CN109627306B

CN109627306B - 水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位、其抗体及应用

Info

Publication number: CN109627306B
Application number: CN201910073042.0A
Authority: CN
Inventors: 朱岚; 何莹; 曾汉来; 罗雅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109627306A

Abstract

本发明公开了一种水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位、抗水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的多克隆抗体及其制备方法与应用。所述水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。经过多肽合成，多肽与载体蛋白偶联，免疫动物制得抗血清，并经过亲和层析纯化得到谷蛋白GluA2亚基多克隆抗体。本发明制备的多克隆抗体效价高、亲和力强、特异性好，可与水稻谷蛋白GluA2亚基发生特异性结合反应，为谷蛋白基础研究，如对其重要成员的特异性、表达谱和含量的分析，及其相关生理功能的研究提供了一个重要的工具。

Description

水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位、其抗体及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，具体涉及水稻籽粒谷蛋白家族GluA2亚基的抗原表位、特异性抗体及其制备方法和应用。

背景技术

按照经典Osborne的蛋白质分级提取理论，可将水稻籽粒贮藏蛋白(Seed storageprotein,SSP)分为4类：谷蛋白(Glutelin,Glu)、醇溶蛋白、球蛋白和水溶性的白蛋白。其中谷蛋白是稻米SSPs的主要组分，占籽粒中SSPs总含量的80％左右。在大多数谷物中SSPs的氨基酸组成存在赖氨酸含量不足，所以人们普遍认为赖氨酸是谷物SSPs营养水平上的第一限制性氨基酸。水稻籽粒蛋白质是公认的优质植物蛋白质，但对水稻籽粒蛋白质的结构和性质的研究相对较少。因此，水稻SSPs的组成以及优质SSPs组分的利用越来越成为稻米营养品质改良研究中的关注焦点。谷蛋白在水稻SSPs中均由多基因家族编码，分别形成多个亚基的Glu家族和Pro家族。水稻基因组中存在15个Glu基因，其核酸序列相似性高达60％。根据序列同源性，Glu基因家族可以分为三个亚族GluA、GluB和GluC，同亚族中Glu成员之间的序列同源性约80％。亚族GluA中有4个成员GluA1、GluA2、GluA3和GluA4，其中GluA4为假基因；亚族GluB中有7个成员GluB1、GluB2、GluB3、GluB4、GluB5、GluB6和GluB7，其中GluB3为假基因；亚族GluC中，仅有1个成员GluC(曾命名为GluD-1)。

由于蛋白质家族的成员具有氨基酸序列高度同源或者分子量相似等特点，所以对蛋白家族成员进行蛋白分离和鉴定的研究存在一定难度。对水稻Glu家族而言，其亚基分离主要运用单向/双向电泳技术(Sodium dodecyl sulfate/Two-dimension-polyacrylamidegel electrophoresis，SDS/2D-PAGE)和液相色谱技术(High performance liquidchromatography,HPLC)；Glu亚基在分离基础上继续运用质谱技术(Mass spectrometry,MS)和免疫杂交分析(Immunoblotting identification)进行蛋白鉴定。传统的分离和鉴定技术过程复杂并且繁琐，而在多克隆抗体制备过程中由于多个抗原决定簇的存在，重组蛋白的表达和纯化过程中不可避免的会掺入一些杂蛋白，制备的抗体仍有可能存在交叉反应，从而影响抗体的特异性。蛋白质印记技术(Western Blot)利用抗原和抗体特异性结合来定性定量检测复杂样品中某目的蛋白，采用合成抗原表位的方法来制备抗体，即根据预测的抗原表位合成一段多肽作为抗原，多肽合成技术成熟，具有特异性好、灵敏度高、准确性高、操作简便、结果直观和成本低廉等优点，但其应用前提是必须具备特异性高的各组分抗体。

发明内容

本发明的第一个目的是提供水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位及人工合成多肽抗原。

通过软件预测了水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的特性(亲水性、疏水性)及二级结构，得到多个抗原表位序列，综合考虑多肽的长度等因素，确定了一条最有效的抗原表位。其氨基酸序列为TSQWQSSRRGSPRG(如SEQ ID NO:1所示)。

多肽采用9-芴甲氧羰基(FMOC)保护α-氨基进行固相合成。为增强动物的免疫反应，将多肽与载体蛋白偶联。在多肽的C端增加一个半胱氨酸残基，修饰后的多肽的氨基酸序列为TSQWQSSRRGSPRGC(如SEQ ID NO:2所示)，并将其与载体蛋白钥孔血兰蛋白(Keyholelimpet hemacyanin,KLH)偶联，偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯(Succinimidyl4-N-maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate，SMCC)。

本发明的第二个目的是制备谷蛋白GluA2亚基的特异性抗体。

本发明所提供的水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基抗体，是用上述专用抗原免疫动物，再从所免疫的动物中分离、纯化血清得到特异性好、敏感性强的多克隆抗体。免疫动物可以选择兔、小鼠、大鼠、山羊等常用的免疫动物。纯化方法为亲和层析纯化。

本发明的水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基多克隆抗体能应用于基于抗原抗体反应原理来检测目的蛋白的生物技术中，包括免疫印迹、免疫共沉淀和免疫组化等应用技术。本发明提供的多克隆抗体ELISA效价大于64000，具有较高的特异性和灵敏性，制备方法简单，具有工业化生产的可行性。该抗体可对水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基进行检测，并对水稻营养品质改善研究提供依据和线索。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1.本发明合成的GluA2蛋白多克隆抗体对两个水稻品种(9311和罗田红米)不同灌浆时期发育籽粒的疫印迹检测结果。(注：5D，开花后5天；15D，开花后15天；CS，成熟籽粒；CBB，考马斯亮蓝染色；Western Blot，蛋白质印记显色；Glu，谷蛋白；GluA1，谷蛋白A1亚基；GluA2，谷蛋白A2亚基)

具体实施方式

下面将结合实例对本发明的事实方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者条件或者产品说明书进行。

实施例1：候选抗原表位的预测

水稻籽粒Glu家族对应的成员GluA2在GenBank中的基因ID是：Y00687.1，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

所编码的GluA2全长氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

通过搜索蛋白数据库(UniProtKB；http://www.uniprot.org/)，对其氨基酸序列进行序列分析。运用多重序列比对工具(ClustalW2；http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)分析这些谷蛋白家族成员氨基酸序列的多变区、保守区、亲水性、表露性和柔韧性等。运用在线分析软件(PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES；http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html/)预测该谷蛋白亚基的抗原区域，确定该段多肽能唯一识别对应的谷蛋白亚基。

实施例2：合成用于制备GluA2抗体的专用抗原

依据以上序列分析的抗原决定簇的预测结果，在Glu亚基特异性抗原决定簇多肽序列的C端加上一个半胱氨酸残基(Cysteine residue，Cys)进行抗原序列的合成TSQWQSSRRGSPRGC(如SEQ ID NO:2所示)，并经由SMCC偶联一个大分子载体-匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)形成GluA2亚基抗体的专用抗原，冻干保存在-80℃。

实施例3：多克隆抗体血清的制备

免疫动物选择年龄在三个月左右、体重2kg以上的健康新西兰大白兔，以实施例2中制备的抗原免疫动物。具体步骤如下：首先对每只兔子进行免疫前诱导，通过四肢、腋下及背部皮下注射0.5mL弗氏完全佐剂，刺激局部免疫反应，一周后进行首次免疫。首次免疫前，经耳静脉取血作为阴性对照。将抗原用PBS(137mM NaCl,2.7mM KCl,10mM Na₂HPO₄,2mMKH₂PO₄,pH 7.4)稀释至1mg·mL^-1，分装后储存于-20℃。取500μL的1mg·mL^-1抗原(即0.5mg)加入300μL PBS再次稀释，然后加入等体积的弗氏完全佐剂(首次免疫)或弗氏不完全佐剂(第二次至第四次免疫)。对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，首次免疫两周后进行第二次免疫，以后每间隔两周加强一次(共进行4次免疫)。第三次免疫12天后，经耳静脉取血测定抗体效价。达到要求者于第四次免疫11天后颈动脉放血，收集血样。将血样静置于4℃过夜或者37℃温育3h，在4℃条件下，5000rpm离心10min，收集血清，分装后-80℃保存。

实施例4：GluA2亚基抗体的制备以及纯化

GluA2亚基合成多肽亲和层析柱的制备，具体如下。称取1g CNBr活化的Sepharose4B(Pharmacia)干粉，用1mM HCl充分溶胀、浸洗凝胶后，再用连接缓冲液冲洗2次，迅速与溶解有5mg合成多肽TSQWQSSRRGSPRGC(如SEQ ID NO:2所示)的连接缓冲液(0.1M NaHCO₃,0.5M NaCl,pH8.3)混合，室温下旋转混合1小时后，用5倍凝胶体积的连接缓冲液冲洗凝胶，洗去未结合的多肽，然后将凝胶转移至0.1M Tris-HCl，pH 8.0缓冲液中装柱，以封闭凝胶上的活化基团，静置2小时后，用5倍凝胶体积的高pH溶液(0.1M CH₃COONa,pH4.0,0.5MNaCl)和低pH溶液(0.1M Tris-HCl,pH 8.0,0.5M NaCl)交替洗凝胶三次，再用10倍凝胶体积的TBS缓冲液(50mM Tris–HCl,pH7.5,150mM NaCl)平衡柱子。

随后进行亲和层析纯化抗多肽抗体。将20mL血清用TBS缓冲液稀释5倍，并用孔径为0.45μm的混合纤维素膜过滤，以除去血细胞等杂质。将过滤后的血清溶液以0.5mL·min^-1的速度加入层析柱内，为保证抗血清与填料的结合，需连续上柱两次。用TBS清洗层析柱至洗脱液的A_280nm＜0.008后，用洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，pH 2.7)以相同的速度洗脱，用事先加入中和缓冲液(1M Tris-HCl,pH 8.0,1.5M NaCl,1mM EDTA)的离心管收集洗脱液，混匀后用pH试纸检查溶液的pH，如果pH低于7.4，可用中和缓冲液调至约pH7.4，以防止抗体变性，同时加入等体积的甘油，保存在-20℃条件下，既得纯化好的多克隆抗体。

纯化好的抗体稀释成不同的浓度，并分别与抗原多肽进行ELISA反应，并在450nm的波长下测其吸光度(A₄₅₀)，同时以PBS作为空白对照。当抗体浓度稀释为64000倍时吸光度为0.49，而空白对照的吸光度为0.026，两者比值为18.85远远大于3。表明该抗体ELISA效价大于64000，具有非常高的灵敏性。(详见表1)

表1 GluA2蛋白多克隆抗体ELISA测定的效价结果

注：稀释64000倍后的样品和空白的比值为18.85>3。

实施例5：多克隆抗体对GluA2亚基的特异性检验

首先进行稻米总谷蛋白提取，具体方法如下。将成熟稻米去壳，在液氮下磨成粉末。取30mg米粉样品，加入800μL的谷蛋白提取液(1％乳酸，v/v)，震荡均匀2h。经过12000rpm离心20min后，重复3次，收集上清液，随后将上清液用NaOH溶液滴定至中性，收集沉淀即为谷蛋白。将得到的谷蛋白用电泳样品buffer(0.5M Tris-HCl，0.1％溴酚蓝，10％SDS，20％甘油，10％β-巯基乙醇)溶解，随后进行样品蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并用考马斯亮蓝(CBB)染色后，用含有冰醋酸的脱色液脱去凝胶的背景色，呈现出若干分子量不同的谷蛋白亚基条带。为了更好的验证所合成的GluA2多克隆抗体的特异性，按照前面所述的方法分别提取两个水稻品种(9311和罗田红米)的不同灌浆时期籽粒(开花后5天、15天和成熟期)的谷蛋白，得到的谷蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将转印好的硝酸纤维膜用来做抗体Western杂交。分别使用实施例4中制备的GluA2多克隆抗体及本实验室已有的GluA1抗体作为一抗，用含有0.05％Tween-20的封闭液以1:500的比例稀释后，与封闭好的膜在37℃下侵润，孵育1h。用含有0.05％Tween-20的封闭液以1:5000的比例稀释AP标记的山羊抗兔二抗(北京康为世纪，CW0111)，与洗好的膜在37℃下侵润，孵育1h。将膜浸泡在显色液AP底物缓冲液(0.1M Tris–HCl,pH9.5,0.5mM MgCl₂，0.33μg·mL^-1NBT,0.165μg·mL^-1BCIP)中显色，直至条带清晰(约5～10min)。结果显示，以本实验室已有的GluA1抗体为一抗杂出GluA1亚基蛋白条带位置明显区别于GluA2亚基，且有隐约的双条带(图1)。而在两个水稻品种的各个不同时期籽粒中以合成的GluA2多克隆抗体作为一抗杂交均得到单一的GluA2亚基条带，条带清晰明显，表明该抗体具有很好的特异性，且在不同的水稻的品种及不同灌浆时期均可以应用，适用范围广。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对一些细节进行替换和修改，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位、其抗体及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Thr Ser Gln Trp Gln Ser Ser Arg Arg Gly Ser Pro Arg Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Thr Ser Gln Trp Gln Ser Ser Arg Arg Gly Ser Pro Arg Gly Cys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 1497

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

atggcatcca taaatcgccc catagttttc ttcacagttt gcttgttcct cttgtgcgat 60

ggctccctag cccagcagct attaggccag agcactagtc aatggcagag ttctcgtcgt 120

ggaagtccga gaggatgtag atttgatagg ttgcaagcat ttgagccaat tcggagtgtg 180

aggtctcaag ctggcacaac tgagttcttc gatgtctcta atgagttgtt tcaatgtacc 240

ggagtatctg ttgtccgccg agttattgaa cctagaggcc tactactacc ccattacact 300

aatggtgcat ctctagtata tatcatccaa gggagaggta taacagggcc gactttccca 360

ggctgtcctg agacctacca gcagcagttc caacaatcag ggcaagccca attgaccgaa 420

agtcaaagcc aaagccataa gttcaaggat gaacatcaaa agattcaccg tttcagacaa 480

ggagatgtta tcgcgttgcc tgctggtgta gctcattggt gctacaatga tggtgaagtg 540

ccggttgttg ccatatatgt cactgatatc aacaacggtg ctaatcaact tgaccctcga 600

cagagggatt tcttgttagc tggaaataag agaaaccctc aagcatacag gcgtgaagtt 660

gaggagtggt cacaaaacat atttagtggc tttagcactg aactgcttag cgaggctttt 720

ggcataagca accaagttgc aaggcagctc cagtgtcaaa atgaccaaag aggagaaatt 780

gtccgcgttg aacgcgggct cagtttgctg caaccatatg catcattgca agagcaggaa 840

caaggacaaa tgcaatcaag agagcattat caagaaggag gatatcagca aagtcaatat 900

gggagtggct gccctaacgg tttggatgag accttttgca ccatgagggt aaggcaaaac 960

atcgataatc ctaaccgtgc tgatacatac aacccaagag ctggaagggt tacaaatctc 1020

aacagccaga atttccccat tcttaatctt gtacagatga gcgccgttaa agtaaatcta 1080

taccagaatg cactcctttc accgttctgg aacatcaacg ctcacagcat cgtgtatatt 1140

actcaaggcc gagcccaggt tcaagttgtc aacaacaatg gaaagacggt gttcaacgga 1200

gagcttcgtc gtggacagct acttattgta ccacaacact atgtagttgt aaagaaggca 1260

caaagagaag gatgtgctta cattgcattc aagacaaacc ctaactctat ggtaagccac 1320

attgcaggaa agagttccat cttccgtgct ctcccaactg atgttctagc aaatgcatat 1380

cgcatctcaa gagaagaggc tcagaggctc aagcataaca gaggagatga gttcggtgca 1440

ttcactcccc tccaatacaa gagctaccaa gacgtttata atgtggcgga atcctct 1497

<210> 4

<211> 499

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

Met Ala Ser Ile Asn Arg Pro Ile Val Phe Phe Thr Val Cys Leu Phe

1 5 10 15

Leu Leu Cys Asp Gly Ser Leu Ala Gln Gln Leu Leu Gly Gln Ser Thr

20 25 30

Ser Gln Trp Gln Ser Ser Arg Arg Gly Ser Pro Arg Gly Cys Arg Phe

35 40 45

Asp Arg Leu Gln Ala Phe Glu Pro Ile Arg Ser Val Arg Ser Gln Ala

50 55 60

Gly Thr Thr Glu Phe Phe Asp Val Ser Asn Glu Leu Phe Gln Cys Thr

65 70 75 80

Gly Val Ser Val Val Arg Arg Val Ile Glu Pro Arg Gly Leu Leu Leu

85 90 95

Pro His Tyr Thr Asn Gly Ala Ser Leu Val Tyr Ile Ile Gln Gly Arg

100 105 110

Gly Ile Thr Gly Pro Thr Phe Pro Gly Cys Pro Glu Thr Tyr Gln Gln

115 120 125

Gln Phe Gln Gln Ser Gly Gln Ala Gln Leu Thr Glu Ser Gln Ser Gln

130 135 140

Ser His Lys Phe Lys Asp Glu His Gln Lys Ile His Arg Phe Arg Gln

145 150 155 160

Gly Asp Val Ile Ala Leu Pro Ala Gly Val Ala His Trp Cys Tyr Asn

165 170 175

Asp Gly Glu Val Pro Val Val Ala Ile Tyr Val Thr Asp Ile Asn Asn

180 185 190

Gly Ala Asn Gln Leu Asp Pro Arg Gln Arg Asp Phe Leu Leu Ala Gly

195 200 205

Asn Lys Arg Asn Pro Gln Ala Tyr Arg Arg Glu Val Glu Glu Trp Ser

210 215 220

Gln Asn Ile Phe Ser Gly Phe Ser Thr Glu Leu Leu Ser Glu Ala Phe

225 230 235 240

Gly Ile Ser Asn Gln Val Ala Arg Gln Leu Gln Cys Gln Asn Asp Gln

245 250 255

Arg Gly Glu Ile Val Arg Val Glu Arg Gly Leu Ser Leu Leu Gln Pro

260 265 270

Tyr Ala Ser Leu Gln Glu Gln Glu Gln Gly Gln Met Gln Ser Arg Glu

275 280 285

His Tyr Gln Glu Gly Gly Tyr Gln Gln Ser Gln Tyr Gly Ser Gly Cys

290 295 300

Pro Asn Gly Leu Asp Glu Thr Phe Cys Thr Met Arg Val Arg Gln Asn

305 310 315 320

Ile Asp Asn Pro Asn Arg Ala Asp Thr Tyr Asn Pro Arg Ala Gly Arg

325 330 335

Val Thr Asn Leu Asn Ser Gln Asn Phe Pro Ile Leu Asn Leu Val Gln

340 345 350

Met Ser Ala Val Lys Val Asn Leu Tyr Gln Asn Ala Leu Leu Ser Pro

355 360 365

Phe Trp Asn Ile Asn Ala His Ser Ile Val Tyr Ile Thr Gln Gly Arg

370 375 380

Ala Gln Val Gln Val Val Asn Asn Asn Gly Lys Thr Val Phe Asn Gly

385 390 395 400

Glu Leu Arg Arg Gly Gln Leu Leu Ile Val Pro Gln His Tyr Val Val

405 410 415

Val Lys Lys Ala Gln Arg Glu Gly Cys Ala Tyr Ile Ala Phe Lys Thr

420 425 430

Asn Pro Asn Ser Met Val Ser His Ile Ala Gly Lys Ser Ser Ile Phe

435 440 445

Arg Ala Leu Pro Thr Asp Val Leu Ala Asn Ala Tyr Arg Ile Ser Arg

450 455 460

Glu Glu Ala Gln Arg Leu Lys His Asn Arg Gly Asp Glu Phe Gly Ala

465 470 475 480

Phe Thr Pro Leu Gln Tyr Lys Ser Tyr Gln Asp Val Tyr Asn Val Ala

485 490 495

Glu Ser Ser

Claims

1.一种水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的抗原表位，其多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的抗原表位在制备水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基多克隆抗体中的应用。

3.一种水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基多克隆抗体的制备方法，其特征在于：首先对权利要求1中所述多肽的氨基酸序列进行末端修饰，在所述的氨基酸序列的C端增加一个半胱氨酸残基，然后将修饰后的多肽经过固相合成并与载体蛋白偶联，得到抗原，用抗原免疫动物后，取动物的多抗血清并从中分离纯化多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法，其特征在于：修饰后的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法，其特征在于：所述载体蛋白为钥孔戚血兰蛋白，偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯。

6.根据权利要求3所述的多克隆抗体制备方法，其特征在于：所述纯化方法为亲和层析法。

7.根据权利要求3-6任何一项所述的制备方法得到的多克隆抗体。

8.权利要求7所述的多克隆抗体在检测水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基中的应用。

9.一种检测水稻籽粒谷蛋白GluA2亚基的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）提取稻米籽粒总蛋白；

2）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上；

3）以权利要求7所述的多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG为二抗，进行免疫印迹检测，

所述多克隆抗体是用所述抗原免疫兔得到的多克隆抗体。