CN105925718A - 一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记 - Google Patents

一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物生物学技术和基因工程技术领域，具体涉及一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记。所述用于培育高蛋白质含量粳稻的分子标记，是鉴别水稻中qPC‑10基因座位上不同等位基因的分子标记G2，为CAPs标记，位于SEQ ID NO.1的第1455bp。该标记的引物序列如SEQ ID NO.17‑18所示，本发明还公开了一种利用所述分子标记培育高蛋白质含量粳稻的方法。本发明分子标记和配套方法，可以培育高蛋白质含量的粳稻品种，具有广阔的应用前景。

Description

一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记
技术领域
本发明属于植物生物学技术和基因工程技术领域，具体涉及一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记。
背景技术
世界超过一半的人口利用稻米作为主要的粮食来源。近十年来，随着人们生活水平的不断提高，稻米品质受到越来越多的消费者关注。但是，我国稻米的品质则普遍偏低，在南方稻区大面积栽培的籼稻的品质普遍低于国标二级，而在北方栽培的粳稻的品质与日本品种也存在较大的差距。这一方面满足不了我国消费者对优质稻米的日益增长的消费需求，同时也严重影响了我国稻米在世界市场上的竞争力。因此，近十几年来，我国在水稻品种培育上，除了将高产作为主要目标外，稻米品质的提高已成为另一个十分重要的育种目标。优质稻米的理化指标包括营养品质、蒸煮食味品质、加工品质和外观品质等。经研究表明，稻米的组成及其结构决定了稻米的蒸煮和营养品质。稻米是由两大主要成分所组成：一是占90％左右的淀粉；二是稻米中蛋白质。目前对于淀粉的生物合成机制已经比较明确，参与合成淀粉的基因、以及各个基因之间的调控网络已经明晰。这些研究成果的取得为水稻淀粉品质的改良提供了有力的理论支撑。然而，决定稻米蒸煮和营养品质的另一个重要因子：蛋白质的遗传机理至今不是很明了。
水稻胚乳蛋白质含量是典型的数量性状，具有比较复杂的遗传基础。利用分子标记技术可以对控制数量性状的QTL进行定位和分解，将复杂的数量性状分解为简单的孟德尔因子进行研究。近十几年来已经发现了许多控制水稻蛋白质含量的QTLs，而这些QTLs的定位还处于初级阶段。不同的研究者利用不同的材料在不同的环境中所定位的QTLs不尽相同，且很少有能被重复检测到。到目前为止，只有在第一条染色体长臂上编码氨基酸跨膜转运蛋白的qPC1已被成功克隆。因此，本发明克隆的qPC-10对于水稻品质性状的改良有巨大的应用潜力和前景，为水稻的品种育种提供新的重要基因资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育高蛋白质含量粳稻的方法和分子标记。本发明基于从水稻中分离克隆出的一个控制水稻胚乳蛋白质含量和品质的主效基因的完整编码区段DNA片段(这个基因命名为qPC-10)，利用这个基因来改良水稻品质
为了便于识别携带控制稻米蛋白质含量qPC-10的基因型，在启动子+546bp的位置上设计一个能够鉴别qPC-10等位基因型的功能标记G2。
本发明所采用的技术方案是：一种用于培育高蛋白质含量粳稻的分子标记，是鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的分子标记G2，该标记为CAPs标记，位于SEQ IDNO.1的第1455bp。所述qPC-10基因序列如SEQ ID NO.1所示，qPC-10基因所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述分子标记G2引物序列为：F:5’-TGTGTCACGCCTAATACT-3’(SEQ ID NO.17)，R:5’-ATGAAAGAAGATGTGGTG-3’(SEQ ID NO.18)。
利用上述分子标记进一步提供了一种鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的方法，是用序列如SEQ ID NO.17-18引物扩增待测水稻中qPC-10基因，扩增产物用限制性内切酶ClaI酶切，能够被限制性内切酶ClaI切开的携带有qPC-10粳型等位基因的片段，不能被切开的则携带qPC-10籼型等位基因的片段。
更进一步，本发明还提供了一种培育高蛋白质含量粳稻的方法，具体为以待改良的粳稻品种与一个典型的籼稻品种杂交,再用粳稻品种连续回交。在回交后代中,用分子标记G2的两个引物(SEQ ID NO.17-.18)对回交群体中的个体基因组DNA进行PCR扩增，扩增的产物采用限制性内切酶ClaI酶切，如果其中一条带不能被切开，则该个体用于继续回交。按此法回交至5代以上，自交获得纯合个体，再用G2标记进行检测，获得在qPC-10座位上带有籼型等位基因的个体/品系。
本发明对Sasanishiki/Habataki所衍生的CSSLs群体进行精米蛋白质含量的QTL分析，鉴定出含有qPC-10基因的材料，与Sasanishiki杂交并自交，构建qPC-10的分离群体，选择具有极端蛋白质含量的植株成功将qPC-10基因定位到第10号染色体上的LOC_Os10g26060处。该基因包含4个外显子，共编码499个氨基酸，通过生物信息学技术预测该蛋白质为谷蛋白。Real-Time PCR表达分析发现，该基因只在水稻籽粒中表达，且在胚乳中蛋白质含量高的品种(如Habataki)比蛋白质含量低的品种(如Sasanishiki)的表达量高。预测表达量其关键作用，于是利用PCR技术获得Habataki的克隆，亚克隆后，进行转基因CRISPR-Cas9干涉表达和互补转化实验验证，在CRISPR-Cas9干涉表达的T0代阳性植株中蛋白质含量存在降低，而互补转化T0代阳性单株均表现出胚乳蛋白质含量存在不同程度的升高。此外，利用稻米蛋白质含量高的品种(如Habataki)和蛋白质含量低的品种(如Sasanishiki)进行比较测序，发现在2Kb的启动子区和编码区范围内两品种存在7个共同的SNP和Indel差异，其中有6个突变位于启动子区，1个位于3’UTR编码非翻译区。利用PCR技术同时获得Habataki和Sasanishiki启动子区的克隆，构建GUS载体。结果表明在籽粒发育不同时期Habataki启动子的表达量均高于Sasanishiki启动子表达量。以上结果说明了启动子区的变异是导致表达量变化的原因，进而导致水稻胚乳中蛋白质含量的变化。本发明在水稻胚乳中克隆了一个对稻米蛋白质含量具有正调控效应的基因，这为水稻的优质育种提供了新的基因资源。
附图说明
图1 qPC-10基因的精细定位。
图2 qPC-10候选基因LOC_Os10g26060的表达分析。
图3 G2标记在Habataki和Sasanishiki品种中的检测带型。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明所设计的生物材料来源如下：
Sasanishiki、Habataki、CSSL：引自日本国立遗传研究所，
载体pCAMBIA1301：公开材料，该载体购自Takara公司
载体p-MD18-T：公开材料，该载体购自Takara公司
载体p1022：公开材料，该载体购自Takara公司
大肠杆菌DH5α：公开材料，该载体购自Generay公司
农杆菌EHA105：公开材料，该载体购自Takara公司。
实施例1：精米蛋白含量的QTL定位
1、稻米蛋白质含量表型的测量
谷粒自然干燥后放在至于室温下至少3个月以上以保证谷粒的干燥和各株系间含水量相对一致。利用稻谷出糙机上脱壳得到糙米，将糙米在精米机上研磨成精米。在近红外快速分析仪上快速检测精米的蛋白质含量。
2、利用单片段代换系鉴定精米蛋白质含量QTL
2007-2008年，在3个不同环境中鉴定了典型籼稻品种Habataki和粳稻品种Sasanishiki的蛋白质含量，发现在不同的环境中其蛋白质含量均存在显著差异(表1)。在39个染色体单片段代换系群体中，精米蛋白质含量也分离显著。在2007年扬州，蛋白质含量变化范围为8.6％到11％；在2008年海南，变化范围为7.8％到9.4％；在2008年扬州，变化范围为8.7％到11.7％。QTL分析后共检测到10个QTLs:qPC-1,qPC-3,qPC-5,qPC-6，qPC-10，qPC-11和qPC-12。其中，在第1号染色体的qPC-1在三个不同的环境中均能被检测到；在第10号染色体的qPC-10在两个环境中能够被重复检测到；其他的位点只能被检测到一次。
表2水稻籽粒蛋白质含量QTL检测
实施例2：qPC-10的精细定位和图位克隆
1、分子标记的发展
本发明中所用到SSR标记信息全部来自于Gramene网站数据库(http://www.gramene.org./)。此外，还根据网上公布的粳稻品种Nipponbare的基因组序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp)，以及籼稻品种93-11的基因组序列(http:// rise.genomics.org.cn/)设计了在Habataki和Sasanishiki间具有多态的InDel(Insert/Deletion)标记，用于qPC-10的精细定位分析。
2、重组单株的分析和qPC-10的精细定位及候选基因确定
对39个单片段代换系群体的基因型和表型进行鉴定，SL431被认为含有qPC-10且其精米蛋白质含量显著高于背景亲本Sasanishiki。SL431是以Sasanishiki为背景且在第10号染色体上有且只有一个片段被Habataki替换。因此，为了精细定位qPC-10，将SL431和Sasanishiki杂交后自交获得2237株F2单株。在F2群体中，精米蛋白质含量呈典型的正态分布，变化范围从8.3％到14.5％。为了消除环境对精米蛋白质含量的影响，挑选出1060株具有极端精米蛋白质含量的单株形成亚定位群体，极端值变化范围分别是8.3％到9.5％和11.5％到14.5％。为了缩小目标区段，在代换片段上均匀地设计标记，共筛选出9个具有多态的SSR标记(RM3882、RM7217、RM217、RM5348、RM6142、RM5758、RM467、RM8201和RM1859)和1个InDel(YYH-4)标记，该InDel标记序列为：F：5’-AAGGATTGGATGTGGGAAGC-3’(SEQ IDNO.3)；R:5’-AGCAACTTCGGGATGGGT-3’(SEQ ID NO.4)。经基因型鉴定，在该代换区段里共存在228个重组单株。结合1060个F2单株的基因型和表型数据，QTL软件分析结果表明在标记RM467和RM5658之间存在一个峰，LOD值为18.8，共可以解释19.6％的变异，这两个标记的物理距离为579Kb，初步判断qPC-10处于该区段里。为进一步确定qPC-10的位置，选取在区段RM467和RM5658间基因型为杂合的F2单株继续种植，形成2000株F3单株。单株收种并考察精米蛋白质含量，同时在标记RM467和RM5658之间开发STS标记饱和图谱。定位结果表明，在标记Y1和Y6区段里共有8种不同的重组基因型，并对这8种基因型的精米蛋白质含量比较分析。利用重叠作图法最终将qPC-10锁定在Y1和Y3之间，该区段的物理距离约为35Kb。经生物信息学分析表明，在该区段里共有4个开放阅读框，分别是LOC_Os10g26050,LOC_Os10g26060,LOC_Os10g26070和LOC_Os10g26110。在这之中,LOC_Os10g26060是一个编码谷蛋白的基因。因此该基因被认为是qPC-10的候选基因(附图1)。实施例3：qPC-10的候选基因表达和转基因验证
Real-Time表达谱分析发现，该基因只在胚乳中表达，在全生育期的其他组织中均无表达.为了进一步明确qPC-10基因引起蛋白质含量变异的原因，我们构建了qPC-10基因的近等基因系，NIL-qPC-10H和NIL-qPC-10S。利用real-time RT-PCR分析了qPC-10基因的表达情况。结果表明来自于籼稻Habataki中的qPC-10H等位基因的表达要显著高于粳稻中的qPC-10S等位基因(附图2)。
为了验证qPC-10基因的功能，根据预测的候选基因全长cDNA序列(SEQ IDNO.12001-3500bp)，设计一对特异引物扩增Habataki启动子和编码区的序列，然后连接到TA克隆载体上，挑选出含有候选基因的无突变的正确克隆，再进行亚克隆，连接到双元表达载体pCAMBIA1301上。在该基因编码区寻找一段特异的23bp的序列连接到SK-gRNA载体后测序挑选出无突变的正确克隆，酶切后连接到终载体pC1300-Cas9上对该基因进行敲除。采用转基因的方法，将得到的正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到Sasanishiki和SL431中，经过诱导、继代、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽得到转基因的水稻植株。对转基因株系进行蛋白质含量等品质相关指标测定，结果表明qPC-10H可以显著提高粳稻的蛋白质含量(表3)。
表3转基因株系中总蛋白质含量和四种贮藏蛋白含量比较
注：表中数据为mean±SD
实施例4:比较测序确定qPC-10等位基因间的自然变异
(1)序列测定
对精米蛋白质含量高的品种Habataki和精米蛋白质含量低的品种Sasanishiki进行目标基因的测序。利用6对PCR引物(表4)相互组合，采用高保真度的PrimerStar从这两个品种的基因组中进行PCR扩增，扩增成功后交南京金斯瑞公司进行测序拼接。
表4序列测定引物序列
(2)发生自然变异的序列比较
目标区段的序列比较分析在精米蛋白质含量高的品种Habataki和精米蛋白质含量低的品种Sasanisiki之间进行，发现在4.5Kb的启动子和编码区范围内精米蛋白质含量高和低的两个品种间存在7个SNP和InDel差异，其中6个处于启动子区，1个处于3’UTR区，在基因的编码区不存在差异(表5)。因此，这些变异很可能是引起基因表达变异的原因，进而导致水稻精米蛋白质含量的变异。
表5不同籼粳品种间候选基因的序列差异
实施例5：鉴别qPC-10不同等位基因的分子标记
为了便于识别Habataki和Sasanishiki中所携带控制稻米蛋白质含量qPC-10的基因型，我们在启动子+546bp(SEQ ID NO.1的1455bp)的位置上设计一个能够鉴别qPC-10等位基因型的功能标记G2。该标记为CAPs标记，引物序列为：F:5’-TGTGTCACGCCTAATACT-3’(SEQ ID NO.17)，R:5’-ATGAAAGAAGATGTGGTG-3’(SEQ ID NO.18)。对于携带有qPC-10粳型等位基因的片段能够被限制性内切酶ClaI切开(如图3泳道1Sasanishiki)，而携带qPC-10籼型等位基因的片段则不能被切开(如图3泳道2籼稻Habataki)。该标记可以较好地区分qPC-10座位上的不同等位基因(附图3)，为进一步利用qPC-10基因改良稻米品质提供了快捷的工具。

Claims (4)

1.一种用于培育高蛋白质含量粳稻的分子标记，其特征在于，是鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的分子标记G2，该标记为CAPs标记，位于SEQ ID NO.1的第1455bp。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，该标记的引物序列为：F:5’-TGTGTCACGCCTAATACT-3’(SEQ ID NO.17)，R:5’-ATGAAAGAAGATGTGGTG-3’(SEQ ID NO.18)。
3.一种鉴别水稻中qPC-10基因座位上不同等位基因的方法，其特征在于，用序列如SEQID NO.17-18引物扩增待测水稻中qPC-10基因，扩增产物用限制性内切酶ClaI酶切，能够被限制性内切酶ClaI切开的携带有qPC-10粳型等位基因的片段，不能被切开的则携带qPC-10籼型等位基因的片段。
4.一种培育高蛋白质含量粳稻的方法，具体为以待改良的粳稻品种与一个典型的籼稻品种杂交,再用粳稻品种连续回交。在回交后代中,用分子标记G2的两个引物SEQ IDNO.17-.18对回交群体中的个体基因组DNA进行PCR扩增，扩增的产物采用限制性内切酶ClaI酶切，如果其中一条带不能被切开，则该个体用于继续回交；按此法回交至5代以上，自交获得纯合个体，再用G2标记进行检测，获得在qPC-10座位上带有籼型等位基因的个体/品系。
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