CN112341529B

CN112341529B - 蜡梅CpFPA基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN112341529B
Application number: CN202011286084.1A
Authority: CN
Inventors: 李志能; 乌春雨; 眭顺照; 李名扬
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112341529A

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及蜡梅CpFPA基因及其编码的蛋白与应用。本发明克隆得到蜡梅CpFPA，cDNA序列的最大开放阅读框(ORF，open read frame)为3099bp，编码1032个氨基酸。将pCAMBIA1300‑CpFPA对拟南芥花序进行浸染，发现转基因拟南芥中AtFLC、AtSVP的表达量与野生型拟南芥(Col‑0)相比显著降低，AtAP1、AtLFY的表达量增加，并且转基因拟南芥株系的抽葶时间、现蕾时间、第一朵花开时间、第一个果荚形成时间均早于Col‑0，莲座叶减少，而茎生叶增多，呈现早花表型。由以上结果表明，CpFPA基因能抑制AtFLC的表达，进而促使植物早花。

Description

蜡梅CpFPA基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个蜡梅CpFPA基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

蜡梅(Chimonanthus praecox)属于落叶丛生灌木，花期长，且具有芳香气味，不仅是我国特有的传统名贵花木，而且自古以来被赋予深厚的历史文化，具有极高的观赏价值及人文价值。蜡梅原产于我国中部，现分布范围较为广泛，包括四川、重庆、湖南、浙江等地均有种植。

随着分子生物学的迅猛发展，对蜡梅分子方面的研究也逐渐成为热点。目前已有的研究包括通过分子标记分析遗传多样性和品种分类、抗逆性以及对开花相关基因的功能进行分析等多方面，以期使蜡梅在应用中发挥其最大的价值。利用分子标记对蜡梅进行研究，杨佳发现蜡梅序列中开发的分子标记具有良好的种间通用性，且对遗传多样性分析的结果显示蜡梅有偏低的遗传多样性，蜡梅居群之间有较高的遗传分化并且居群之间结构复杂，存在有一定的居群遗传分化。在对蜡梅花芽的研究中，赵凯歌利用cDNA-SRAP技术分离得到蜡梅花发育不同时期差异表达基因片段，并且推测其可能在参与蜡梅花发育及抗逆性方面起重要作用。通过分子生物学手段研究蜡梅抗逆性，有利于在实际生产中指导蜡梅的栽培。陈严在对蜡梅CpNAC8转录因子的研究中发现，CpNAC8基因在拟南芥中的超表达使植物对盐胁迫有响应，推测其可能具有负调控的功能，而且在进行干旱胁迫处理时CpNAC8基因能够提高植物的抗旱能力。刘道凤发现低温、盐胁迫及ABA处理能使蜡梅叶片中的CpTAF10基因被不同程度地诱导表达，并且CpTAF10基因在拟南芥中的过表达使盐胁迫处理的种子萌芽率增高，主根和侧根表现出一定的生长优势，由此推测CpTAF10基因参与蜡梅逆境胁迫耐性的分子调控。张倩在对蜡梅CpICE1a、CpICE1b与CpDREB1转录因子研究中发现，这几个基因均受低温胁迫的影响，但是表达模式有差异；并推测蜡梅通过反馈调节机制来适应开花时期的低温环境，维持自身生长。在分子水平上对蜡梅性状进行改良比起传统育种方式更容易获得期望的观赏性状。眭顺照等使用EST技术构建了第一个蜡梅花cDNA文库，对调控蜡梅开花的相关基因进行了分析，以此为基础克隆得到影响花发育的多个基因，并对其进行了系统的研究。蜡梅花香以萜烯为主要成分，文娟在烟草上过表达CpTPS10、CpTPS14基因，通过GC-MS香气成分分析，发现CpTPS10基因显著提高了烟草的倍半萜石竹烯和4,5-di-epi-马兜铃烯的含量，CpTPS14基因则显著提高了烟草中单萜芳樟醇和倍半萜4,5-di-epi-马兜铃烯的含量。李志能等在对蜡梅花发育的研究中发现CpWOX13基因在各花发育阶段均有表达，表达量最高的阶段为5月份雌雄蕊原基分化阶段的花芽，并且CpWOX13基因在拟南芥中的过表达促进了拟南芥早花及其侧根的发育。

SPEN家族(the split ends family)含有RNA结合蛋白，具有N末端RNA识别基序(RRM)和SPOC结构域(Spen paralog and orthologC-terminal domain)，调节选择性3’末端剪切和多聚腺苷酸化。含有RRM基序的RNA结合蛋白参与RNA代谢和转录后调控，而SPOC结构域可能在SPEN家族蛋白质中具有多种功能并且介导蛋白质-蛋白质相互作用，但是其发挥功能的分子机制尚不清楚。FPA属于SPEN蛋白质家族，在N末端附近有三个重复的RNA识别基序(RRM)，编码RNA结合蛋白，并通过对FLC的反义RNA 3’末端的选择性剪切及聚腺苷酸化的调控影响FLC的表达，进而调控植物的开花时间。在植物中，FPA同源物的SPOC结构域高度保守，但在其它SPEN蛋白中其结构域的保守性较低，并且SPOC结构域可能并不是FPA在对RNA 3’末端的调节中所必需的。

FPA(Flowering time control protein FPA)是基因组中RNA介导的染色质沉默所必需的，在某些目标基因座上FPA促进不对称DNA甲基化，这与另外一些基因座中DNA甲基化的功能等同，Isabel等推测FPA参与单拷贝及低拷贝基因的染色质沉默的调节，并以基因座依赖性方式与典型的小干扰RNA介导DNA甲基化途径相互作用，以调节共同的靶标。FPA通过抑制编码FLC的mRNA的积累来促进植物开花。MtFPA在拟南芥晚花突变体fpa-2中的过表达使其在长日照条件下加速开花，并且在MtFPA转基因植物中，下调了AtFLC的表达，上调了开花整合子AtFT和AtSOC1的表达，由此表明MtFPA在豆科植物开花时间的调控中起重要作用。除了对FLC的直接调控作用以外，FPA与FVE也独立于FLC的机制促进植物开花，并且两者之间也具有冗余的功能。Csaba等鉴定了FPA在mRNA3’末端形成中的活性，并且认为FPA与FCA以冗余的功能来控制选择性多腺苷酸化反义RNA在开花抑制子FLC中的表达。目前有相关研究发现，FPA还可以通过组蛋白脱甲基酶FLD使FLC沉默，进一步证明了RRM型的RNA结合蛋白是通过触发染色质变化来实现的沉默。Fritz等在研究中发现FPA在发育中的组织中表达最强并且可能通过多种途径促进开花，在拟南芥中使其突变可以导致开花极度延迟，过表达AtFPA则使其呈现不受光周期影响的早花现象。

FPA基因已在拟南芥等植物中验证了具有抑制FLC基因的表达进而促进植物早花的功能。但在蜡梅中，对参与自主途径调控开花的相关基因的研究较少，其在蜡梅中具体的分子机制也尚不明确。若蜡梅中的FPA基因也具有以上的相似作用，那将对于全面了解蜡梅开花的自主途径调控机制有着深远的意义。

发明内容

本发明的目的是提供蜡梅CpFPA基因及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供蜡梅CpFPA蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

本发明还提供编码所述的蜡梅CpFPA蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在调控花期中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

本发明还提供一种使植物提前开花的方法，其为将含有所述基因的载体转入所述植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。

本发明克隆得到蜡梅CpFPA基因，cDNA序列的最大开放阅读框(ORF，open readframe)为3099b分别编码1032个氨基酸。蜡梅CpFPA蛋白由1032个氨基酸组成，其中有91个(8.81％)碱性氨基酸[Strongly Basic(+)Amino Acids]以及101个(9.79％)酸性氨基酸[Strongly Acidic(－)Amino Acids]，分子量为113443.54Da，等电点pI为6.41，不稳定系数为61.63，推测该蛋白为不稳定蛋白，属于细胞核蛋白，不含有信号肽序列，没有跨膜结构域，预测分子式为C₅₀₀₃H₇₇₄₄N₁₄₄₀O₁₅₁₀S₃₈。对CpFPA蛋白前体的二级结构进行预测显示其主要由16.18％的α螺旋(αhelix)、10.37％的延伸链(extended strands)、3.00％的β转角(βturn)和70.45％的随机卷曲(random coil)组成。CpFPA蛋白结构域较为保守，包含有3个RRM基序及一个SPOC结构域，属于SPEN家族，构建系统进化树发现其与沉水樟(Cinnamomummicranthum)FPA蛋白亲缘关系最近。

利用荧光定量PCR技术对CpFPA基因进行表达分析后发现，CpFPA基因在雄蕊、雌蕊、叶、外瓣、中瓣、内瓣、幼果、茎等各组织中均有表达，在雄蕊、叶中表达较高，在内瓣中表达量最低。其在整个花发育周期内基本都有表达，且在花器官原基形成阶段及花芽休眠阶段显著高于开花阶段，推测CpFPA可能在花序分化过程中影响了植物成花，可能主要参与蜡梅开花前的调控，而对开花后的调控较弱。

将pCAMBIA1300-CpFPA质粒通过电转法转入农杆菌，对拟南芥花序进行浸染，收集浸染后的拟南芥种子，进行Hyg抗性筛选，直至获得纯合体的种子。对不同的转基因拟南芥株系进行qPCR分析，选取表达量分别为高、中、低的OE21-4#、OE5-3#、OE13-5#，测定其内源基因的表达量并进行表型观察，发现转基因拟南芥中AtFLC、AtSVP的表达量与野生型拟南芥(Col-0)相比显著降低，AtAP1、AtLFY的表达量增加，并且这三个株系的抽葶时间、现蕾时间、第一朵花开时间、第一个果荚形成时间均早于Col-0，莲座叶减少，而茎生叶增多，呈现早花表型。由以上结果表明CpFPA基因能抑制AtFLC的表达，进而促使植物早花。

附图说明

图1所示为蜡梅CpFPAY基因ORF框的克隆。M(maker)：DNA分子量标准DL2000；1-4以cDNA为模板，5为阴性对照。

图2所示为CpFPA蛋白与其它物种FPA的氨基酸序列比对。

图3所示为CpFPA基因与其同源基因蛋白的进化树。

图4所示为蜡梅CpFPA基因在不同花发育时期的相对表达量。DP：露瓣期；IB：初开前期；OF：初开后期；LB：盛开期；WP：衰败期。**表示P<0.01水平上差异显著。

图5所示为蜡梅CpFPA基因在蜡梅不同组织中的相对表达量。

图6所示为pCAMBIA1300-CpFPA的双酶切验证。M：DNA分子量标准DL2000。

图7所示为pCAMBIA1300-CpFPA转化农杆菌GV3101的PCR鉴定。M：DNA分子量标准DL2000；1：阳性对照，2-13：农杆菌菌液PCR检测。

图8所示为CpFPA转基因拟南芥的Hyg抗性筛选。

图9所示为CpFPA转基因拟南芥T₀代PCR检测。M：DNA分子量标准，DL2000；1-9：转CpFPA基因拟南芥；10：野生型拟南芥(Col-0)。

图10所示为CpFPA转基因拟南芥T₂代不同单株的相对表达分析。**表示P<0.01水平上差异显著。

图11所示为CpFPA转基因拟南芥T₂代植株营养生长时期内源基因的相对表达量。(A)：AtFLC的相对表达量；(B)：AtAP1的相对表达量；(C)：AtSVP的相对表达量；(D)：AtLFY的相对表达量。a、b、c、d表示P<0.05水平上差异显著。

图12所示为CpFPA转基因拟南芥T₂代株系表型观察。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别代表植株移栽18d、20d、22d、24d的生长状态。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1蜡梅CpFPA基因的克隆及分子特征分析

将从转录组获得的蜡梅CpFPA基因进行序列分析设计特异引物，以蜡梅cDNA第一链为模板，扩增蜡梅CpFPA基因，PCR反应体系及反应条件如下：

采用CpFPA特异引物进行PCR扩增，从蜡梅cDNA中扩增出大小约3100bp的特异产物，如图1所示。PCR产物分别与pMD19-T连接，转化到大肠杆菌感受态细胞中，将PCR鉴定显示条带正确的单克隆菌液送至华大公司测序，序列如SEQ ID No.1所示。

通过EditSeq、Vector NTI 9.0软件对蜡梅CpFPA基因cDNA序列特征分析发现，蜡梅CpFPA基因cDNA序列全长为3626个核苷酸，最大开放阅读框(Opening Read Frame，ORF)为3099bp，由834个A、683个G、737个C、845个T组成，A+T含量约为54.18％，G+C含量约为45.82％，编码1032个氨基酸(SEQ ID No.2所示)。

在NCBI上BLASTX比对分析发现CpFPA蛋白具有3个RRM基序及一个SPOC结构域。利用BioEidt软件将蜡梅(C.praecox)、拟南芥(A.thaliana)、大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)等物种的FPA同源蛋白进行多重序列比对，如图2，结果显示蜡梅CpFPA蛋白结构域较为保守，并且与其它物种的FPA蛋白相比具有较高的相似性，且与大豆GmFPA蛋白相似性最高，为49.58％。

利用MEGA6.0软件构建系统进化树，发现蜡梅CpFPA基因与沉水樟(Cinnamomummicranthum)、莲(Nelumbo nucifera)、无油樟(Amborella trichopoda)、蓝星睡莲(Nymphaea colorata)聚为一支，且与沉水樟亲缘关系最近(图3)。

实施例2蜡梅CpFPA基因的表达特性分析

选取西南大学校园中常规养护管理的成年‘罄口’蜡梅(Chimonanthus praecox‘grandiflorus’)各组织及不同时期的完整花器官，用于总RNA的提取，反转录成cDNA。

在对蜡梅CpFPA基因进行实时荧光定量(qPCR)分析时，以蜡梅的Actin基因及Tublin基因为双内参基因，内参基因和目的基因特异性引物均使用软件PrimerPremier5.0进行设计，具体引物序列见表1。

表1蜡梅实时荧光定量PCR引物

注：F代表上游引物，R代表下游引物。

以‘磬口’蜡梅为材料提取的RNA进行反转录获得的cDNA第一链为模板，分别对CpFPA基因在蜡梅各组织及不同开花时期花器官中的表达情况进行qPCR分析。试验数据通过Bio-Rad Manager^TMSoftware(Version 1.1)进行分析，用

法获得CpFPA基因在不同材料中的相对表达量。利用SPSS 22对结果进行差异性分析。

反应体系：

反应程序：

(1)蜡梅CpFPA基因在不同时期花器官中的表达分析

利用qPCR对蜡梅包括花芽分化期、初开期、盛开期至衰败期的不同花发育时期中的CpFPA的表达特性进行分析，如图4所示，发现CpFPA基因在其整个周期内基本都有表达：在花器官原基形成阶段，除了3月8日表达量极低，其它时期的表达量相对较高；花芽逐步进入休眠阶段，CpFPA基因的表达量呈升高趋势，到达顶点后逐步降低；在子房成熟阶段及低温积累阶段总体呈降低趋势，并呈现了最低水平的表达量；进入开花阶段后，其表达量再次升高。CpFPA的表达量的总体趋势是先升高后降低再升高，且在花芽休眠阶段(7月2日-9月2日)最高，约是其他阶段的2～15倍，在低温积累阶段(11月19日-11月28日)最低，是其他阶段的0.02～0.57倍；进入开花阶段后，在衰败期(WP)有一个较高值，是开花阶段表达量最低的露瓣期(DP)的7.37倍。

(2)蜡梅CpFPA基因在各组织中的表达分析

利用qPCR分析CpFPA基因在蜡梅各组织中的表达特性，如图5所示，CpFPA基因在各组织中均有表达，其相对表达量从高到低依次是雄蕊、叶、中瓣、外瓣、雌蕊、幼果、茎、内瓣，其中表达量最高的雄蕊、叶分别是表达量最低的内瓣的14.52倍、16倍。

实施例3蜡梅CpFPA基因表达载体构建及植物遗传转化

为了保证目的基因在不受酶切影响的前提下插入到植物表达载体中，分析了CpFPA基因的最大ORF框序列上的限制性酶切位点及分布特点，并结合植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点特征，筛选出了最适宜用于双酶切的酶KpnI和XbaI。为了分别扩增出携带有KpnI和XbaI酶切位点的CpFPA基因编码区以用于后续实验，设计酶切位点及其相应的保护碱基加在原有的特异引物序列的上下游。引物名称及序列如下：

p-CpFPA-F(

下划线部分是保护碱基，方框部分为KpnI酶切位点)；

p-CpFPA-R(

下划线部分是保护碱基，方框部分为XbaI酶切位点)；

PCR扩增体系和反应程序如下：

反应体系：

反应程序：

以实施例1中测序正确的菌液为模板进行PCR扩增，其产物经电泳及胶回收后，再次与克隆载体pMD19-T进行连接后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，于37℃恒温箱中倒置过夜培养，选择单克隆挑菌并进行PCR检测，结果显示正确的菌液送至成都擎科有限公司测序。如测序正确，则可将菌液进行质粒提取，并分别命名为pT-CpFPA。

用KpnI和XbaI进行酶切，再用琼脂糖凝胶电泳检测并回收CpFPA小片段和pCAMBIA1300载体大片段，将回收的两个片段通过T4连接酶连接，并进行PCR检测、双酶切验证(图6)、送测后，确定序列正确，将其命名为pCAMBIA1300-CpFPA，为CpFPA基因植物超表达重组载体。

提取pCAMBIA1300-CpFPA质粒，转入农杆菌GV3101中，并进行菌液PCR鉴定(如图7)

(1)转基因拟南芥的Hyg抗性筛选

对哥伦比亚型拟南芥花序进行农杆菌浸染后，将收到的T₀代种子在含有50mg/LHyg的MS固体培养基上播种，进行抗性植株筛选，转入目的基因的拟南芥生长正常，而未成功转入的拟南芥在子叶期黄化矮小(图8)。筛选出的抗性苗收获种子后继续进行Hyg筛选，其后代会表现出3:1的分离比。经筛选，转CpFPA基因拟南芥在T₂代获得8个株系11个纯合体转基因单株。

(2)转基因拟南芥PCR阳性检测

提取Col-0及转基因拟南芥的基因组DNA，用CpFPA基因的特异引物进行PCR鉴定。如图9显示，Col-0无条带，而转基因拟南芥扩增出的条带与目的条带大小一致，说明目的基因CpFPA已经成功的插入到拟南芥的基因组中。

(3)转基因拟南芥表达量检测

根据上述检测结果，提取生长约14天的Col-0及T₂代转基因拟南芥的总RNA，以反转录的cDNA第一链为模板，拟南芥Actin基因为内参基因，检测并分析转基因拟南芥中CpFPA基因的表达量，从而进一步验证CpFPA基因在转基因拟南芥中的表达水平。野生型拟南芥中基本没有检测到CpFPA基因的表达，而在转基因拟南芥不同的单株中，CpFPA基因的表达水平各不相同(图10)。实验获得了8个株系11个纯合体转基因单株，选择表达量最高的OE21-4#、表达量中等的OE5-3#、表达量较低的OE13-5#进行内源基因的表达分析及表型观察。

(4)转基因拟南芥内源基因的实时荧光定量PCR检测

为了进一步分析蜡梅CpFPA基因转入野生型拟南芥后对拟南芥内源基因的影响，根据(3)的检测结果，以选取的转基因拟南芥株系中表达量分别为高、中、低的单株的反转录产物为模板，进行实时荧光定量PCR，检测不同转基因株系及野生型WT中拟南芥内源开花相关基因AtFLC、AtAP1的表达情况。利用Bio-Rad Manager^TMSoftware(Version 1.1)软件对试验数据进行分析，目的基因的相对表达量由

法获得，引物见表2。

表2拟南芥实时荧光定量PCR引物

结果表明CpFPA基因的转入使拟南芥中AtFLC基因的表达量明显低于Col-0，其中OE13-5#的表达量最高，OE21-4#表达量最低，且与Col-0相比均差异显著；AtFLC的表达量与CpFPA的表达量呈负相关。转基因拟南芥中AtSVP基因的表达量与Col-0相比亦显著降低，其中OE5-3#的表达量最高，OE21-4#表达量最低；AtAP1、AtLFY的表达量与Col-0相比均显著升高，其中两者均在OE5-3#中表达量最高，在OE13-5#中表达量最低(图11)。

(5)转基因拟南芥的表型观察

以野生型拟南芥Col-0作为对照，对表达量分别为高、中、低的OE21-4#、OE5-3#、OE13-5#进行表型观察。如图12所示，移栽18d后，OE21-4#已有植株开花，此时OE5-3#有植株抽葶大于1cm，OE13-5#及Col-0尚未抽葶；移栽20d后，OE21-4#已有植株结果荚，此时OE5-3#有植株开始开花，OE13-5#及Col-0尚未抽葶；移栽22d后OE5-3#的植株开始结果荚，OE13-5#抽葶大于1cm，Col-0尚未抽葶；移栽24d后OE13-5#开始开花，Col-0开始抽葶。

从表3中可以得知，三个转基因株系的抽葶时间、第一朵花开时间、第一个果荚时间、现蕾时间均早于Col-0，与其相比差异显著，其中OE5-3#与OE13-5#的现蕾时间并无明显差异；三个转基因株系的茎生叶数均少于Col-0，与其相比都呈现显著差异，其中OE5-3#与OE13-5#之间并无明显差异；OE21-4#、OE5-3#的莲座叶显著少于OE13-5#、Col-0，但是OE13-5#与Col-0相比虽减少但并无显著差异，OE21-4#与OE5-3#相比差异亦不明显。

由以上分析得知，CpFPA基因在拟南芥中表达量越高，其抽葶时间、现蕾时间、第一朵花开时间、第一个果荚时间越早，莲座叶越少，而茎生叶增多。由以上结果表明，CpFPA基因能抑制AtFLC的表达，进而促使植物早花。

表3 CpFPA转基因拟南芥T₂代株系表型相关指标观察

每组数为平均值±标准差；a、b、c、d表示P<0.05水平上差异显著。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 蜡梅CpFPA基因及其编码的蛋白与应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3615

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 1

cctctttctg cgaaactttt ctcttctccc aagcagacct caacctcctc cttacagtct 60

cgaagtttta tttgtttttc ccctcatcct caacagattt ttcctcttca tcttgtccta 120

attgctttca tctgcctatc gatctatttc ccatctccag cctaatattt tagggttctg 180

catttttttt tctgtttttt gcgcaagcaa accctaggaa gccataggga catgccggca 240

tcggatgcaa accttaggaa gccgccggct gggcggaatg agactgaagg cgatgaagac 300

cccccctccc tccaactctg ggttggaaac ctcgcgcccg aaacaaccga tgccgatctc 360

atggctgcct ttgccaagca tggtgctttg ctctgcatca tcatctatgg accgaagaac 420

tttgccttca tctacttcaa gaatctcgac aatgcctgcg ctgccagaaa tgcgctccag 480

ggacatgtgg tctgtggcag acacattaag ataaactttg ctcgcccggc taaacctact 540

aaacatcttc tggtcggtgg tattagttca tctattacca aagaacagct agaacgtgag 600

ttcttgaagt ttggaaagat tgaagaattc aagttcctca gggaacggaa ctgcgctctt 660

gtcaactatc tcaaattaga agatgctgtt atagcattga aaaatatgaa taggaagagt 720

ttaggtggtg aggaaatagg agtagactat ctgagatctc agccttcaca aagagaaaat 780

tggtctgatt tacttgagct gagggatgga cggttcaaca atagaaaaaa tgcaggacct 840

ccagagatgt ggatgccacc agattttcct gaatcttccc agtttgccct gagaaggcat 900

ccgtcatctc aacagtttgg tggccaaagg ggagatagtc aaccaagcaa tatcttatgg 960

attggatatc ctccttctgt tcagattgat gagcagatgc tacataatgc tatgatcttg 1020

tttggtgaaa ttgagcggat caaaagtttc ccttcaagac attattcctt tgtagaattc 1080

agaagtgttg atgaagctcg acgtgctaaa gaaggtctgc aaggtcgtct ttttaatgat 1140

ccgaggatac agataatgtt ttcaagcagt gacttaacac ctggcaagga ctttatggcc 1200

ttttacccag gaattagagg acctagacct gatatgttct ctaacgagcc tccctttaga 1260

ccagggcata tggaattatt tggtcatgct cgtccagttc ctccaaataa atttcctgga 1320

cctgtacctc ctggtggcat gcctcgtcag aatatgttca tgaggccttt tggaccacat 1380

ggttttgatc cctcaattac tggccccgag ttcaatgatg tgccttcttt tctccacaat 1440

cttgcggatg ctaatcgtga caacccaatg gctgctaatt ggaggaggcc atctctcact 1500

gcatcaggta tgctcccttc tcctttgcaa ggaatgcagc cacccagtag gccaatgcat 1560

ggtaggttgg acgagtttga tgtgccccct ttccaaagag agcctaagag gtcaaggatg 1620

gatggttctg tcattggtga catgccttcc aatcataggc agatggatgg tcaaggaact 1680

ggagattcat ttgggttggt gctccatgtc aacaaaggcc catcaggatc acatggaaat 1740

gttcaaagtc aaattcacca aagccctgaa ggtctaagtc gcccaagtat tgaccaccct 1800

gtccctgctg agtgccagga ccttcttgat aatgaccatt gttggcgtgg tgttatagct 1860

aagggtggaa ctcctgtttg tcatgctcga tgtataccca ttgggaaggg gatagactcc 1920

cagcttcctg aaaccgtgaa ttgctcagct agaacagggt tggatgtgct cgcgaaacac 1980

tatgcagagg ctattggttt tgacattgtc ttcttcttac ctgacagtga agaagatttt 2040

gcttcatata cagaatttct gcgttatctg ggtatgaaga atcgtgctgg tgttgcaaaa 2100

tttgatgatg gcactacact gtttttggtt ccaccatcag atttcttaac aaaggttttg 2160

aaagtgcctg gtcctgagcg tctttatggg cttgtcctca aaatgcccca gcaaccacca 2220

agtgtaaatt tgcatcaacc tcaacagctt cagcagccgc tccttgcacc acgttacatt 2280

gacagacagg agtttcttcc tccacaaact gactacaatt cagttcctga aagggaggat 2340

caaggtttgc aaatggacta caataggggc tcacatgagg gctcacttcc tcattcaggt 2400

ggtgtgaagc caccactagc ccatcccgat ggatcacatc ctatgccacc tgcatcttca 2460

gattatgtta ctaatagggc agttcctccc caatctgggg tttcattaac acccgagtta 2520

attgctactt tagctgctct aattcctacc aacactcaat ctccatcctc aaactctggg 2580

cagctatcat tgagtgcttc tgtaaggcca gcatcaatct ctgcttctgt gacacctgac 2640

aaagtgatgc cgtcacaggg ctggagacag gaaaatcaag cagtggtttc tggcagtttc 2700

cataatgtaa aatcagagga agcaaatcat ccatctcagc agttaggcca tgaacacaat 2760

aatcaggctg cactttattc tcaatttaca acttatgcaa atgtttctaa caggacagag 2820

aactctgcac aagccatcct tggtggttca caagttcatg atccttctct gaacattcag 2880

caggccactg tgactactaa accaatgcat gactttggga taccatccca aggtgggctg 2940

tatacagcat cccatgccaa tcaactttat cagtttgatg cttctcaaaa tccacaaaac 3000

tatggtgcat tgcatgctac agatgctgct gctggagtat tccaaccatt gaccttttct 3060

caaccaaagc ctgttgcacc tcaggttcag agtggtggta tattccaacc acaaatgggc 3120

gtgcccttag caactgataa ggtaaacaca gagttcccaa atcaagtgca acttcggtct 3180

cctatcattg cttcttctgg tcagggcatg tcagagagtg attcaaacca aaagttccaa 3240

tcaaccctac aacttgctca cagtcttctc ctccagttac aacagcaacc aaatgctcaa 3300

ggtttgcatg gctctagtaa tcagcaatag gaaacattca agaccagtgt accaggtggg 3360

gtgaatttgc tgcagagaga cagaaacaga gggatgcaat ttcaaatttg caagtaggaa 3420

atttctcatc cagtggagtt tttctccctt ttttttaatt ttttttttgt cccagcttag 3480

ttgatcggat tcatgagtat ctagcctgga cccgagtggt gagttgggtt tataccatct 3540

tcgaaccgaa ttgcgatttc attaatatat gctcgaactg gttatttctg gtcagtgaac 3600

atggaaagat gttgt 3615

<210> 2

<211> 1032

<212> PRT

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 2

Met Pro Ala Ser Asp Ala Asn Leu Arg Lys Pro Pro Ala Gly Arg Asn

1 5 10 15

Glu Thr Glu Gly Asp Glu Asp Pro Pro Ser Leu Gln Leu Trp Val Gly

20 25 30

Asn Leu Ala Pro Glu Thr Thr Asp Ala Asp Leu Met Ala Ala Phe Ala

35 40 45

Lys His Gly Ala Leu Leu Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Pro Lys Asn Phe

50 55 60

Ala Phe Ile Tyr Phe Lys Asn Leu Asp Asn Ala Cys Ala Ala Arg Asn

65 70 75 80

Ala Leu Gln Gly His Val Val Cys Gly Arg His Ile Lys Ile Asn Phe

85 90 95

Ala Arg Pro Ala Lys Pro Thr Lys His Leu Leu Val Gly Gly Ile Ser

100 105 110

Ser Ser Ile Thr Lys Glu Gln Leu Glu Arg Glu Phe Leu Lys Phe Gly

115 120 125

Lys Ile Glu Glu Phe Lys Phe Leu Arg Glu Arg Asn Cys Ala Leu Val

130 135 140

Asn Tyr Leu Lys Leu Glu Asp Ala Val Ile Ala Leu Lys Asn Met Asn

145 150 155 160

Arg Lys Ser Leu Gly Gly Glu Glu Ile Gly Val Asp Tyr Leu Arg Ser

165 170 175

Gln Pro Ser Gln Arg Glu Asn Trp Ser Asp Leu Leu Glu Leu Arg Asp

180 185 190

Gly Arg Phe Asn Asn Arg Lys Asn Ala Gly Pro Pro Glu Met Trp Met

195 200 205

Pro Pro Asp Phe Pro Glu Ser Ser Gln Phe Ala Leu Arg Arg His Pro

210 215 220

Ser Ser Gln Gln Phe Gly Gly Gln Arg Gly Asp Ser Gln Pro Ser Asn

225 230 235 240

Ile Leu Trp Ile Gly Tyr Pro Pro Ser Val Gln Ile Asp Glu Gln Met

245 250 255

Leu His Asn Ala Met Ile Leu Phe Gly Glu Ile Glu Arg Ile Lys Ser

260 265 270

Phe Pro Ser Arg His Tyr Ser Phe Val Glu Phe Arg Ser Val Asp Glu

275 280 285

Ala Arg Arg Ala Lys Glu Gly Leu Gln Gly Arg Leu Phe Asn Asp Pro

290 295 300

Arg Ile Gln Ile Met Phe Ser Ser Ser Asp Leu Thr Pro Gly Lys Asp

305 310 315 320

Phe Met Ala Phe Tyr Pro Gly Ile Arg Gly Pro Arg Pro Asp Met Phe

325 330 335

Ser Asn Glu Pro Pro Phe Arg Pro Gly His Met Glu Leu Phe Gly His

340 345 350

Ala Arg Pro Val Pro Pro Asn Lys Phe Pro Gly Pro Val Pro Pro Gly

355 360 365

Gly Met Pro Arg Gln Asn Met Phe Met Arg Pro Phe Gly Pro His Gly

370 375 380

Phe Asp Pro Ser Ile Thr Gly Pro Glu Phe Asn Asp Val Pro Ser Phe

385 390 395 400

Leu His Asn Leu Ala Asp Ala Asn Arg Asp Asn Pro Met Ala Ala Asn

405 410 415

Trp Arg Arg Pro Ser Leu Thr Ala Ser Gly Met Leu Pro Ser Pro Leu

420 425 430

Gln Gly Met Gln Pro Pro Ser Arg Pro Met His Gly Arg Leu Asp Glu

435 440 445

Phe Asp Val Pro Pro Phe Gln Arg Glu Pro Lys Arg Ser Arg Met Asp

450 455 460

Gly Ser Val Ile Gly Asp Met Pro Ser Asn His Arg Gln Met Asp Gly

465 470 475 480

Gln Gly Thr Gly Asp Ser Phe Gly Leu Val Leu His Val Asn Lys Gly

485 490 495

Pro Ser Gly Ser His Gly Asn Val Gln Ser Gln Ile His Gln Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Leu Ser Arg Pro Ser Ile Asp His Pro Val Pro Ala Glu Cys

515 520 525

Gln Asp Leu Leu Asp Asn Asp His Cys Trp Arg Gly Val Ile Ala Lys

530 535 540

Gly Gly Thr Pro Val Cys His Ala Arg Cys Ile Pro Ile Gly Lys Gly

545 550 555 560

Ile Asp Ser Gln Leu Pro Glu Thr Val Asn Cys Ser Ala Arg Thr Gly

565 570 575

Leu Asp Val Leu Ala Lys His Tyr Ala Glu Ala Ile Gly Phe Asp Ile

580 585 590

Val Phe Phe Leu Pro Asp Ser Glu Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Thr Glu

595 600 605

Phe Leu Arg Tyr Leu Gly Met Lys Asn Arg Ala Gly Val Ala Lys Phe

610 615 620

Asp Asp Gly Thr Thr Leu Phe Leu Val Pro Pro Ser Asp Phe Leu Thr

625 630 635 640

Lys Val Leu Lys Val Pro Gly Pro Glu Arg Leu Tyr Gly Leu Val Leu

645 650 655

Lys Met Pro Gln Gln Pro Pro Ser Val Asn Leu His Gln Pro Gln Gln

660 665 670

Leu Gln Gln Pro Leu Leu Ala Pro Arg Tyr Ile Asp Arg Gln Glu Phe

675 680 685

Leu Pro Pro Gln Thr Asp Tyr Asn Ser Val Pro Glu Arg Glu Asp Gln

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Gly Leu Gln Met Asp Tyr Asn Arg Gly Ser His Glu Gly Ser Leu Pro

705 710 715 720

His Ser Gly Gly Val Lys Pro Pro Leu Ala His Pro Asp Gly Ser His

725 730 735

Pro Met Pro Pro Ala Ser Ser Asp Tyr Val Thr Asn Arg Ala Val Pro

740 745 750

Pro Gln Ser Gly Val Ser Leu Thr Pro Glu Leu Ile Ala Thr Leu Ala

755 760 765

Ala Leu Ile Pro Thr Asn Thr Gln Ser Pro Ser Ser Asn Ser Gly Gln

770 775 780

Leu Ser Leu Ser Ala Ser Val Arg Pro Ala Ser Ile Ser Ala Ser Val

785 790 795 800

Thr Pro Asp Lys Val Met Pro Ser Gln Gly Trp Arg Gln Glu Asn Gln

805 810 815

Ala Val Val Ser Gly Ser Phe His Asn Val Lys Ser Glu Glu Ala Asn

820 825 830

His Pro Ser Gln Gln Leu Gly His Glu His Asn Asn Gln Ala Ala Leu

835 840 845

Tyr Ser Gln Phe Thr Thr Tyr Ala Asn Val Ser Asn Arg Thr Glu Asn

850 855 860

Ser Ala Gln Ala Ile Leu Gly Gly Ser Gln Val His Asp Pro Ser Leu

865 870 875 880

Asn Ile Gln Gln Ala Thr Val Thr Thr Lys Pro Met His Asp Phe Gly

885 890 895

Ile Pro Ser Gln Gly Gly Leu Tyr Thr Ala Ser His Ala Asn Gln Leu

900 905 910

Tyr Gln Phe Asp Ala Ser Gln Asn Pro Gln Asn Tyr Gly Ala Leu His

915 920 925

Ala Thr Asp Ala Ala Ala Gly Val Phe Gln Pro Leu Thr Phe Ser Gln

930 935 940

Pro Lys Pro Val Ala Pro Gln Val Gln Ser Gly Gly Ile Phe Gln Pro

945 950 955 960

Gln Met Gly Val Pro Leu Ala Thr Asp Lys Val Asn Thr Glu Phe Pro

965 970 975

Asn Gln Val Gln Leu Arg Ser Pro Ile Ile Ala Ser Ser Gly Gln Gly

980 985 990

Met Ser Glu Ser Asp Ser Asn Gln Lys Phe Gln Ser Thr Leu Gln Leu

995 1000 1005

Ala His Ser Leu Leu Leu Gln Leu Gln Gln Gln Pro Asn Ala Gln Gly

1010 1015 1020

Leu His Gly Ser Ser Asn Gln Gln

1025 1030

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 3

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<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 4

ctattgctga ttactagagc ca 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 5

atggtaggtt ggacgagttt g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 6

agggacaggg tggtcaatac tt 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 7

gttatggttg ggatgggaca gaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 8

gggcttcagt aaggaaacag ga 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 9

tagtgacaag acagtaggtg gaggt 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 10

gtaggttcca gtcctcactt catc 24

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 11

ggggtaccta ggaagccata gggacatgc 29

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 蜡梅(Chimonanthus praecox)

<400> 12

gctctagact attgctgatt actagagcca 30

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 13

agccaagaag accgaactca 20

<210> 14

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<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

tttgtccagc aggtgacatc 20

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<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

tagggctcaa caggagcagt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 16

cagccaaggt tgcagttgta 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 17

ctctatttgg tatgttccaa caaag 25

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 18

ctaataccgc caactaaagc c 21

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 19

tcaagaaagc tgaagaactc tccgt 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 20

ctttgactgc aagttatgcc tctct 25

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 21

cttcgtcttc cacttcag 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 22

atcataccag tctcaacac 19

Claims

1.蜡梅CpFPA蛋白，其为由SEQ ID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述的蜡梅CpFPA蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

6.权利要求2或3所述基因在调控植物花期中的用途，其特征在于，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，使所述植物提前开花。

7.一种使植物提前开花的方法，其为将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，并在转基因植株中超量表达。