KR100647793B1 - Ｅｃｌ1 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개화시기 조절 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 애기장대 유래의 ECL1 유전자를 식물체 내에 도입하여 과다 발현시켜 식물의 조기 개화를 유도하거나, ECL1 유전자의 발현을 억제하여 식물의 개화시기를 지연시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 ECL1 유전자는 식물의 개화시기 조절유전자의 탐색 등에 유용하게 이용될 수 있고, 식물의 개화시기를 촉진시켜 꽃과 종자의 생산 효율을 증가시킬 수 있다. 또한 ECL1 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 지연시켜 식물체로부터 잎이나 줄기와 같은 유용한 부분의 생산량을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

개화시기 조절, ECL1 유전자, 애기장대

Description

ＥＣＬ1 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법{Method for controlling flowering time of plant using ECL1 gene}

도 1은 장일조건하에서 재배한 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대의 개화시기를 비교한 그래프이다.

도 2는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대의 상전이(phase transition)를 비교한 그래프이다.

도 3은 ecl1 -1D 돌연변이체의 게놈 내로 삽입된 T-DNA의 삽입 위치를 나타낸 모식도이다.

도 4는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에서 ECL1 유전자의 발현 정도를 RT-PCR로 분석한 결과이며 UBQ10은 대조군(internal control) 이다.　

도 5a는 장일조건하에서 재배한 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대의 사진이다.

도 5b는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대의 잎 표면을 전자 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5c는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대의 잎의 단면을 전자 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5d는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에서 AG 와 CLF의 발현 정도를 날짜별로 나타낸 그래프이다.

도 6a는 장일조건(LD)과 단일조건(SD)에서 자란 야생형 애기장대에서 ECL1 유전자의 발현 정도를 비교한 그래프이다.

도 6b는 장일조건(LD)과 단일조건(SD)에서 자란 야생형 애기장대에서 ECL1 유전자의 발현 정도를 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과이다.

도 7은 ECL1 유전자의 기능이 손실된 ecl -3 돌연변이체와 야생형 애기장대의 개화시기를 비교한 그래프이다.

도 8는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에서 개화시기 조절 유전자들의 발현 정도를 마이크로 어레이로 비교 분석한 결과이다(A: 야생형보다 돌연변이체에서 발현이 증가된 유전자들을 나타낸 것이고, B: 야생형보다 돌연변이체에서 발현이 감소된 유전자들을 나타낸 것이다).

도 9a는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에서 광주기 경로 유전자들의 시간에 따른 발현 정도를 RT-PCR을 이용하여 비교 분석한 결과이며, UBQ10은 대조군(internal control) 이다.

도 9b는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에서 GA 경로 유전자들의 시간에 따른 발현 정도를 RT-PCR을 이용하여 비교 분석한 결과이며, UBQ10은 대조군(internal control) 이다.

도 9c는 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에서 자발적 경로 유전자인 FLC의 시간에 따른 발현 정도를 RT-PCR을 이용하여 비교 분석한 결과이며, UBQ10은 대조군(internal control) 이다.　

도 10a는 FT 유전자와 GUS 유전자 융합 구조물이 도입된 ecl1 -1D 돌연변이체 야생형 애기장대에서 시간의 경과에 따른 pFT :: GUS 의 발현을 비교한 사진이다.

도 10b는 FLC 유전자와 GUS 유전자 융합 구조물이 도입된 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에서 시간의 경과에 따른 pFLC :: GUS 의 발현을 비교한 사진이다.　

도 10c는 FT　유전자와 GUS 유전자 융합 구조물이 도입된 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대의 줄기정단 분열세포에서 pFT :: GUS 의 발현을 전자 현미경으로 분석한 사진이다.　　

도 10d는 FLC 유전자와 GUS 유전자 융합 구조물이 도입된 ecl1 -1D 돌연변이체와 야생형 애기장대에의 줄기정단 분열세포에서 pFLC :: GUS 의 발현을 전자 현미경으로 분석한 사진이다.

도 11는 본 발명의 ECL1 유전자와 식물의 개화조절 유전자들과의 상호 관련성을 나타낸 모식도이다. 화살표는 촉진 작용을 의미하며, T자 형태의 막대는 억제 작용을 의미한다.

본 발명은 ECL1 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 애기장대 유래의 ECL1 유전자를 포함하는 벡터를 식물체 내에 도입하여 과다 발현시킴으로써 식물의 개화시기를 촉진시키거나, ECL1 유전자의 발현을 억제하여 식물의 개화시기를 지연시키는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 개화 식물에 있어서, 개화시기 조절은 식물체의 일생을 통틀어 가장 중요한 일 중의 하나로, 기온과 빛 등의 환경적인 인자와 식물체의 나이 등에 의해 좌우되며 식물체가 가지고 있는 유전적인 특성 등에 따라 매우 많은 단백질들의 상호 결합과 신호의 전달로 이루어진다. 따라서 대부분의 식물은 개화가 적합한 시기에 일어나도록 개화시기를 조절할 수 있는 메커니즘을 가지고 있으며, 이러한 개화시기 조절 메커니즘은 식물체 내부의 유전적 요인과 외부의 환경 요소에 의해 영향을 받는다(Lang A., Encyclopedia of Plant Physiology, Springer-Verlag, 1371-1536, 1965; Napp-Zinn K., In Manipulation of Flowering, London, Buttrworth, 123-132, 1987; Poethig R. S., Science, 250: 923-930, 1990).

최근 들어, 식물의 개화시기 조절 메커니즘에 대한 연구가 여러 유전적, 분자생물학적 접근 방법을 통해 애기장대를 대상으로 활발히 이루어지고 있다.　 그 결과, 애기장대에서 네 종류의 개화시기 조절 경로가 밝혀졌다 (Simpson et al., Annu . Rev. Cell Dev . Biol . 15, 519-550, 1999; Araki T., Curr . Opin . Plant Biol . 4, 6368, 2001).　 첫 번째는 광주기 의존 경로 또는 장일 경로라고 불리우는 경로 (photoperiod dependent pathway, or long day pathway)로서 이 경로에 관여하는 유전자로는 피토크롬 (phytochrome)이나 크립토크롬 (cryptochrome)과 같은 광수용체를 암호화하는 유전자들과 GI(GIGENTEA), CO(CONSTANS), FT(Flowering locus T), FWA(Flowering Wageningen), SOC1(Suppress or of CO overexpression 1; AGL20) 등이 알려져 있다(Yaron Y. et al., The Plant Cell, 10:1973-1989, 1998). 두 번째는 온도에 의한 개화조절 경로(vernalization pathway)로서, 식물이 장시간 저온에 노출되었을 때 개화가 촉진되는 경로이며 이 경로와 관련된 유전자로서 VRN1(Reduced Vernalization Response 1), VRN2(Reduced Vernalization Response 2), FRI(Frigida), FLC(Flowering locus C) 등의 유전자가 클로닝 되었다.　 세 번째는 장일조건이나 단일조건에 모두 영향을 미치며 개화를 조절하는 자발적 경로(autonomous pathway)로서 FCA(Flowering locus CA), FVE, LD(Luminidepedens)와 같은 유전자들이 이 경로에 관여하고 있다(Yaron Y. et al., The Plant Cell, 10:1973-1989, 1998).　 마지막으로 주로 단일조건에서 영향을 미치는 경로이며 여기에는 식물호르몬의 일종인 GA(gibberellic acid)가 필수적인 역할을 하는 지베렐린 경로가 있다.　 이 경로에는 GA1이나 GAI(GA Insensitive), RGA(Repressor of ga1 -3) 등의 유전자들이 관여하고 있는 것으로 보고되어 있으며, 주로 GA 호르몬의 생합성에 관여하는 유전자나 GA 호르몬의 신호전달에 관여하는 유전자들이 이 경로에 참여하고 있다(Araki T., Curr . Opin . Plant Biol., 4: 6368, 2001).

이와 같이 규명된 식물의 개화시기 조절과 관련된 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 인위적으로 조절하고자 하는 시도가 이루어지고 있다.　 식물의 개화시기를 인위적으로 조절하는 것은 학문적으로나 농업 및 원예 분야와 같은 산업적인 측면에서 매우 중요한 의미를 갖는다. 특히 산업적인 측면으로는 원예작물의 개화시기를 촉진함으로써 꽃과 종자의 생산을 단시간 내에 생산할 수 있으며, 농작물의 개화시기를 지연시켜 영양생장을 지속적으로 유도함으로써 농작물로부터 유용한 부분의 생산량을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

현재까지 개발된 개화시기 조절과 관련된 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 인위적으로 조절하고자 하는 기술들로는, 대한민국특허 제319395호에는 애기장대의 생체시계 및 개화시기 조절 유전자 자이겐티아(GIGANTEA)가 개시되어 있고, 대한민국특허 제0519049호에는 bCIP1 단백질과 이를 암호화하는 DNA를 이용하여 식물체의 개화시기를 조절하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국특허 제0510959호에는 식물의 개화시기 조절 유전자인 COG를 이용한 식물의 조기 개화를 유도하는 방법이 개시되어 있다.

그러나 식물의 개화시기 조절은 상당히 복잡한 과정을 통해 일어나며 아직까지 완전히 규명되지 않은 다양한 유전자가 관여할 것으로 생각되고 있기 때문에, 식물의 개화시기 조절에 관여하는 새로운 유전자 및 그 기능에 대한 연구가 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 애기장대로부터 새로운 개화시기 조절 메커니즘과 관련이 있는 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 연구하던 중, ECL1 유전자가 식물의 개화시기를 조절할 수 있는 활성이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 ECL1 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법, 개화시기가 조절되는 형질전환 식물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 식물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 ECL1 단백질의 활성 또는 발현을 조절하는 화합물을 탐색하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 ECL1 유전자를 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ECL1 유전자를 이용하여 개화시기가 조절되는 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 개화시기가 조절되는 형질전환 식물을 제공하는 것이다.　

나아가 본 발명은 ECL1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 접촉시킨 다음 ECL1 단백질의 활성 또는 발현에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 ECL1 단백질의 활성 또는 발현을 촉진 또는 억제하는 화합물을 탐색하는 방법을 제공한다.

　　　　　　

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.　

본 발명에서는 식물의 개화시기를 조절하는 유전자를 탐색하기 위하여 애기장대에 활성화 표지 선별법(activation tagging screen)을 이용하여 개화시기가 촉진된 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하였다. 본 발명에서 사용한 활성화 표지 선별법은 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터 인핸서 서열이 비교적 멀리 떨어져 있는 상태에서도 주변 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다는 점을 이용하여 기능 획득 돌연변이체를 얻는 공지된 방법이다(Weigel et al., Plant Physiology, 122: 1003-1013, 2000). 따라서 본 발명에서는 35S 프로모터 인핸서가 포함된 T-DNA를 식물체내로 삽입시켜 돌연변이를 유도한 다음, 성장한 개체들 중에서 육안으로 조기 개화된 개체를 선별하고 이를 'ecl1 -1D' 라고 명명하였다. 이후, 상기 선발된 돌연변이체의 조기개화 형질을 확인하기 위해 야생형 애기장대와 개화시기를 비교하였다. 그 결과, 야생형은 15장에 개화를 보이는데 비해 ecl1 -1D 돌연변이체는 6.4장에 개화를 보이는 것을 확인하였고(도 1 참조), 이는 개화 촉진자로 알려진 SOC1 및 CO에 의한 식물의 개화가 각각　6.8장 및 7.5장인 것으로 볼 때, 본 발명의 돌연변이체의 조기개화는 매우 빠른 것임을 알 수 있었다. 또한 식물의 개 화는 식물의 성장을 영양생장(vegetative growth)에서 생식생장(reproductive growth)시기로 전환시키는 상전이(phase transition)를 야기하는데 야생형과 돌연변이체의 상전이를 비교한 결과, 어덜트 영양 단계(adult　 vegetative phase)에서 야생형은 5.5장을 보였고 돌연변이체는 0.3장을 보여　 매우 큰 차이를 나타냈다(도 2 참조). 따라서 상기 ecl1 -1D 돌연변이체의 조기개화의 주요 요인은 어덜트 영양 단계(adult　 vegetative phase)가 짧아졌기 때문인 것을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 개화가 촉진된 돌연변이체에서 인핸서에 의해 활성화된 T-DNA 주변의 유전자를 탐색하기 위하여 TAIL PCR 및 플라스미드 회수 방법을 이용하여 35S 인핸서가 포함된 T-DNA가 삽입된 게놈 DNA를 분리하고, 그 염기서열을 결정하였다(실시예 3 참조). 분리된 유전자는 애기장대의 2번 염색체에 있는 AT2g45650 유전자이었고, 상기 유전자와 진뱅크 상의 공지된 다른 유전자와의 서열 상동성을 조사한 결과, 본 발명의 유전자는 난초의 OMADSI 유전자와 57%의 상동성을 보였다.

상기 AT2g45650 유전자는 애기장대로부터 분리된 기능이 알려져 있지 않은 공지된 유전자로 본 발명자들은 상기 AT2g45650 유전자를 ‘ ECL1 ’ 이라고 새롭게 명명하였다.　

　　　　

이에 본 발명자들은 상기 ECL1 유전자의 기능을 규명하기 위하여 개화가 촉 진된 돌연변이체로부터 분리한 총 RNA를 주형으로 하고 공지된 염기서열(GenBank accession no: At2g45650)을 토대로 디자인한 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행함으로써 ECL1 유전자의 cDNA를 제조하였다(실시예 4 참조).　 상기 ECL1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2에 각각 나타낸 바와 같다.

본 발명자들은 상기 ECL1 유전자의 특성을 조사하기 위하여 야생형 및 ecl1 -1D 돌연변이체에서 상기 유전자의 발현 패턴을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다.　 그 결과, 상기 ECL1 유전자가 조기 개화된 ecl1 -1D 돌연변이체에서 과다 발현됨을 알 수 있었다(도 4 참조).　　 따라서 상기 유전자는 식물체에 있어서　개화를 촉진하는 기능을 가지고 있을 것으로 추정되었다.

또한, 상기 ecl1 -1D 돌연변이체의 표현형을 야생형과 비교한 결과, ecl1 -1D 돌연변이체는 야생형과는 달리 향축(adaxial)면으로 잎이 말려져 있었다(도 5a 참조).　 야생형과 ecl1 -1D 돌연변이체에서 과다발현 시 잎이 말리는 현상이 나타나는 것으로 알려진 AG 유전자의 발현을 비교한 결과, 야생형보다 돌연변이체에서의 AG 유전자의 발현이 증가되었음을 확인하였다(도 5d 참조).　 또한, 잎이 말린 돌연변이체의 상피세포층을 전자현미경으로 확인한 결과, 야생형에 비해 돌연변이체의 상층 상피세포층은 세포모양이 구형이었고 하층 상피세포층은 상층 상피세포층에 비해 세포수가 적으나 세포의 크기가 큼을 확인하였다(도 5b 및 5d 참조).

따라서 AG 유전자의 과다 발현 및 하층 상피세포층의 세포크기가 돌연변이체 의 잎이 말리는 표현형을 보이는 원인으로 추정할 수 있었다.

　　

본 발명의 ECL1 유전자의 발현에 있어서 식물의 조직, 즉, 식물의 끝(apex), 배축(hypocotyl), 잎(leaves) 및 뿌리(root)에서의 발현 정도를 확인하였는데, 본 발명의 ECL1 유전자는 식물의 잎과 뿌리에서 보다 끝 및 배축에서 더 많이 발현되고 있었고, 특히, 줄기정단 분열세포를 포함하는 끝부분에서 많이 발현되는 것으로 보아 본 발명의 ECL1 유전자가 줄기 정단 분열세포에서 개화시기를 조절하고 있음을 알 수 있었다(결과 미도시). 또한, 세포내에서의　ECL1 단백질의 위치를 확인한 결과, 세포의 핵에 존재하고 있음을 확인하였다(결과 미도시). 따라서 ECL1 단백질이 핵에 존재하면서 식물의 개화시기 조절 유전자들의 발현 등에 영향을 미칠 수 있음을 예측할 수 있었다.　　　　

애기장대에서는 개화시기 조절과 관련된 네 종류의 개화시기 조절 경로, 즉, 광주기 의존경로, 온도에 의한 조절경로, 자발적 경로 및 지베렐린(GA) 경로가 밝혀졌는데, 본 발명의 ECL1 유전자가 상기 4가지의 개화시기 조절 경로 중 어떤 경로에 관여하고 있는지 확인한 결과, 광주기 의존 경로에 관여하고 있음을 확인하였다(실시예 6 참조). 이는 야생형 애기장대를 장일조건 및 단일조건으로 배양 후　ECL1 유전자의 발현 정도를 측정하였는데 장일조건하에서 훨씬 높은 발현을 보였다(도 6a 및 6b 참조). 그러나 개화시기를 조절하는 다른 유전학적인 경로인 춘화 처리에 대한 반응, 지베렐린(GA) 처리에 대한 반응, 온도에 대한 반응 및 광질에 대한 반응 조사에서는 ECL1 유전자의 발현 정도가 아무런 영향을 받지 않았다(결과 미도시).

본 발명자들은 ECL1 유전자의 과다 발현이 조기개화를 유도한다는 것을 재확인하기 위하여 ECL1 유전자의 기능이 손실된 돌연변이체인 ecl-3를 이용하여 야생형과의 개화시기를 비교 분석하였다(실시예 7 참조). 그 결과, 상기 ecl-3 돌연변이체의 개화시기는 22.5장에 개화하였고, 야생형은 18장에 개화하였다(도 7 참조). 따라서 본 발명의 ECL1 유전자의 기능 손실이 식물의 개화를 지연시킨다는 것을 확인함으로써 상기 ECL1 유전자가 개화를 촉진하는 유전자임을 재확인하였다.

　　　　　　　　

또한, 본 발명자들은 ECL1　유전자와 공지된 다른 식물의 개화시기를 조절하는 유전자들과의 상호 관련성을 조사하고자, 야생형 및 ecl1 -1D 돌연변이체에서 어피매트릭스 유전자칩(Affmetrix genechip)을 이용하여 마이크로 어레이 분석을 수행하였다(실시예 8 참조). 그 결과, ecl1 -1D 돌연변이체에서 조기개화를 촉진한다고 알려진 FT 및 AP1 유전자의 발현이 증가된 것으로 나타났고, 개화 억제 유전자로 알려진 FLC 및 MAF2 유전자의 발현은 감소된 것으로 나타났다(도 8 참조). 또한, RT-PCR을 이용하여 야생형 및 ecl1 -1D 돌연변이체에서 광주기 경로 유전자들이라고 알려진 SOC1 , FT, CO, AP1 , GII 및 TFL1 유전자와 GA 경로 유전자들이라고 알려진 SPY 및 GAI 유전자 및 자발적 경로 유전자라고 알려진 FLC 유전자의 발현 양상을 비교 분석하였다. 그 결과, 광주기 경로 유전자인 FT 및 AP1 유전자의 발현은 야생형에 비해 돌연변이체에서 현저하게 증가된 것으로 나타났고(도 9a 참조), GA 경로 유전자들의 발현은 야생형과 거의 유사한 것으로 나타났다(도 9b 참조). 반면, 자발적 경로의 FLC 유전자의 발현은 ecl1 -1D 돌연변이체에서 야생형에 비해 감소한 것으로 나타났다(도 9c 참조). 이는 FLC 유전자의 발현이 FT 의 발현을 억제한다고 보고된 바 있어 본 발명의 ECL1　유전자가 자발적 경로의 FLC 유전자의 발현을 감소시켜 FT의 발현을 촉진시키는 것임을 추정할 수　있었다.　 따라서 상기 ECL1　유전자가 FLC 유전자의 발현을 감소시켜 FT의 발현을 촉진시키는지 확인하기 위하여, FT　유전자의 프로모터 부분과 GUS(beta-glucuronidase) 유전자가 융합된 핵산 구조물을 작제하고 이를 포함하는 발현벡터로 애기장대를 형질 전환한 다음 GUS 유전자 활성을 분석하였다(실시예 <8-3> 참조).　 그 결과,　야생형의 줄기정단 분열세포에서 볼 수 없었던 pFT ::GUS의 발현이 ecl1 -1D pFT::GUS 식물체에서는 줄기정단 분열세포에서 분명하게 발현되는 것을 확인하였다(도 10a 및 10c 참조).

따라서 ECL1 유전자가 줄기정단 분열세포에서 FT의 발현을 유도하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, pFLC ::GUS 분석결과, pFLC ::GUS의 발현은 야생형에 비해 ecl1 -1D pFLC ::GUS 식물체에서 감소하는 것으로 나타났다(도 10b 및 10d 참조). 따라서 본 발명의 ECL1 유전자가 줄기정단 분열세포에서 FLC의 발현을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다.　　　　 　　 　

이에 본 발명은 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다. 보다 구체적 으로, 본 발명은 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 식물체에서 과다 발현시킴으로써 식물의 개화시기를 촉진시키거나 또는 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제시킴으로써 식물의 개화시기를 지연시키는 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 제공한다.

　　　　　　　　

식물체에서 ECL1 유전자를 과다 발현시키는 방법으로는 ECL1 유전자를 포함하고 있는 식물체 또는 ECL1 유전자를 포함하고 있지 않은 식물체 내로 ECL1 유전자를 도입함으로써 수행될 수 있다.　 상기에서 "유전자의 과다발현"이란 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상으로 ECL1 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다. 식물체내로 ECL1 유전자를 도입하는 방법으로는 프로모터의 조절을 받는 ECL1 유전자가 포함된 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환 하는 방법이 있다. 상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 과다 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.　 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들 수 있다.　 또한, 단자엽 식물이나 목본식물체에서 ECL1 유전자를 과다발현하기 위해서는 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터를 사용할 수 있다.

　　　　　　　　

애기장대의 개화시기 조절 경로 중 광주기 경로에 관여하는 개화촉진 유전자인 FT 유전자가 알려져 있고(Kardailsky et al., Science 286:1962-196, 1999), 상 기 FT 유전자의 과다발현체는 조기 개화와 조기 열매 맺음이 보고 된 바 있다(Endo T et al., Transgenic research 14:703-712, 2005). 따라서 상기 FT 유전자의 과다발현체는 과일의 수확시기를 단축시키고 수확량을 증진시키는데 이용할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 식물의 개화시기 조절 방법은 식물체 내에서 ECL1 유전자를 과다 발현시켜 개화시기를 촉진함으로써 단시간 내에 식물의 꽃과 종자를 생산하여 효율을 증대시키는데 적용될 수 있다.

　　　　　　　　

식물체에서 ECL1 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 이용할 수 있다.　 상기 "유전자의 발현 억제"에는 유전자 전사의 억제 및 단백질로의 번역 억제가 포함된다. 또한, 유전자 발현이 완전히 정지된 것 뿐만아니라 발현이 감소된 것도 포함된다.

식물에서 특정의 내재성 유전자의 발현을 억제하는 방법으로는 상기 유전자를 결손 시키거나 또는 상기 유전자에 대한 안티센스 분자를 이용하는 것이 가장 보편적이다. 상기 안티센스 분자란 표적 유전자가 기능하지 못하도록 그와 반대되는 염기서열이 mRNA에 선택적으로 결합하여 유전정보의 흐름을 차단하는 분자를 말한다. 안티센스 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 폴리머라제에 의해 국부적인 개상 루프 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA에서 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, 인트론과 엑손과의 접합접에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소좀 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 번역 개시인자 결합 부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제 등이 있다.　 이들은 전사, 스플라이싱 또는 번역 과정을 저해하여 표적 유전자의 발현을 억제한다.

본 발명에 사용할 수 있는 안티센스 분자는 상기의 어느 작용으로든지 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다.　 대표적인 안티센스 분자로는 3중제, 리보자임(ribozyme), RNAi, 또는 안티센스 핵산 등이 포함된다.　 3중제는 이중 나선 DNA 주변을 감아 3 본쇄 나선을 형성하도록 함으로써 전사 개시가 억제되도록 한다(Maher　 et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991).

리보자임은 1 본쇄 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 보유한 RNA 효소이다.　 리보자임은 표적 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 부위특이적으로 절단시킴으로써 표적 유전자의 단백질 발현을 억제한다(Cech, J. Amer . Med . Assn., 260:3030, 1998; Sarver et al., Science 247:1222-1225, 1990).

RNAi(RNA interference)는 염기서열 특이적으로 작용하는 헤어핀 형태의 소분자의 RNA를 사용하여 전사 수준 혹은 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제시키는 방법이다(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000).　 상기 RNAi 방법에 사용되는 소분자 RNA는 표적 유전자와 상동성을 가지는 이중가닥 RNA 분자이다.

안티센스 핵산은 표적 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자를 말한다(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990).　 세포 내에서, 안티센스 핵산은 이에 상응하는 mRNA와 혼성화되어 2본쇄 분자를 형성함으로써 표적 유전자의 mRNA 해독을 저해하여 단백질 발현을 억제한다(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988).

상기 안티센스 핵산은 특히 본 발명의 ECL1 유전자의 발현을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 안티센스 핵산을 사용할 수 있다. 　

　　　　　　　　

애기장대의 GI 유전자는 식물의 광주기 개화조절, 24시간 주기리듬의 조절 및 피토크롬 신호전달의 조절에 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 있다(Park DH et al.,　 Science 285:1579-1582, 1999; Fowler et al., EMBO 　 18:4679-4688, 1999; Huq et al.,　 Proc Natl Acad Sci　 97:9789-979, 2000). 이러한 GI 유전자의 발현이 억제된 돌연변이체는 광주기 개화조절 및 24시간 주기리듬의 조절에 혼란을 초래하게 되어 장일조건하에서 만기개화를 보인다(Koornneef M et al.,　 Mol Gen Genet 229, 57-66, 1991). 또한, 안티센스 GI cDNA 단편을 이용하여 무우 (radish)에서 GI 유전자의 발현을 억제시킨 결과, 식물의 꽃줄기를 내는 과정인 추대 및 개화가 지연되는 것으로 나타났다. 따라서 상기 GI 유전자의 발현 억제를 통하여 작물의 수확시기를 연장시켜 수확량을 증진시킬 수 있다는 내용이 보고 된 바 있다(Curtis et al.,　 Transgenic Research 11, 249-256, 2002).

그러므로 본 발명에 따른 식물체 내에서 ECL1 유전자의 발현을 억제하는 방법은 식물의 개화시기를 지연시켜 식물체로부터 잎이나 줄기와 같은 유용한 부분의 생산량을 증대시키는데 적용될 수 있다.

상기 ECL1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.　 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의, 바람직하게는 80%, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.　 "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 과다발현시 식물의 조기 개화를 촉진하거나, 식물체 내에서 발현이 감소 또는 억제시 식물의 개화가 지연되는 활성을 의미한다.

상기 본 발명에 따른 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있으며 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 DNA일 수 있다.

　　　　　　　　

또한, 본 발명은　ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터를 식물체에 도입하는 것을 특징으로 하는 개화시기가 조절되는 형질전환 식물의 제조방법을 제공한다.

상기 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터 내로 삽 입되어 식물세포를 형질전환 할 수 있다.　 "발현 벡터"라는 용어는 ECL1　단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다.　 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.　 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다.　 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다.　 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.　 식물 세포 내로 ECL1 유전자를 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다.　 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 당업자라면 본 발명의 ECL1 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키는 데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 ECL1 유전자 서열을 식물 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.　　　

　　　　　　　　

본 발명에 따른 재조합 벡터는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 식물 체내로 도입할 수 있다.　 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다.　

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되어 개화시기가 조절된 형질전환 식물을 제공한다.

본 발명에 따른 개화시기가 조절된 식물은 당업계의 통상적인 방법인 유성번식 방법 또는 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　 보다 구체적으로 본 발명의 식물체는 꽃의 수분과정을 통하여 종자를 생산하고 상기 종자로부터 번식하는 과정인 유성번식을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 ECL1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환 한 다음 통상적인 방법에 따라 캘러스의 유도, 발근 및 토양 순화의 과정인 무성번식 방법을 통해 수득할 수 있다.　 즉, ECL1 유전자가 포함된 재조합 벡터로 형질전환된 식물의 절편체를 당업계에 공지된 적합한 배지에 치상한 다음 적정 조건으로 배양하여 캘러스의 형성을 유도하고, 신초가 형성되면 호르몬 무첨가 배지로 옮겨 배양한다.　 약 2주 후 상기 신초를 발근용 배지에 옮겨서 뿌리를 유도한다.　 뿌리가 유도된 다음 이를 토양에 이식하여 순화시킴으로써 개화시기가 조절된 식물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체 뿐만아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.

　　　　　　　　

상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스 등을 포함하는 사료작물류가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 개화시기가 조절되는 형질전환 식물은 애기장대일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른　ECL1 유전자의 발현을 촉진하여 조기 개화를 유도함으로써 식물의 꽃 및 종자의 생산을 증가시킬 수 있는 식물로는 난초, 장미, 거베라, 국화 등의 화훼류 및 복숭아, 감귤, 살구 등의 과수류가 있을 수 있고,　 ECL1 유전자의 발현을 억제하여 개화를 지연시킴으로써 식물체로부터 잎이나 줄기 같은 유용한 부분의 생산량을 증가시킬 수 있는 식물로는 옥수수, 콩, 감자 등의 식량작물류, 호박, 오이, 무 등의 채소작물류 및 인삼, 담배, 참깨 및 땅콩 등의 특용작물류가 있을 수 있다.

　　　　　　　　

나아가 본 발명은 ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자의 발현을 조절하는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다.　 구체적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ECL1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포를 후보물질과 접촉시킨 다음, 상기 후보물질이 본 발명의 ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자의 발현에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 ECL1 단백질의 활성 또는 발현을 촉진 또는 억제하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.　 상기에서　ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자의 발현을 조절한다는 것은 ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자의 발현을 촉진 또는 억제한다는 것을 말한다.　　

　　　　　　　　

상기에서 후보물질이 본 발명의 ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자의 발현을 촉진 또는 억제시키는지의　여부는 당분야에 공지된 중합효소 연쇄반응, 노던 블롯 분석, 서던 블롯 분석, 웨스턴 블롯 분석, 효소 면역 측정(ELISA), DNA 칩 및 2-D겔 분석 등을 통해 측정할 수 있다. 상기에서 ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자의 발현을 촉진시킨다는 것은 ECL1 단백질을 코딩하는 유전자의 전사(transcription) 및 번역(translation)이 촉진되어 과다 발현된 본 발명의 단백질에 의해 식물의 개화가 촉진된다는 것을 말하며, 상기 ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자의 발현이 억제된다는 것은 ECL1 단백질을 코딩하는 유전자의 전사(transcription) 및 번역(translation)이 억제되어 발현이 감소된 본 발명의 단백질에 의해 식물의 개화가 지연된다는 것을 말한다. 상기 ECL1 단백질의 활성 또는 ECL1 유전자를 조절하는 후보물질로는 예를 들면, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 모조물, 화합물 및 생물제제 등이 포함될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 반드시 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.　　　

< 실시예 1>

애기장대( Arabidopsis thaliana )로부터 조기개화 돌연변이체의 선별

애기장대에서 돌연변이를 유도하기 위하여, 활성 표지(activation tagging) 벡터인 pSKI015(The Salk Institute, CA, USA의 Dr. Detlef Weigel로부터 얻음)를 공지의 전기천공법(electroporation)으로 아그로박테리움 튜메파시엔스 GV3101(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101)에 도입시킨 후, 상기 pSKI015가 도입된 아그로박테리움 균주를 YEP 배지에 접종하여 배양 후, 흡광도가 0.8~3.0 사이가 될 때 상기 배양액을 원심 분리하여 침전된 세포를 5% 설탕 용액에 현탁하였다. 이후 상기 용액에 Silwet L-77을 0.05%의 농도가 되도록 첨가하였다. 형질전환 시킬 식물, 즉, 애기장대에서는 눈(bud)이 열린 것을 잘라내었다. 피펫으로 상기 Silwet L-77가 첨가된 용액을 한방울씩 눈에 떨어뜨려 애기장대를 형질전환 시켰다. 이후, 상기 형질전환 된 눈에 검은색 돔으로 16~24 시간 덮어두었다. 장일조건하에서 눈이 여물도록 키운 뒤 수확하여 토양에서 재배하였다. 상기 재배된 형질전환 식물체 중에서 조기개화 및 잎이 말린 표현형을 보인 변이체를 선별하였고, 상 기 선별된 변이체를 'ecl1 -1D' 돌연변이체로 명명하였다.

< 실시예 2>

ecl1 -1D 돌연변이체의 개화시기 조사 　　　　　　　

상기 실시예 1에서 선별된 ecl1 -1D 돌연변이체의 개화시기를 애기장대 야생형과 비교하여 조사하였다. 상기 돌연변이체와 야생형의 개화시기 는 로젯잎(뿌리에서 직접 잎이 나오는 형태)과 경엽의 수를 세어 합한 총 잎의 수로 개화시기의 지표로 삼았다. 또한, 상기 ecl1 -1D 돌연변이체의 조기개화가 어느 단계에서 이루어졌는지 확인하기 위하여 야생형과 돌연변이체의 상전이(phase transition)를 비교하였다. 상기 상전이 비교 실험은 식물의 표피 세포에 존재하는 털세포인 모상체(trichome)를 이용하여 수행하였는데, 유생 단계에서 생성된 잎은 윗면에만 모상체를 가지고 있고 어덜트 단계에서 생성된 잎은 잎의 앞, 뒷면 모두에 모상체를 갖는 특징이 있다. 또한 생식 단계동안 생성된 줄기의 잎은 윗면에 모상체가 없는 특징이 있다. 따라서 상기와 같은 특징을 근거로 모상체가 잎의 윗면에 있는지 또는 없는지를 관찰하면서 각 단계에서 잎의 수를 세어 상전이를 비교 분석 하였다.

그 결과, 장일조건에서 야생형은 15장에 개화를 보이는데 비해, ecl1 -1D 돌연변이체는 6.4장에서 개화하였다(도 1 참조). 따라서 상기 ecl1 -1D 돌연변이체는 야생형에 비해 2배 이상의 빠른 개화시기를 나타내었고, 이는 기존에 개화촉진자로 알려진 SOC1 , CO, FT 의 과다발현 식물의 개화시기가 각각 6.8장, 7.5장 및 4장인 것으로 볼 때, FT 에 의한 개화시기보다는 조금 느리지만, SOC1 및 CO 에 의한 개화시기보다는 빠른 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 상전이 비교 결과, 야생형과 돌연변이체의 어덜트 영양 단계(adult vegetative phase)에서 가장 큰 차이가 있음을 확인하였는데 야생형의 어덜트 영양 단계(adult vegetative phase)는 5.5장이었고 ecl1 -1D 돌연변이체는 0.3장에 불과하였다(도 2 참조). 따라서 상기 ecl1 -1D 돌연변이체의 조기개화의 주요 요인은 어덜트 영양 단계가 짧아졌기 때문인 것임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

ECL1 유전자의 클로닝 및 서열 분석

　　　　　　　　

상기 실시예 1의 방법에 의해 선별된 ecl1 -1D 돌연변이체로부터 35S 인핸서에 의해 활성화된 T-DNA 주변의 유전자를 탐색하기 위해, TAIL PCR 및 플라스미드 회수 방법(plasmid rescue)(Weigel, D. et al., Plant Physiology 122, 1003-101, 2000 참조)에 따라 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 게놈 DNA에서 삽입된 T-DNA의 위치를 확인하기 위하여 PCR을 이용한 genotyping을 수행하였는데 야생형과의 구별을 위해서는 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머를 사용하였고, ecl1 -1D를 확인하기 위해서는 서열번호 4 및 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 서린 바이오사에서 구입한 PTC-200을 사용하여 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 56℃에서 어넬링(annealing) 후, 1분 40초 동안 반응(extension)하였다. 또한, 상기 삽입된 T-DNA에 의해 과다 발현된 유전자를 확인하기 위하여 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 60℃에서 35초씩 30회 PCR을 수행하였다. 상기 PCR에 사용된 프라이머의 염기서열은 하기와 같다.

정방향 프라이머 JH2571 : 서열번호 4

5'-CGCATGTATGTGATTTGAAGA-3'

역방향 프라이머 JH2572 : 서열번호 5

5'-CACCCAATTGTTTCGGAAGT-3'

역방향 프라이머 GT7CG : 서열번호 6

5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'

　　　　　　　　

정방향 프라이머 JH2589: 서열번호 7

5'-GCCATGCTTTCAAAACCTTTC-3

역방향 프라이머 JH2590: 서열번호 8

5'-CGTGGCATCGTGGTCTAATC-3'

　　　　　　　　

분석된 본 발명 유전자의 염기서열을 진뱅크(Genbank) 상의 공지된 다른 유전자의 염기서열과 서열 상동성을 조사하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 35S 인핸서는 애기장대 2번 염색체의 AT2g45650 및 AT2g45660 유전자의 사이에 삽입된 것을 알 수 있었고, 특히 AT2g45650 유전자에 가깝게 삽입된 것을 알 수 있었다. 그러나 상기 AT2g45650 유전자는 공지된 유전자이나 그 기능에 대해선 알려진 바가 없다.

따라서 본 발명자들은 상기 AT2g45650 유전자를 ‘ECL1 ’으로 새롭게 명명하였고, 본 발명에 따른 ECL1 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었으며, ECL1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타내었다.

< 실시예 4>

애기장대 야생형 및 ecl1 -1D 돌연변이체에서 ECL1 유전자의 발현양상　조사

　　　　　　　　

상기 실시예 1에서 선별된 ecl1 -1D 돌연변이체에서 삽입된 35S 인핸서에 의해 ECL1 유전자가 과다 발현되고 있는지를 확인하기 위하여, 야생형 애기장대 및 ecl1 -1D 돌연변이체로부터 RNA를 추출하였고 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RNA의 추출은 트리졸(trizol) 시약을 사용하여 상기 시약의 제조업체인 인비트로젠 생명 기술회사(Invitrogen Life Technologies)의 실험 방법에 따라 수행하였다. 이후, 상기 추출된 RNA중 1ug 을 주형으로 하여 프로메가 RT-시스템의 방법(Kardailsky I et al., Science 286, 1962-1965, 1999)에 따라 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 수득하였다. 한편, 정량 분석을 위해 주형으로 UBQ10을 사용하여 상기와 동일한 조건으로 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 야생형과는 달리 ecl1 -1D 돌연변이체에서 35S 인핸서에 의해 ECL1 유전자인 AT2g45650 이 과다 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

애기장대 야생형 및 ecl1 -1D 돌연변이체의 표현형 비교 조사

본 발명의 ECL1 유전자가 과다 발현된 ecl1 -1D 돌연변이체가 야생형 애기장대와 표현형에 있어서 어떠한 차이를 보이는지 비교하기 위하여 육안으로 확인하였고, 잎의 단면과 표면은 A.　 W. 로바드 및 A. J. 윌슨의 방법(Procedures in Electron Microscopy, 10:0.1　 10:2.35, 1993, John Wiley & Sons Ltd.)에 따라 전처리 한 후, 전자현미경(SEM515, 필립스, 인드호벤 네덜란드)으로 관찰하였다.

그 결과, 야생형과는 달리 ecl1 -1D 돌연변이체는 향축(adaxial)면으로 잎이 말려져 있는 것을 확인할 수 있었고(도 5a 참조), 잎의 단면을 관찰한 결과, ecl1 -1D 돌연변이체는 상층 상피세포층의 세포모양이 야생형에 비해 좀더 구형상을 보였으며 상층 상피세포층의 세포수에 비하여 하층 상피세포층에 있는 세포수가 야생형에 비해 적은 것을 확인하였다. 그러나 야생형의 경우 상층과 하층의 상피세포층의 세포 크기는 유사한데 비해 ecl1-1D 돌연변이체에서는 하층 상피세포층의 세포가 상층 상피세포층 세포보다 더 큰 것을 확인하였다(도 5b 및 5c 참조).

반면, 꽃의 암술과 수술에서 발현하는 AG 라는 유전자가 과다 발현 시 잎이 말리는 현상이 있음이 보고된 바 있다. 따라서 입이 말리는 현상을 보인 본 발명의 ecl1 -1D 돌연변이체에서 AG 유전자의 발현 정도를 확인한 결과, 야생형보다 AG의 발현이 많음을 확인하였고, AG 에 의해 발현이 억제된다고 알려진 CLF 의 발현은 야생형과 유사하였다(도 5d 참조).

따라서 본 발명의 ecl1 -1D 돌연변이체의 잎이 말리는 현상은 AG 유전자의 과다 발현 및 하층 상피세포층의 세포 크기 증가가 그 원인임을 확인할 수 있었다.

　　　　　　　　

　< 실시예 6>

　 ECL1 유전자가 관련된 개화시기 조절 경로 분석

　본 발명의 개화시기 조절 유전자인 ECL1이 개화시기 조절 경로 중 광주기 의존 경로에 관여하는지 확인하기 위하여 야생형 애기장대를 장일조건(16:8/낮:밤) 및 단일조건(8:16/낮:밤)으로 배양한 후, 애기장대에서 ECL1 mRNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 상기 실시예 3의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 　　

　그 결과, ECL1의 발현은 장일조건하에서 훨씬 높은 발현을 보였다(도 6a 및 6b 참조).　 따라서 본 발명의 ECL1 유전자는 광주기 조절 경로에서 식물의 개화시기를 조절하고 있음을 알 수 있었다. 이 외에, 대기의 온도에 의한 개화시기 조절 경로, 식물의 호르몬인 지베렐린 경로, 춘화 경로 및 광질에 대한 반응을 조사한 결과 상기의 경로에 의해서는 본 발명의 ECL1 유전자가 아무런 영향을 받지 않음을 확인하였다(결과 미도시).

　　　　　　　

　< 실시예 7>

ECL1 의 기능손실 돌연변이체의 선별 및 개화시기 비교

본 발명자는 ECL1 유전자의 기능이 상실된 돌연변이체를 얻기 위하여 ECL1 유전자의 3‘UTR'에 T-DNA가 삽입된 종자(SALK_104439)를 솔크(http://signal.salk.edu-bin/tdnaexpress)로부터 입수하였다. 또한, PCR을 이용한 genotyping을 수행하여 상기 식물체가 ECL1 유전자의 기능이 상실된 돌연변이체임을 확인하였다. 상기 PCR은 돌연변이체에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 9, 10 및 11의 프라이머들을 사용하여 56℃에서 1분 20초씩 36회 PCR을 수행하였다. ECL1 유전자의 기능이 상실된 돌연변이체와 야생형과의 개화시기 비교는 상기 실시예 2의 방법과 동일하게 수행하였다.

　　　　　　　　

mLBa1 프라이머 : 서열번호 9

5'-GTTCACGTAGTGGGCCATC-3'

JH2642 프라이머 : 서열번호 10

5'-TGTCATTTAATTTCCAGCTCGTGTG-3'

JH2643 프라이머 : 서열번호 11

5'-CTTGGAAGAAGTTGCGTCCCC-3'

　　　　　　　　

상기 방법에 의한 ECL1 유전자의 기능이 상실된 ecl-3 돌연변이체의 표현형 및 개화시기를 야생형과 비교한 결과, 야생형은 18장에 개화하였고, ecl-3 돌연변이체는 22.5장에 개화하는 것으로 나타나 야생형보다 개화가 지연되었음을 확인할 수 있었다(도 7 참조). 따라서 상기의 결과로 본 발명의 ECL1 유전자가 개화를 촉진하는 유전자임을 확인할 수 있었다.　

< 실시예 8>

ECL1 유전자와 개화시기 조절 유전자들의 발현 양상 비교

　　　　　　　　

<8-1> 마이크로 어레이 분석　

본 발명의 ecl1 -1D 돌연변이체가 조기개화를 보이므로, 개화시기 조절 경로에 관여하는 조절 유전자들과의 상호 작용을 확인하기 위하여 어피매트릭스 유전자칩(Affymetrix Genechip)을 이용하여 야생형과 ecl1 -1D 돌연변이체에서 마이크로 어레이 분석을 수행하였다(H Sze et al., Plant Physiol., Sep;136 (1):2532-47, 2004 참조)

　그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, A에는 ecl1 -1D 돌연변이체에서 야생형보다 발현이 증가한 유전자들을 나타낸 것이고, B는 발현이 감소한 유전자들을 나타낸 것이다. 조기개화를 촉진하는 것으로 알려진 FT 및 AP1 유전자는 야생형보다 ecl1 -1D 돌연변이체에서 발현이 증가하였음을 확인하였고, 개화 억제 유전자인 FLC 및 MAF2 유전자의 발현은 감소되었음을 확인하였다.

　따라서 상기의 결과, 본 발명의 ECL1 유전자는 도 8에 나타난 유전자들과 더불어 개화시기를 조절할 가능성이 있음을 예측할 수 있었다.

<8-2> RT- PCR 을 이용한 분석　

상기 <8-1>과 같이 개화시기 조절 유전자들이 ecl1 -1D 돌연변이체의 조기개화에 관여하는지를 확인하기 위하여, 야생형 및 ecl1 -1D 돌연변이체에서 광주기 경로 유전자들, GA(지베렐린) 경로 유전자들 및 자발적 경로의 유전자들의 발현 양상을 시간별로 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 상기 RT-PCR의 조건 및 방법은 Kardailsky I et al.,　 Science, 286:1962-1965, 1999에 기재된 방법에 의해 수행하였고, 사용된 프라이머의 염기서열은 하기 표1에 기재하였다.

프라이머의 염기서열

프라이머	타켓 유전자	염기서열	서열번호
FP1033 (F)	AP1	5-GCACATCCGCACTAGAAAAAACCAAC-3	12
FP1035 (R)	AP1	5-GCACATCCGCACTAGAAAAAACCAAC-3	13
JH3088 (F)	TFL1	5-CAATGGCCATGAGCTCTTTC -3	14
JH3089 (R)	TFL1	5-TGCAGCGGTTTCTCTTTGTG -3	15
JH1002 (F)	FT	5-ACTATAGGCATCATCACCGTTCGTTACTCG-3	16
JH1003 (R)	FT	5-ACAACTGGAACAACCTTTGGCAATG-3	17
JH1011 (F)	UBQ10	5-GATCTTTGCCGGAAAACAATTGGAGGATGGT-3	18
JH1012 (R)	UBQ10	5-CGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAACAGG-3	19
JH1145 (F)	SOC1	5-GGATCGAGTCAGCACCAAACC-3	20
JH1146 (R)	SOC1	5-CCCAATGAACAATTGCGTCTC-3	21
JH2569 (F)	SPY	5-GTGTTACAATGGCTGGCTCA -3	22
JH2570 (R)	SPY	5-CCTCTTTTTGCAGCATTTCC -3	23
JH2555 (F)	GAI	5-GACTGTAGCGGAAGCTCTGG -3	24
JH2556 (R)	GAI	5-TCCCTTGAAAAGCTTCGAGA -3	25
JH1015 (F)	CO	5-GCTAGACGCCATCAGCGAGTTCC-3	26
JH1016 (R)	CO	5-AAATGTATGCGTTATGGTTAATGG -3	27
JH2428 (F)	GI	5-AAGCAGCAGCAGCAGTTGTC-3	28
JH2429 (R)	GI	5-GGGTGTGAAAGGCACCGTAT -3	29
MB73(F)	FLC	5-GTAGCCGACAAGTCACCTTCTCCA-3	30
MB73(R)	FLC	5-GAGATTTGTCCAGCAGGTGACATCT-3	31

　　　　　　　　

그 결과, 광주기 경로에 위치하고 있는 유전자들 중에서는 FT 및 AP1 유전자의 발현이 야생형보다 ecl1 -1D 돌연변이체에서 증가되었음을 확인하였고(도 9a 참조), GA 경로의 SPY 및 GAI 유전자의 발현은 야생형과 거의 유사하였다(도 9b 참조). 반면, 자발적 경로의 FLC는 야생형보다 오히려 ecl1 -1D 돌연변이체에서 발현양이 감소하였다(도 9c 참조).

따라서 본 발명의 ECL1 유전자는 식물의 개화시기 조절에 있어서 광주기 경로 또는 자발적 경로에서 조절하고 있음을 확인할 수 있었다. 또한 FLC 유전자의 발현은 FT의 발현을 억제한다고 알려져 있어 본 발명의 ECL1 유전자가 자발적 경로의 FLC 를 감소시킴으로써 FT 의 발현을 촉진시킴을 알 수 있었다.

<8-3> GUS 보고자를 이용한 분석 　　　　

상기 실시예 <8-2>의 결과처럼 본 발명의 ECL1 유전자가 자발적 경로의 FLC를 감소시킴으로써 FT의 발현을 촉진시키는지 확인하기 위하여, 당업계에 공지된 GUS 보고자를 이용하여 식물의 생체 내에서 조사하였다. 먼저, FT 와 FLC의 프로모터와 GUS(beta-glucuronidase)유전자가 융합된 형태의 구조물을 가진 형질전환 식물체를 만들어서 이들과 야생형의 애기장대 및 ecl1 -1D 돌연변이체와 교배를 한 후, 다음 세대에서 GUS 유전자 활성을 분석하여 FT 및 FLC 유전자의 발현 양상을 현미경(Nikon Optiphot-2)을 사용하여 확인하였다. 상기 GUS 유전자 활성 분석은 Sessions A et al., Science, 289: 779-782, 2000에 기재된 방법으로 수행하였다.

그 결과, FT의 발현의 경우, 야생형의 줄기정단 분열세포에서 볼 수 없었던 pFT::GUS의 발현이 ecl1 -1D pFT ::GUS 식물체에서는 줄기정단 분열세포에서 분명하게 발현되는 것으로 보아 ECL1이 줄기정단 분열세포에서 FT의 발현을 유도하고 있음을 확인할 수 있었다(도 10a 및 10c 참조). 또한, pFLC ::GUS 분석결과 상기 실시예 <8-2>의 결과와 동일하게 pFLC ::GUS의 발현은 야생형에 비해 ecl1 -1D pFLC ::GUS 식물체에서 감소하는 것으로 나타났다(도 10b 및 10d 참조).

따라서 본 발명의 ECL1 유전자가 ecl1 -1D pFT :: GUS 식물체의 줄기정단 분열세포에서 FLC의 발현을 억제하여 FLC에 의해 발현이 억제되었던 FT의 발현이 촉진됨을 알 수 있었다.

결론적으로, 본 발명의 ECL1 유전자는 식물의 개화를 조절하는 복잡한 유전학적인 네트워크 상에서 광주기 경로와 자발적 경로의 전환점이라 할 수 있는 FT의 발현을 조절하는 기능을 가지고 있으며, 특히, 줄기정단 분열조직에서 FT의 발현을 억제하는 FLC의 발현을 저하시킴으로써 FT의 발현을 증가시켜 조기 개화를 유도하고 있음을 확인할 수 있었다(도 11 참조).　　　　　　　　

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 애기장대 유래의 ECL1 유전자를 식물체 내에 도입하여 과다 발현시킴으로써 식물의 조기 개화를 유도하여 꽃과 종자의 생산 효율을 증가시킬 수 있고, ECL1 유전자의 발현을 억제하여 식물의 개화시기를 지연시킴으로써 식물체로부터 잎이나 줄기와 같은 유용한 부분의 생산량을 증대시킬 수 있는 효과가 있다. 또한 ECL1 유전자를 이용하여 식물의 개화시기 조절 유전자의 탐색 등에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 애기장대의 개화시기를 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 개화시기를 조절하는 것은 개화시기를 촉진 또는 지연시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 것임을 특징으로 하는 방법.
4. 삭제
5. 제2항에 있어서, 상기 개화시기를 촉진하는 것은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 애기장대에 도입하여 ECL1 유전자를 과다 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제2항에 있어서, 상기 개화시기를 지연시키는 것은 애기장대 내에서 ECL1 유전자를 결손 시키거나 또는 상기 유전자에 대한 안티센스 분자를 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 ECL1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 애기장대에 도입하는 것을 특징으로 하는 개화시기가 조절되는 형질전환 애기장대의 제조방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 재조합 벡터의 애기장대로의 도입은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커법(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol) 침전법으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 사용하는 것임을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항의 방법에 따라 제조되어 개화시기가 조절된 형질전환 애기장대.
10. 삭제
11. 삭제

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