CN111718912B

CN111718912B - 黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽及其抗体与应用

Info

Publication number: CN111718912B
Application number: CN202010429423.0A
Authority: CN
Inventors: 何莹; 孙玉珺; 罗雅; 汪倩; 曾汉来
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2040-05-20
Also published as: CN111718912A

Abstract

本发明公开了一种黄烷酮‑3‑羟化酶抗原表位肽及其融合蛋白和其特异性抗体，以及抗体的制备方法与应用。所述黄烷酮‑3‑羟化酶抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明的特异性抗体，本发明制备的多克隆抗体亲和力强、特异性好，灵敏度高、操作简便，可与水稻黄烷酮‑3‑羟化酶发生特异性结合反应，且制备成本低，得率高，为水稻黄烷酮‑3‑羟化酶的相关生理功能研究及鉴定提供了一个重要的工具。

Description

黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽及其抗体与应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽、融合蛋白、黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体及其制备方法与应用。

背景技术

植物体中的类黄酮化合物因具有一定药用价值而备受科学家关注，花色苷是一种水溶性黄酮类化合物，属于类黄酮次生代谢产物，在植物各种器官和组织中均有不同含量的分布，在花色形成、果实着色等过程中起着关键的作用。大量研究证实，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、保护心脑血管、抗肿瘤和抗炎症等多种药用价值。花色苷的合成是一个多酶反应途径，其中黄烷酮-3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是多酶生物合成途径中关键酶之一。因此，研究类黄酮合成途径关键酶可以为植物次生代谢物积累机制提供基础生理和分子研究支持，为其药用研究提供基础。

F3H作为黄酮醇、花青素和原花青素合成途径的共有关键酶，是整个类黄酮合成途径枢纽位点。F3H属于依赖型2-酮戊二酸双加氧酶（2-ODD）家族，反应需要依赖铁、分子氧、2-酮戊二酸和抗坏血酸等作为辅助因子，具有底物特异性，其作用是催化柚皮素的C3位羟基化，生成二氢山奈素。F3H以柚皮素为作用底物，参与黄酮和花青素合成代谢途径的调控，是代谢过程中的关键酶。F3H基因最早从金鱼草中分离得到，经过对矮牵牛的分析和研究发现，F3H是一种单体蛋白。目前已陆续从拟南芥、矮牵牛、玉米、甘蓝型油菜、苜蓿、苹果、康乃馨、银杏及苦荞等多种植物中克隆得到F3H基因。

由于蛋白质家族的成员众多，所以对植物中花色苷生物合成关键酶分析鉴定主要运用单向/双向电泳技术和液相色谱联合质谱技术。其鉴定仪器贵鉴定技术过程复杂并且繁琐，而在多克隆抗体制备过程中由于多个抗原决定簇的存在，重组蛋白的表达和纯化过程中不可避免的会掺入一些杂蛋白，制备的抗体仍有可能存在交叉反应，从而影响抗体的特异性。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽、黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体及其制备方法与应用，本发明发掘了一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽；该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原；所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，该抗体具有很高的灵敏性。

本发明是这样实现的：

本发明目的之一在于提供一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽可直接通过公司合成得到；或通过构建含有所述氨基酸序列所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽。

本发明的目的之二在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽和任选的标签序列。

优选地，所述的标签序列为在所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽的C端增加的1个半胱氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述标签序列半胱氨酸Cys上的巯基通过偶联剂偶联有载体蛋白。

更为优选地，所述载体蛋白为钥孔戚血蓝蛋白，所述偶联剂为琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯。

所述的融合蛋白可直接通过公司合成得到或先合成黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽经改造后得到；或通过构建含有所述融合蛋白所对应的核苷酸的表达载体，然后将所述表达载体转染进宿主细胞表达得到所述的融合蛋白。

本发明的目的之三在于提供一种黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，所述抗体特异性的结合所述的抗原表位肽或所述的融合蛋白，并且所述抗体能够特异性地结合天然的黄烷酮-3-羟化酶蛋白和/或突变的黄烷酮-3-羟化酶蛋白。

本发明的目的之四在于提供一种黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体的制备方法，将所述的抗原表位肽或所述的融合蛋白免疫动物，取血清从中分离纯化得到的多克隆抗体即为该黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体。

优选地，使用亲和层析柱进行多克隆抗体的分离纯化，所述亲和层析柱含有溴化氰活化琼脂糖填料，洗脱缓冲液是pH2.7的50mM甘氨酸，所制得的抗体具有较高的纯度、得率和效价。

本发明的目的之五在于提供所述的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体的用途，用于黄烷酮-3-羟化酶的检测；或制备检测花黄烷酮-3-羟化酶的试剂或试剂盒。

具体地，可将所述的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体用于有色作物红米的黄烷酮-3-羟化酶检测。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次发掘了一种黄烷酮-3-羟化酶F3H抗原表位肽，该抗原表位肽经修饰后经过固相合成并与载体蛋白偶联得到融合蛋白作为人工合成抗原，所述人工合成抗原免疫动物经分离纯化得到本发明的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体，该抗体可对有色稻中黄烷酮-3-羟化酶F3H进行检测，该抗体具有特异性强、灵敏度高、准确性高、操作简便、结果直观和成本低廉等优点。且制备方法操作简单，具有工业化生产的可行性。

附图说明

图1为本发明制备的特异性抗体蛋白免疫印迹检测红米RM1、白米9311中的黄烷酮-3-羟化酶，5个泳道从左至右分别为marker、两品种花后5天、10天、15天以及成熟期颖果的蛋白免疫印迹。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 候选黄烷酮-3-羟化酶F3H抗原表位的发掘和多肽抗原的合成

1、以特种水稻（Oryza sative L）“罗田红米”（简称RM1）为研究对象，其黄烷酮-3-羟化酶F3H的基因F3H-2（Os10g0536400），核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码的氨基酸全长序列如SEQ ID NO：4所示。分析氨基酸序列的亲水性、表露性和柔韧性等，在该蛋白的N端选出了一端氨基酸序列CRTHGFFQVVNHGI，如SEQ ID NO：1所示，该序列位于SEQ ID NO： 4中的第64-77位氨基酸序列，经过BLAST对比数据库，确定该段多肽能代表植物黄烷酮-3-羟化酶（水稻Os-F3H）抗原表位。

2、依据以上序列分析的抗原决定簇的预测结果，在黄烷酮-3-羟化酶F3H特异性抗原决定簇多肽序列的C端加上一个半胱氨酸残基（Cysteine residue，Cys），通过9-芴甲氧羰基保护α-氨基进行固相合成抗原序列（SEQ ID NO：2），并经由琥珀酰亚胺-4-环已烷-1-碳酸酯为偶联剂偶联一个大分子载体匙孔血蓝蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）形成抗原，冻干保存在-80℃。

实施例2 黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体anti-F3H的制备

免疫动物选择年龄为3个月左右、体重2kg以上的健康新西兰大白兔。对兔子进行免疫前诱导，通过四肢、腋下及背部皮下注射0.5mL弗氏完全佐剂，刺激局部免疫反应。7天后进行首次免疫，同时对首次免疫前兔子耳静脉取血作为阴性对照。首次免疫试剂为上述抗原用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，pH7.4)稀释，取500μL的1mg·mL^-1抗原（即0.5mg），然后加入1400μL的弗氏完全佐剂（首次免疫）或700μL弗氏不完全佐剂（第二次至第四次免疫），并在涡旋仪上混匀和乳化。对兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射，每隔两周免疫一次。从兔子颈部动脉取血，每只兔子的取血量为50-100mL，待纯化。

通过溴化氰活化琼脂糖填料（CNBr-Sepharose4B）和上述多肽抗原制备亲和层析柱进行纯化抗体。将20mL血清用TBS缓冲液稀释，用混合纤维素膜（孔径为0.45μm）过滤。将过滤后溶液加入层析柱内，需连续上柱两次。用TBS清洗层析柱至洗脱液A_280nm＜0.008后，用洗脱缓冲液(50mM甘氨酸，pH2.7)以相同的速度洗脱目的蛋白并收集，中和缓冲液调至pH7.3以防止抗体变性，同时加入等体积的甘油，保存在-20℃条件下，即得纯化好的特异性抗体anti-F3H。经检测纯化抗体的最高浓度为2mg/mL，20mL血清共纯化出25mg抗体，表明多克隆抗体的得率高。

免疫动物血清的ELISA检测：将SEQ ID NO：2所述的融合蛋白稀释至1μg/mL，每孔100μL包被96孔酶联板，4℃过夜。用TBST洗涤3次，封闭2h，将上述的血清中的纯化抗体进行梯度稀释，37℃反应1h（同时取免疫前的血清作为阴性对照）；用TBST洗涤3次后二抗孵育；用TBST洗涤后加入TMB显色；终止反应后用酶标仪检测A_450nm值，以P/N≥2.1的抗体最大稀释度作为效价终值。间接ELISA方法检测结果为所述纯化好的特异性抗体anti-F3H的效价1×10⁵。且实验组显色，阴性对照组（免疫前的血清）不显色，表明本发明的SEQ ID NO：2所述的融合蛋白作为抗原具有良好的免疫原性和抗原性。

实施例3 黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体anti-F3H的应用

分别提取红米RM1和白米9311籽粒总蛋白。称取籽粒0.2g样品于2mL灭菌离心管中，加入800μL预冷提取缓冲液[62.5mM tris-Hcl (pH 7.4)， 10%（v/v）甘油，0.1% SDS，2mM EDTA，1mM PMSF，5%（v/v）β-巯基乙醇]，将其混合涡旋后在冰上放置30min。样品12000rpm/min，4℃，离心20min，取上清分装并存于-80℃冰箱备用。

抗体anti-F3H在检测关键酶F3H含量时，可采用蛋白免疫印迹方法。蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳分离并经槽式转印系统快速转印至硝酸纤维素膜上。使用实施例2中制备的特异性抗体anti-F3H，用含有0.05% Tween-20的封闭液以1:2000的比例稀释后，将硝酸纤维素膜置入孵育1h。用AP标记的山羊抗兔二抗（北京康为世纪，CW0111），将硝酸纤维素膜置入孵育1h。硝酸纤维素膜使用碱性磷酸酶缓冲液（0.1M Tris–HCl，0.5mM MgCl₂，0.33μg/mL NBT，0.165μg/mL BCIP，pH9.5）中显色。

结果如图1所示，抗体在经1:2000稀释后仍能检测到红米品种RM1籽粒中的黄烷酮-3-羟化酶F3H，说明制备得到的抗体效价高，亲和力强。且水稻籽粒的泳道有目标条带，分子量约为38kD，与目标结果一致；而在白米品种9311籽粒中并未检测到黄烷酮-3-羟化酶F3H，表明本发明的黄烷酮-3-羟化酶F3H具有很高的特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 华中农业大学

<120> 黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽及其抗体与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sative L)

<400> 1

Cys Arg Thr His Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Ile

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

Cys Arg Thr His Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Ile Cys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 534

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sative L)

<400> 3

atggcggcgg aggcggagca gcagcaccag ctgctgtcga cggccgtgca cgacacgatg 60

ccggggaagt acgtccgccc ggagtcgcag cgcccgcgcc tcgacctcgt cgtctccgac 120

gcccgcatcc ccgtcgtcga cctcgcctcc cccgaccgcg ccgccgtcgt ctccgccgtc 180

ggcgacgcct gccgcaccca cggcttcttc caggtggtga accatggcat cgatgcggcg 240

ctgatcgcgt cggtcatgga ggtgggccgc gagttcttcc ggctgccggc ggaggagaag 300

gcgaagctct actccgacga tccggccaag aagatacggc tgtcgacgag cttcaacgtg 360

cgcaaggaga cggtgcacaa ctggcgcgat tacctccgcc tccactgcta tcctctccac 420

cagttcgtcc ccgactggcc ctccaatccg ccctccttca aggagatcat cggcacgtac 480

tgcacagagg taagagagct agggttcagg ctatacgagt cgacattaaa accg 534

<210> 4

<211> 178

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sative L)

<400> 4

Met Ala Ala Glu Ala Glu Gln Gln His Gln Leu Leu Ser Thr Ala Val

1 5 10 15

His Asp Thr Met Pro Gly Lys Tyr Val Arg Pro Glu Ser Gln Arg Pro

20 25 30

Arg Leu Asp Leu Val Val Ser Asp Ala Arg Ile Pro Val Val Asp Leu

35 40 45

Ala Ser Pro Asp Arg Ala Ala Val Val Ser Ala Val Gly Asp Ala Cys

50 55 60

Arg Thr His Gly Phe Phe Gln Val Val Asn His Gly Ile Asp Ala Ala

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ser Val Met Glu Val Gly Arg Glu Phe Phe Arg Leu Pro

85 90 95

Ala Glu Glu Lys Ala Lys Leu Tyr Ser Asp Asp Pro Ala Lys Lys Ile

100 105 110

Arg Leu Ser Thr Ser Phe Asn Val Arg Lys Glu Thr Val His Asn Trp

115 120 125

Arg Asp Tyr Leu Arg Leu His Cys Tyr Pro Leu His Gln Phe Val Pro

130 135 140

Asp Trp Pro Ser Asn Pro Pro Ser Phe Lys Glu Ile Ile Gly Thr Tyr

145 150 155 160

Cys Thr Glu Val Arg Glu Leu Gly Phe Arg Leu Tyr Glu Ser Thr Leu

165 170 175

Lys Pro

Claims

1.一种黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白由权利要求1所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽和标签序列组成，所述的标签序列为在所述的黄烷酮-3-羟化酶抗原表位肽的C端增加的1个半胱氨酸，所述半胱氨酸的巯基上偶联有载体蛋白。

3.如权利要求2所述的的融合蛋白，其特征在于：所述载体蛋白为钥孔戚血蓝蛋白。

4.一种黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述的融合蛋白免疫动物，取血清从中分离纯化得到的多克隆抗体即为黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体。

5.如权利要求4所述黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体的制备方法，其特征在于：使用亲和层析柱进行多克隆抗体的分离纯化，所述亲和层析柱含有溴化氰活化琼脂糖填料，洗脱缓冲液是pH2.7的50mM甘氨酸。

6.权利要求4或5所述的制备方法得到的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体。

7.权利要求6所述的黄烷酮-3-羟化酶特异性抗体的用途，其特征在于：用于有色作物红米的黄烷酮-3-羟化酶的检测；或制备检测有色作物红米的黄烷酮-3-羟化酶的试剂或试剂盒。