CN110283240B - 蜡梅CpUFO基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及蜡梅CpUFO基因及其编码的蛋白与应用。本发明通过基因克隆得到蜡梅CpUFO的cDNA序列，该基因的cDNA序列全长为1753bp，包含1212bp的完整开放阅读框(ORF)，编码403个氨基酸。该基因转化拟南芥后表型观察发现转基因株系的显蕾时间、抽葶时间、第一朵花开时间和第一个果荚出现时间均比WT植株早；莲座叶数量、叶片总数均比WT植株少，开花时间提前。对花器官进行观察发现在同一开花时期的转CpUFO基因的拟南芥雌蕊柱长度比野生型拟南芥的长。表明蜡梅CpUFO基因能够促进植株开花，对植株的花器官也有影响。

Description

蜡梅CpUFO基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个蜡梅CpUFO基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

蜡梅(C.praecox(L.)Link)，属于蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(ChimonanthusLindl.)，是我国特有的名贵香花观花树种。蜡梅是少有真正意义上冬季开花且芳香怡人的植物，因为花开放在了严寒的冬季，所以被古今的文化之士赋予了傲霜斗雪、迎难而上的寓意，是文人、雅士们的审美情趣和许多坚韧不拔、越挫越勇的劳动人民优良美德的代表和象征，从古至今受到广大国人们的喜爱。

中国是蜡梅的主要原产地，蜡梅的种质资源在我国广泛分布，主要分布在黄河流域以南地区、秦岭地区以及湖北。同时我国拥有丰富的野生蜡梅种质资源，野生型蜡梅群落主要分布在常绿阔叶林和常绿落叶阔叶混交林地带，气候多为亚热带季风性湿润气候的地方，包括我国的山东、河南、陕西、四川、贵州、云南、广东、广西、浙江、江苏和福建等省。

一种名为F-box的蛋白家族在真核生物中广泛存在，该家族的共同特征是含有一个由约50个氨基酸组成的F-box结构域，自从在人类中发现了第一个F-box蛋白(CyclinF)，许多含有F-box结构域的F-box蛋白被陆续发现。有趣的是F-box基因的数目在不同物种间的差异非常大。在微生物、动物中如：酵母、线虫、果蝇和人类中分别发现了18、520、33和38个F-box基因；而在植物中如拟南芥、鹰嘴豆、谷子和水稻基因组中分别至少有1000多、285、525和687个F-box基因被鉴定。根据这些数据，植物中F-box蛋白相对于动物和微生物中的蛋白的数量较高，后期研究发现F-box家族是植物蛋白家族中的超大家族之一。F-box基因序列的差异导致其在功能上的改变。主要是因为它在降解蛋白和蛋白泛素化的过程中具有特异识别，参与了植物中许多关键的调节植物生长发育的过程，包括激素调控、光信号转导、自交不亲和及花器官发育等。

在被子植物中，UFO是第一个被发现的F-box蛋白，UFO属于拟南芥700多个基因家族编码的一大类F-box蛋白。在拟南芥中，UFO在整个发育过程中都在茎尖分生组织(SAM)中表达，不仅参与调控花发育过程中一系列复杂的器官发育，包括花分生组织形成及花器官识别，同时UFO功能缺失不会显著影响植物的营养发育。在金鱼草中，FIM与UFO基因一样能够编码F-box蛋白。F-box蛋白是泛素连接酶SCF复合体的重要组成部分，它与靶蛋白之间的相互作用决定了泛素连接酶SCF复合体的特异性。通过泛素化通路，F-box蛋白能促进靶蛋白泛素化，特异地降解这些靶蛋白，从而达到调控代谢途径的目的。拟南芥中的UFO基因，参与花分生组织和花器官决定。研究发现UFO基因编码的F-box蛋白，通过泛素系统，能够促进B类同源异型基因的表达，促进花瓣和雄蕊的形成与生长。同时UFO在花发育过程中还以复杂的时空模式表达。在花分生组织中，转录最初在第1阶段被抑制，然后在第2阶段在中心区域被激活。在第3阶段，表达在中心分生组织中丢失，但它以锥形的模式向外侧扩展。到第5阶段，表达开始局限于花瓣原基区域，并通过大多数花器官的发育维持在那里。这一模式与UFO在促进B类MADs-box基因功能中的作用是一致的，因为AP3和PI模式都是在第三阶段建立的，在二、三轮花器官启动前的第五阶段。UFO编码了一种442-aa蛋白，它和FIM一样，含有一种介导与进化保守蛋白SKP1相互作用的F-box基序。尽管拟南芥中含有大量的F-box蛋白，UFO和FIM目前仅与豌豆STP和莲花PFO蛋白具有广泛的同源性。UFO和FIM在体外都与植物SKP1蛋白相关，UFO还与SKP1同源基因ASK1发生遗传作用。研究表明ufo等位基因的分离，阻碍了花瓣的形成。这种ufo突变体主要是依赖于B类花器官识别基因表达后建立的，就在花瓣器官启动和增殖之前，该通路似乎抵消了的抑制作用，允许花瓣器官发生。在拟南芥ufo突变体中，花瓣和雄蕊发育受到严重影响，导致这些器官减少或完全缺失。ufo突变体还与AP3表达域之外的一系列其他缺陷相关，包括某些花中心皮的丢失、花丝代替花；特别是短日条件下，根尖分生组织由营养状态向花序特征的转变。这些结果表明，LFY和UFO表达域的时空重叠对花分生组织和花器官原基的表达具有重要意义。与拟南芥相比，LFY和UFO同源物在其他植物物种中的表达域存在较大差异。因此，它们各自的功能和各自的突变表型与拟南芥lfy和ufo突变体有很大的不同。例如，水稻中的突变体apo1不能产生花；在金鱼草中，人们发现FIM可以激活花器官特征基因的表达，影响花器官的形成。当FIM发生突变时，突变体金鱼草不能形成正常意义的心皮，同时B类和C类基因的表达水平也会降低。而在豌豆stp突变体中，不仅花序出现异常，叶片复杂度也降低。虽然ufo突变体不影响叶片性状，但是在拟南芥中，UFO的异位表达导致拟南芥产生锯齿叶片。这些表型表明，UFO及其同源物在其他物种中的作用不仅限于花瓣和雄蕊轮生的形成，还扩展到包括花序以外的其他分生组织和原基。C末端区域已经被证明与LFY结合，这种相互作用可能导致其泛素化，这些结果与现有数据相结合，为A、B和C类基因如何促进第二轮发育提供了一个改进的框架。

UFO是一种转录共激活因子，在拟南芥中常常作为辅助因子，是LFY调控B类MADS-box基因AP3在花分生组织中的表达来确定花瓣和雄蕊形成和生长的关键辅助因子。LFY作为花分生组织特性基因，在花相关基因调控网络中处于关键位置，还被认为是营养生长过渡到生殖生长的调节中心，并参与多种成花途径。不仅参与花分生组织属性的决定，还参与花分生组织的进一步发育。因此，LFY基因在成花中的作用不局限于调控开花时间和花转变，而是在花分生组织的启动、花分生组织特性的决定以及花器官的形成中都发挥着重要的作用。

有研究表明，LFY和UFO相互作用后可以直接作用于AP3的启动子，而且通过UFO调控蛋白酶体活性在LFY转录激活AP3时是必不可少的。UFO的超表达并不能恢复lfy突变体的雄蕊或花瓣发育，说明UFO只能在LFY活性存在的情况下才能发挥作用。且能够作为LFY转录的共激活因子上调AP3和PI的表达。随后发现UFO在植物体内和体外都与LFY相互作用，形成了一种固定模式，UFO参与修饰LFY，以此来增强LFY的转录活性。而UFO的活化需要LFY功能性蛋白。AP3基因的活化依赖于LFY基因和UFO基因的组合。

而开花是高等植物由营养生长向生殖生长转变的重要生理过程。UFO作为一个参与花器官发育的基因，是B类基因AP3的正调控因子。主要是通过UFO编码的F-box蛋白与SKP1/ASK和Cde53(Cullin)蛋白相互作用，形成泛素连接酶SCF复合体，通过泛素化途径，促进B类基因负调控蛋白的泛素化，特异性降解这些负调控蛋白，从而激活B类基因的表达，促进花瓣和雄蕊的形成与生长。在拟南芥中，UFO突变可导致一系列花发育异常。在金鱼草中，UFO的同源基因FIM突变体金鱼草不能形成正常意义的心皮。因为不同植物的UFO同源基因对于植物的改变是不同的，为了进一步了解CpUFO基因对蜡梅的花器官发育有何影响，我们进行CpUFO的克隆，研究UFO在蜡梅中的作用。

发明内容

本发明的目的是提供蜡梅CpUFO基因及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供蜡梅CpUFO蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的蜡梅CpUFO蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控花期中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

本发明还提供一种使植物提前开花的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

本发明通过基因克隆得到蜡梅CpUFO的cDNA序列，该基因的cDNA序列全长为1753bp，包含1212bp的完整开放阅读框(ORF)、344bp的5'-UTR区和197bp的3'-UTR区，编码403个氨基酸。

蜡梅CpUFO在不同发育时期花芽中实时定量结果表明：3月至5月是蜡梅花器官原基形成阶段、6月至9月初进入休眠阶段、9月花芽分化完成、10月子房成熟阶段、11月9日至12月9日低温累积阶段，CpUFO基因表达量均较低，且均明显低于12月24日露瓣阶段(DP)，随后始花阶段(IB)先略有增加，而后在盛开期(OF)稍后降低，盛花后期(LB)表达量最高，最后在衰败期(WP)迅速降低至盛开后期的1/7。该基因在外瓣中的相对表达量最高，内瓣中的表达量次之，而且外瓣中的表达量是内瓣中的8.5倍，雌雄蕊表达量相对较低。相对其他时期，蜡梅CpUFO基因只是在开花期间的表达最高，表明该基因对蜡梅开花具有一定影响。

将构建好的过表达载体转入农杆菌菌株GV3101并转化野生型拟南芥(Col-0)，对35S::CpUFO/Col-0拟南芥不同株系开花途径相关的内源基因进行表达分析时，发现CpUFO基因在拟南芥开花前的异源表达中拟南芥内源基因AP1、FUL、AP3显著上调，而TFL显著下调。表型观察发现转基因株系的显蕾时间、抽葶时间、第一朵花开时间和第一个果荚出现时间均比WT植株早；莲座叶数量、叶片总数均比WT植株少，开花时间提前。对花器官进行观察发现在同一开花时期的转CpUFO基因的拟南芥雌柱长度要比野生型拟南芥的雌蕊长。综合以上结果，表明蜡梅CpUFO基因能够促进植株开花，对植株的花器官也有影响。

附图说明

图1所示为蜡梅CpUFO基因ORF框的克隆。M(maker)：DNA分子量标准DL2000；1、2、3、4、5：cDNA为模板；CK:阴性对照。

图2所示为CpUFO基因与其同源基因蛋白的进化树。

图3所示为蜡梅CpUFO基因在蜡梅花器官组织中的相对表达量。

图4所示为蜡梅CpUFO基因在不同花发育时期的相对表达量。

图5所示为pCAMBIA1300-CpUFO的双酶切验证。

图6所示为pCAMBIA1300-CpUFO转化农杆菌GV3101的PCR鉴定。

图7所示为CpUFO转基因拟南芥T0代PCR检测。M：DNA marker DL2000；1～10：抗性株系；WT：野生型。

图8所示为CpUFO转基因拟南芥T₂代不同单株CpUFO基因的相对表达分析。

图9所示为蜡梅35S::CpUFO/Col-0转基因拟南芥T₂代植株营养生长时期内源基因的相对表达量。*表示P<0.05水平上差异显著，**表示P<0.01水平上差异显著。

图10所示为蜡梅CpUFO转基因拟南芥T₂代植株表型观察。A：抽葶约1cm时莲座叶数；B：开花时间情况(20d)；C：开花时间情况(25d)；D：果荚长度；E：雌蕊长度。标尺：10cm(A、B、D)，1cm(C)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpUFO基因的克隆

依据所得cDNA序列设计特异性引物，上下游引物包含完整ORF序列，引物序列如下：

表1 CpUFO全长PCR引物

引物名称	引物序列(5’-3’)
		CpUFO-F	TTGGAGAAGAAGGAGAGACAAACCC
CpUFO-R	GGCTTTCACAATCAACATACACACC

以反转录合成的第一链cDNA为模板，以CpUFO特异引物进行PCR扩增。

将蜡梅CpUFO基因开放阅读框PCR扩增结果进行电泳检测，结果显示目的条带特异(图1)。将PCR产物克隆到pMD19-T载体中，转化大肠杆菌，用CpUFO-F(10μM)，CpUFO-R(10μM)特异引物检测，将PCR检测为阳性的单克隆进行测序。序列如SEQ ID No.1所示。

将CpUFO结果在NCBI上BLASTX比对发现，阳性克隆的测序结果属于F-box家族，含有F盒。

用EditSeq和ProtParam软件在线分析结果表明：蜡梅CpUFO基因编码蛋白长403个氨基酸，序列如SEQ ID No.2所示。包含47个碱性氨基酸[Strongly Basic(+)AminoAcids]，占总数的11.6％，43个酸性氨基酸[Strongly Acidic(－)Amino Acids]，占总数的10.7％，174个疏水氨基酸(Hydrophobic Amino Acids)，占总数的43.2％，126个极性氨基酸(Polar Amino Acids)，占总数的31.2％；预测分子式为C₂₀₇₁H₃₁₈₃N₅₄₅O₅₉₂S₂₄；总原子数为6415，等电点pI值为6.55；不稳定系数(instability index)为50.69，由此可以推测该蛋白是一个不稳定的蛋白。脂肪系数为84.81，是一个亲水蛋白。

用SignalP在线软件预测得到，CpUFO蛋白不含有信号肽序列；TMHMM工具预测显示CpUFO蛋白没有跨膜结构域。

利用SOPMA对CpUFO蛋白前体二级结构进行预测结果显示，其主要由12.41％α螺旋(αhelix)、29.53％的延伸链(extended strands)、0.00％β转角(βturn)和58.06％的随机卷曲(random coil)组成。

将蜡梅UFO蛋白与荷花、木薯、苹果、番木瓜、拟南芥(A.thaliana)等植物的UFO蛋白进行多重序列比对。结果表明，蜡梅UFO蛋白与其他UFO蛋白具有较高的相似性，结构比较保守。

将蜡梅CpUFO的最大ORF框翻译的蛋白序列在NCBI上blast，选取与其同源的序列以及一些F-box蛋白进行进化树分析，从CpUFO的F-box结构域开始比对，比对的结果如图2，从图中可知不同物种间UFO同源蛋白的系统进化关系；且蜡梅与无油樟聚为一支，bootstrap值为70％可信度较高，亲缘关系较近，说明其进化地位较低。

实施例2蜡梅CpUFO基因的表达特性分析

本试验所采用的蜡梅材料均为磬口蜡梅(Chimonanthus praecox)。其中所用的茎、叶、果、各花器官材料均采自成年蜡梅植株，其种植于西南大学校园内，以上蜡梅植株均为常规管理。

实时荧光定量PCR引物的设计与合成：选用蜡梅的Actin与Tublin基因作为蜡梅CpUFO基因实时荧光定量的双内参基因，运用Primer Premier 5.0软件设计内参基因和目标基因CpUFO的荧光定量特异性引物，后送至北京六合华大基因科技股份有限公司合成，引物序列见表2。本研究中所有引物均由Primer Premier 5.0软件进行设计、北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表2实时荧光定量PCR引物

引物名称	引物序列
		qCpUFO-F	ATGCCATGGATCACACTTCACTAC
qCpUFO-R	CCAGAATTCTCTCCAGTAGATCGTC
		qCpActin-F	GTTATGGTTGGGATGGGACAGAAAG
qCpActin-R	GGGCTTCAGTAAGGAAACAGGA
		qCpTublin-F	TAGTGACAAGACAGTAGGTGGAGGT
qCpTublin-R	GTAGGTTCCAGTCCTCACTTCATC

以反转录获得的蜡梅cDNA第一链为模板，对蜡梅CpUFO基因在蜡梅不同组织及不同开花时期花器官中的表达情况进行实时荧光定量PCR分析。试验数据通过Bio-RadManager^TM Software(Version 1.1)软件进行分析，用

法获得目的基因的相对表达量。

通过实时荧光定量PCR对蜡梅CpUFO基因在蜡梅花器官各组织中的表达特性分析，发现该基因在蜡梅花器官中，以外瓣中的表达量相对最高，内瓣中的表达量次之，而且外瓣中的表达量是内瓣中的8.5倍，雌蕊比雄蕊稍高一点，相对于外瓣、内瓣，雌雄蕊的表达量相对较低(图3)。

利用实时荧光定量PCR对蜡梅CpUFO基因在蜡梅花芽分化期、盛开期至衰败期这段时期花朵中的表达特性进行分析。3月至6月是蜡梅花器官原基形成阶段、7月至9月进入休眠阶段、10月是子房成熟阶段、11月9日至12月9日是低温累积阶段，CpUFO基因表达量均较低(其中4月28日花瓣原基形成期、5月25日至6月19日雌雄蕊原基形成期的表达量相对较高，是其他时期表达量的1.75～9倍)，且均明显低于12月24日露瓣阶段(DP)，随后始花阶段(IB)先略有增加，而后在盛开期(OF)稍后降低，然后在盛花后期(LB)表达量最高，最后在衰败期(WP)迅速降低至盛开后期的1/7(图4)。

实施例3蜡梅CpUFO基因拟南芥遗传转化及功能分析

结合CpUFO基因ORF框序列自身含有的限制性酶切位点及分布特点和所用的植物超表达载体pCAMBIA1300所含多克隆位点的特征，选择出最合适的酶KpnI和SalI，在原来特异引物上下游加入酶切位点及其相应的保护碱基，用于扩增携带适宜酶切位点的CpUFO基因编码区并将其克隆到植物表达载体的多克隆位点上。引物名称及序列如下：

下划线部分是保护碱基，方框部分为Kpn I酶切位点)；

下划线部分是保护碱基，方框部分为Sal I酶切位点)。

克隆带酶切位点的CpUFO的开放阅读框，将PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，连接到克隆载体pMD19-T上，再转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，最后涂布在Amp抗性的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR鉴定，鉴定为阳性的菌液送至成都擎科有限公司测序。将测序正确的菌液提取质粒，正确的阳性质粒命名为pT-CpUFO。

提取质粒，用KpnI和SalI分别酶切pT-CpUFO质粒和植物表达载体pCAMBIA1300质粒，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中pCAMBIA1300载体大片段及CpUFO小片段。将回收的CpUFO基因片段与表达载体pCAMBIA 1300片段按照Fermentas公司T4连接酶说明书进行连接。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，涂布在含50mg/L Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将电泳检测为阳性的菌液活化后提取质粒进行双酶切验证。将PCR鉴定和双酶切验证均正确的阳性质粒进行测序(图5)，确定无碱基突变后，命名为pCAMBIA1300-CpUFO，即为CpUFO基因植物超表达重组载体。

将pCAMBIA1300-CpUFO重组质粒电击法转化农杆菌GV3101感受态细胞，挑取单菌落，置于800μl无菌的YEB液体培养基(含有50mg/L Kan+50mg/L Gen)中，28℃振荡培养36-48h，以菌液为模板进行PCR检测(图6)。并进一步提取农杆菌转化子质粒，反转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，涂布在含Kan的LB平板上37℃倒置过夜培养，挑取单克隆进行PCR检测，将检测为阳性的菌液再提取质粒进行双酶切验证。验证正确的农杆菌菌液即为含有植物表达载体pCAMBIA1300-CpUFO重组质粒的工程菌。

将通过农杆菌花序侵染获得的转基因拟南芥T₀代种子播种在含50mg/L HYG的MS固体培养基上进行阳性植株筛选，成功转入目的基因的拟南芥能够在抗性培养基上正常生长，而未成功转入的则在子叶期黄化死亡，经筛选共获得12个蜡梅CpUFO转基因拟南芥株系。将筛选出的抗性植株进行移栽，分别收获种子后继续进行抗性筛选，将表现出分离比接近3:1的株系各单株分别移栽收种，并继续进行抗性筛选，最终在T₂代获得7个株系16个纯合体转基因单株。

分别提取T₀代HYG抗性筛选出的拟南芥和野生型拟南芥WT植株的叶片基因组DNA，以蜡梅CpUFO基因特异引物CpUFO-F和CpUFO-R进行PCR检测(如图7)。1-10抗性株系均扩增出与目的片段大小一致的条带，说明目的基因CpUFO已成功插入到拟南芥基因组中。

了进一步检测分析CpUFO基因在转基因拟南芥中的表达水平，分别提取在含HYG抗生素的MS固体培养基上播种后生长约14天左右的T₂代纯合体转基因拟南芥和野生型拟南芥WT幼苗整株总RNA。以反转录后的cDNA作为模板，拟南芥AtActin基因为内参，野生型拟南芥WT为对照，进行实时荧光定量PCR检测和分析，结果如图8所示。

根据荧光定量结果，分别选取表达量最高的6-1、表达量中等的16-3和表达量最低的1-1单株用于后期对CpUFO转基因拟南芥的研究分析及表型观察。

为了研究分析蜡梅CpUFO基因转入拟南芥后其超表达对拟南芥内源基因及其相关基因的影响，分别提取在含HYG的MS固体培养基上播种后生长约14天左右的T₂代纯合体转基因拟南芥和野生型拟南芥WT幼苗整株的总RNA。以反转录后的cDNA为模板，拟南芥AtActin基因为内参，进行实时荧光定量PCR检测和分析各内源基因的表达情况，引入如下表所示。

表3实时荧光定量PCR引物

引物名称	引物序列
		qAtActin-F	CTTCGTCTTCCACTTCAG
qAtActin-R	ATCATACCAGTCTCAACAC
		qAtAP1-F	TAGGGCTCAACAGGAGCAGT
qAtAP1-R	CAGCCAAGGTTGCAGTTGTA
		qAtAP3-F	CTCTGCCTCTGACATCATTACCTTC
qAtAP3-R	GTTTTAGCAACACCATGCCTTATG
		qAtTFL1-F	GTGGTAGGAGATGTTCTTGATTTC
qAtTFL1-R	GACAGGGAGACCAAGATCATAC
		qATFUL-F	GCCTCAATACTGCGTAACCTCC
qATFUL-R	GGTAGGACGTAACATCCAAGCC

结果如图9所示。35S::CpUFO/Col-0T2代和野生型拟南芥中花发育相关基因的实时定量结果显示，相比野生型拟南芥，花序分生组织形成之前，35S::CpUFO/Col-0T2拟南芥中TFL基因下调，且三个转基因株系中的相对表达量与WT均存在极显著差异，从而诱导AP1和FUL上调(其中6-1株系均极显著高于WT；1-1株系AP1相对表达量极显著高于WT，FUL显著高于WT；16-3株系AP1相对表达量极显著高于WT，但FUL与WT无显著差异)，从而促进开花。同时，AP3的相对表达量也较WT上调且存在极显著差异；故可以推测蜡梅CpUFO基因可能具有促进植物提前开花的功能。

以野生型拟南芥WT为对照，对蜡梅CpUFO转基因拟南芥T₂代纯合体株系进行表型观察，结果如表4及图10所示。除列出的表型变化外其他指标均未发现明显异常现象。

表4 CpUFO转基因拟南芥T₂代株系表型统计

表中每组数据均为“平均值±标准差”；a、b、c、d表示P＜0.05水平上差异显著；各株系均为3次重复，每重复12棵植株

结果表明：蜡梅CpUFO转基因拟南芥各单株的抽葶时间、第一朵花开放时间和第一个果荚出现时间均比野生型拟南芥WT早，且均达到显著水平；同时莲座叶数均显著少于野生型拟南芥，1-1和6-1的莲座叶数彼此之间差异显著，但均与16-3差异不显著；转基因拟南芥平均长至7.77片莲座叶时已转入生殖生长阶段，而野生型WT则平均生长至10.72片莲座叶时才进入生殖生长；其中，各转基因拟南芥单株的抽葶时间彼此差异显著，对于第一朵花开放时间和第一个果荚形成时间，三个株系间差异不显著，但均显著晚于WT。此外，从观察拟南芥花器官发现在相同花期，与野生型拟南芥WT相比，转基因植株的雌柱都要比WT雌柱长，果梗、植株高度都无太大的影响。

以上结果分析显示，蜡梅CpUFO基因表达量越高，转基因拟南芥的莲座叶数越少，抽葶时间、第一朵花开放时间、第一个果荚形成时间越短。由于植株由营养生长向生殖生长转化的时间提前，导致营养生长时间缩短，莲座叶数减少，开花时间提前，对花器官进行观察发现在同一开花时期的转CpUFO基因的拟南芥雌柱长度要比野生型拟南芥的雌蕊长。综合以上结果，推测蜡梅CpUFO基因能够促进植株开花，对植株的花器官也有影响。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蜡梅CpUFO基因及其编码的蛋白与应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 1

atggagagag aaatgccatg gatcacactt cactacaatg ttggaagcaa agaagttgta 60

gagtttggaa cactatcaga gatcagcaat gacggcaata atgagtcatt ggtttcttta 120

gatgctatcc tgccagacga tctactggag agaattctgg cctatttgcc aatagcaagc 180

atgtttaggg caggatccgt gtgcaaaagg tggaacgaag ttgtaaattc aagaagattt 240

ttatggaact ccaacatctt accacagaaa ccatggtatt tcatgtttat gagtagtgat 300

gatgctggag gttacgtata tgatccaagc cttcggaaat ggtatggctt tgaactccca 360

tgcattgaga cgtcaagttg gtttattgcc tcttcatatg gattggtttg cttcatggat 420

aatgatagcc aaagtcggct ctttgtatgt aatccggtta caagaaagtt gaagaggctt 480

gatgagccac caggtctgaa atccgattat attgcacttg caatgtcagt agatcagaaa 540

tctcattgtt atacagttgc cattgtgaaa tctaagcaag tacccaacaa tttccttcag 600

tgggacctat cgatccttgt ttacaattca gaaacagaaa tgtgggttac ttctgttgca 660

gaggtgttga ccgggtggag gggaggcaat gaaagtgtgg tttgcggcgg agttttgtat 720

tgcttgattt actcaacccg catcacaggt ggctccgaaa accggcatgg gctgattatg 780

tacgatctct caagaagatc ttctcatgct tcactgatta gaacttccat tccagtgcct 840

tgcgctctta catgtggccg gttgatgaac ctcaatgatg agctggtgat ggtcgggggc 900

attgggaaac aggaccggcc tgatataatc aagggaattg gcatctggac tctctgcaag 960

aaagaatggc gtgaggtttc tagaatgccc cacaagtttt ttcaaggctt tggagagttc 1020

gacgatgttt ttgtgagcag cggcaccaat gatcttgtat acattcaaag ctatggagct 1080

cctgcactgc ttgtcttcga tatgaaccag aagcaatgga aatggtcaca gaagtgtcct 1140

gtgacaaaaa gattccctct tcagctcttc actggctttt ccttcgaacc tcggcgtgag 1200

atctcaccgt aa 1252

<210> 2

<211> 403

<212> PRT

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 2

Met Glu Arg Glu Met Pro Trp Ile Thr Leu His Tyr Asn Val Gly Ser

1 5 10 15

Lys Glu Val Val Glu Phe Gly Thr Leu Ser Glu Ile Ser Asn Asp Gly

20 25 30

Asn Asn Glu Ser Leu Val Ser Leu Asp Ala Ile Leu Pro Asp Asp Leu

35 40 45

Leu Glu Arg Ile Leu Ala Tyr Leu Pro Ile Ala Ser Met Phe Arg Ala

50 55 60

Gly Ser Val Cys Lys Arg Trp Asn Glu Val Val Asn Ser Arg Arg Phe

65 70 75 80

Leu Trp Asn Ser Asn Ile Leu Pro Gln Lys Pro Trp Tyr Phe Met Phe

85 90 95

Met Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Tyr Val Tyr Asp Pro Ser Leu Arg

100 105 110

Lys Trp Tyr Gly Phe Glu Leu Pro Cys Ile Glu Thr Ser Ser Trp Phe

115 120 125

Ile Ala Ser Ser Tyr Gly Leu Val Cys Phe Met Asp Asn Asp Ser Gln

130 135 140

Ser Arg Leu Phe Val Cys Asn Pro Val Thr Arg Lys Leu Lys Arg Leu

145 150 155 160

Asp Glu Pro Pro Gly Leu Lys Ser Asp Tyr Ile Ala Leu Ala Met Ser

165 170 175

Val Asp Gln Lys Ser His Cys Tyr Thr Val Ala Ile Val Lys Ser Lys

180 185 190

Gln Val Pro Asn Asn Phe Leu Gln Trp Asp Leu Ser Ile Leu Val Tyr

195 200 205

Asn Ser Glu Thr Glu Met Trp Val Thr Ser Val Ala Glu Val Leu Thr

210 215 220

Gly Trp Arg Gly Gly Asn Glu Ser Val Val Cys Gly Gly Val Leu Tyr

225 230 235 240

Cys Leu Ile Tyr Ser Thr Arg Ile Thr Gly Gly Ser Glu Asn Arg His

245 250 255

Gly Leu Ile Met Tyr Asp Leu Ser Arg Arg Ser Ser His Ala Ser Leu

260 265 270

Ile Arg Thr Ser Ile Pro Val Pro Cys Ala Leu Thr Cys Gly Arg Leu

275 280 285

Met Asn Leu Asn Asp Glu Leu Val Met Val Gly Gly Ile Gly Lys Gln

290 295 300

Asp Arg Pro Asp Ile Ile Lys Gly Ile Gly Ile Trp Thr Leu Cys Lys

305 310 315 320

Lys Glu Trp Arg Glu Val Ser Arg Met Pro His Lys Phe Phe Gln Gly

325 330 335

Phe Gly Glu Phe Asp Asp Val Phe Val Ser Ser Gly Thr Asn Asp Leu

340 345 350

Val Tyr Ile Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Ala Leu Leu Val Phe Asp Met

355 360 365

Asn Gln Lys Gln Trp Lys Trp Ser Gln Lys Cys Pro Val Thr Lys Arg

370 375 380

Phe Pro Leu Gln Leu Phe Thr Gly Phe Ser Phe Glu Pro Arg Arg Glu

385 390 395 400

Ile Ser Pro

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 3

ttggagaaga aggagagaca aaccc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 4

ggctttcaca atcaacatac acacc 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 5

atgccatgga tcacacttca ctac 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 6

ccagaattct ctccagtaga tcgtc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 7

gttatggttg ggatgggaca gaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 8

gggcttcagt aaggaaacag ga 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 9

tagtgacaag acagtaggtg gaggt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 10

gtaggttcca gtcctcactt catc 24

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 11

ggggtaccat ggagagagaa atgccatgga tc 32

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 12

gcgtcgaccc agaattctct ccagtagatc gtc 33

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 13

cttcgtcttc cacttcag 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

atcataccag tctcaacac 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

tagggctcaa caggagcagt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 16

cagccaaggt tgcagttgta 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 17

ctctgcctct gacatcatta ccttc 25

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 18

gttttagcaa caccatgcct tatg 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

gtggtaggag atgttcttga tttc 24

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

gacagggaga ccaagatcat ac 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 21

gcctcaatac tgcgtaacct cc 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 22

ggtaggacgt aacatccaag cc 22

Claims (7)

1.蜡梅CpUFO蛋白，其为：由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的蜡梅CpUFO蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在调控植物花期中的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

7.一种使植物提前开花的方法，其为将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

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