140

atgacatgcc tgggcaacag tggtttgctc atgctctcct tgaaggcgaa gcggatgaac 1200

cgcctcgtga catacaacct tttgaacaag gagtggcaga aggttcctga ttgcatgctc 1260

ccatgcagcc gcaaaaagca gtggatagca tgtggcacag catttggtcc atgcccctct 1320

gccttggcct ga 1332

<210> 3

<211> 443

<212> PRT

<213> 水稻

<400> 3

Met Gly Glu Val Ala Ala Leu Arg Gln Leu Val Gly Glu Val Gln Glu

1 5 10 15

Leu Trp Asp Leu Tyr Gly Ala Asn Ser His Pro Leu Pro Arg Trp Tyr

20 25 30

Leu Leu Asp Phe Glu His Gly Ser Ile Lys Asp Asp His Cys Arg Ala

35 40 45

Arg Thr Gly Tyr Asn Ser Glu Leu Leu Lys Ile Met Glu Ala Asn Gln

50 55 60

Ser Pro Pro Arg Lys Arg Ser Arg Arg Asp Lys Asn Arg Glu Lys Ala

65 70 75 80

Pro Asn Ser Asn Ser Thr Glu Glu Met Gln Gln Glu Ile Trp Ser Glu

85 90 95

Phe Pro Gly Asp Leu Phe Glu Thr Val Val Ala Arg Leu Pro Val Ala

100 105 110

Ala Ile Phe Arg Phe Arg Thr Val Cys Arg Asn Trp Tyr Ser Met Leu

115 120 125

Gly Ser Glu Ser Phe Ser Gln Gln Tyr Ser Glu Val Pro Gln Arg Leu

130 135 140

Pro Trp Phe Tyr Thr Ile Thr His Glu Asn Ala Ser Asn Asn Val Ala

145 150 155 160

Met Tyr Asp Pro Ser Leu Lys Lys Trp His His Pro Ser Val Pro Leu

165 170 175

Ala Pro Ala Lys Ile Val Ile Pro Val Ala Ser Ala Gly Gly Leu Val

180 185 190

Cys Leu Leu Asp Leu Ser His Arg Asn Phe Tyr Ile Cys Asn Pro Leu

195 200 205

Thr Gln Ser Leu Lys Glu Ile Pro Arg Arg Ser Val Gln Ala Trp Ser

210 215 220

Arg Val Ala Val Gly Met Val Met Asn Gly Gly Thr Ser Asn Glu Gly

225 230 235 240

Tyr Lys Val Met Trp Leu Gly Asn Asp Gly Asn Tyr Glu Val Tyr Asp

245 250 255

Ser Met Lys Asn Met Trp Ser Cys Pro Gly Thr Phe Pro Pro Ser Ile

260 265 270

Lys Leu Pro Leu Ala Leu Asn Phe Arg Ser Gln Pro Val Ala Val Gly

275 280 285

Ser Met Leu Tyr Phe Met Cys Ala Glu Pro Glu Gly Val Leu Ser Tyr

290 295 300

Asp Val Ser Thr Gly Ile Trp Arg Gln Phe Val Ile Pro Leu Pro Leu

305 310 315 320

His Leu Thr Asp His Thr Leu Ala Glu Phe Gln Gly Arg Val Met Leu

325 330 335

Val Gly Leu Leu Cys Lys Asn Ala Ala Thr Cys Val Cys Ile Trp Glu

340 345 350

Leu Gln Lys Met Thr Leu Leu Trp Lys Glu Val Asp Arg Met Pro Asn

355 360 365

Ile Trp Cys Leu Glu Phe Tyr Gly Lys His Met Lys Met Thr Cys Leu

370 375 380

Gly Asn Ser Gly Leu Leu Met Leu Ser Leu Lys Ala Lys Arg Met Asn

385 390 395 400

Arg Leu Val Thr Tyr Asn Leu Leu Asn Lys Glu Trp Gln Lys Val Pro

405 410 415

Asp Cys Met Leu Pro Cys Ser Arg Lys Lys Gln Trp Ile Ala Cys Gly

420 425 430

Thr Ala Phe Gly Pro Cys Pro Ser Ala Leu Ala

435 440

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

ggggtaccat gggggaggtg gcggcgctgc 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

cggggtacct caggccaagg cagaggggca t 31

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

attatgaagt ctatgattct at 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 7

gacgaattgt ctccatatcc ca 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 8

ggcacactca aggaaattcc gcgc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 9

aaacgcgcgg aatttccttg agtg 24

Claims (11)

1.一种调节禾本科植物的叶倾角的方法，其特征在于，所述方法包括：调节禾本科植物中F-BOX蛋白的表达；所述的F-BOX蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的蛋白；所述的禾本科植物为水稻。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：下调F-BOX蛋白的表达，从而：

减小叶倾角；或

优化获得直立株型或高产株型。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述下调F-BOX蛋白的表达包括：下调或敲除植物中F-BOX蛋白的编码基因，或下调植物中F-BOX蛋白的表达或活性。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除F-BOX蛋白的编码基因。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：上调F-BOX蛋白的表达，从而增大叶倾角。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上调F-BOX蛋白的表达包括：

将过量表达所述 F-BOX蛋白的过量表达分子转入植物细胞、组织、器官或种子，从而上调F-BOX蛋白的表达。

7.一种F-BOX蛋白或其编码基因的用途，用于调节禾本科植物的叶倾角大小；所述的F-BOX蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的蛋白；所述的禾本科植物为水稻。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的F-BOX的编码基因包含如下序列：SEQID NO: 1或SEQ ID NO: 2。

9.一种F-BOX蛋白或其编码基因用途，用于作为禾本科植物叶倾角角度大小的分子标记；所述的F-BOX蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示的蛋白；所述的禾本科植物为水稻。

10.sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸的用途，用于与Cas9 mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转入植物细胞中，调节禾本科植物株型；其中，所述的sgRNA靶向F-BOX蛋白的编码基因；所述的F-BOX 蛋白是氨基酸序列如SEQ ID NO: 3 所示的蛋白；所述的植物为水稻。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的sgRNA靶向于SEQ ID NO: 1序列中的片段，在第648和649位核苷酸中间插入一个腺苷酸A。

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