CN103789308A - 一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法 - Google Patents

一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法 Download PDF

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姜树坤
徐正进
张凤鸣
王嘉宇
白良明
孙世臣
丁国华
王彤彤
张喜娟
姜辉
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Abstract

本发明涉及一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法，所述分子标记包括32对SSR标记，覆盖了水稻12条染色体，其中第4、6和9号染色体上有1个标记，第5、7、8和10号染色体上各有2个标记，第2、3和12染色体上各有3个标记，第1和11染色体上各有6个标记；该鉴定过程为步骤a，DNA提取；步骤b，PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each of dNTPs，0.2μM of each primer，5％(v／v)dimethyl sulfoxide and 0.5U Taq DNA聚合酶；步骤c，PCR产物检测;步骤d，统计分析。本发明的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法，能够检测待测粳稻材料的遗传多样性及彼此间的遗传差异，对粳稻遗传多样性分析的分子标记进行筛选。

Description

一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法
技术领域
本发明涉及水稻育种中的检测技术领域，尤其涉及适用于粳稻品种资源多样性评价及粳稻分子辅助育种中检测亲本遗传差异。
背景技术
水稻的遗传改良和突破性品种的选育均主要依赖于种质资源的掌握和利用。只有了解育种材料的遗传变异信息，才能有针对性地选择亲本，在后代中获得较大的杂种优势，从而培育出优良品种。因此，亲本遗传多样性的分析对于水稻新品种的选育具有重要意义。
近些年，由于水稻全基因组测序工作已经完成，在此基础上，对有利基因进行剪切、聚合和改良，进行设计育种以培育在产量、品质、抗逆性等多方面都具有强优势的水稻新品种已成为未来水稻育种必然趋势。其核心技术之一便是标记辅助选择和全基因组设计，而二者的重要基础就是育种亲本材料遗传差异的确定。此外，粳稻以其优于籼稻的优良食味获得了越来越多人的喜爱，但粳稻品种存在的遗传差异较小问题，使得选择差异较大粳稻作为亲本进而获得较大杂种优质变得越发困难。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本创作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法，用以克服上述技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，所述分子标记包括32对SSR标记，覆盖了水稻12条染色体，其中第4、6和9号染色体上有1个标记，第5、7、8和10号染色体上各有2
个标记，第2、3和12染色体上各有3个标记，第1和11染色体上各有6个标记。
进一步，上述分析标记获取时，采用亲缘关系较近的日本粳稻品种一目惚、丰锦、笸锦、日本晴、秋田小町；东北稻区导入少量籼稻血缘的沈农265、辽粳263、辽粳294；以及广亲和粳稻02428为材料。
进一步，所述分子标记以PIC值>0.50作为参考指标。
本发明还提供一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，该具体过程为：
步骤a，DNA提取；
步骤a1，取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；
步骤a2，加入预热至65℃的CTAB抽提液；
步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；
步骤a4,取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；
步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上;
步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；
步骤a8，用100μL的TE缓冲液回溶待用；
步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增。
步骤b，PCR扩增;PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mMTris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each ofdNTPs，0.2μM of each primer，5％(v／v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA聚合酶;
步骤c，PCR产物检测;
在上述步骤b中的扩增产物中加入上样缓冲液，取5μL上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，接通电极，在80W的恒定功率下电泳2-3小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色，照相统计。
步骤d，统计分析；具体为：
步骤d1，对标记位点的多态性信息量(PIC值)进行计算；
步骤d2，遗传多样性分析，计算各材料间的遗传距离GD。
进一步，上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包括2％(w／v)CTAB；100mmol／LTris-Hcl，pH8.0；20mmol／LEDTA，pH8.0；1.4mol／LNaCl]600μL。
进一步，上述步骤d2中，PIC值依据下述公式计算，
PIC=1-∑fi2
式中，fi表示i位点的基因频率。
进一步，在上述步骤d2中，对遗传多样性分析时，将扩增产物的每一条带视为一个位点，具有多态性的条带赋值为″1"，无此带时赋值为″0″。
进一步，在上述步骤d2中，
各材料间的遗传距离GD按下式计算：
GD=-ln2Nxy／(Nx+Ny)，
式中Nxy为材料x、y的公共条带数，Nx为材料x的条带数，Ny为材料y的条带数。
进一步，在上述步骤b中，采用ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，550℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环;最后72℃延伸8min。
进一步，在上述步骤a8中，所述TE缓冲液包括10mmol／LTris-Hcl;1mmol／LEDTA，pH8.0。
与现有技术相比较本发明的有益效果在于：本发明的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记及其鉴定方法，能够检测待测粳稻材料的遗传多样性及彼此间的遗传差异，对粳稻遗传多样性分析的分子标记进行筛选。
附图说明
图1A为本发明所用材料的489个标记的聚类比较图;
图1B为本发明所用材料的32个标记的聚类比较图。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
本发明采用亲缘关系较近的日本粳稻品种一目惚、丰锦、笸锦、日本晴、秋田小町；东北稻区导入少量籼稻血缘的沈农265、辽粳263、辽粳294；以及广亲和粳稻02428为材料，通过筛选均匀分布于水稻12条染色体上的489对分子标记，以PIC值>0.50作为主要参考指标确定了适于粳稻遗传多样性分析的32对SSR引物。
这些引物可以很好的反应这些粳稻材料的遗传多样性及彼此间的遗传差异，可以用于粳稻品种资源的大规模评价及育种亲本筛选。
本发明分子标记包括32对SSR标记，覆盖了水稻12条染色体，其中第4、6和9号染色体上有1个标记，第5、7、8和10号染色体上各有2个标记，第2、3和12染色体上各有3个标记，第1和11染色体上各有6个标记。
该分子标记的鉴定过程为：
步骤a，DNA提取;
步骤a1，取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；
步骤a2，加入预热至65c的CTAB抽提液[2％(w／v)CTAB;
100mmol／LTris-Hcl，pH8.0；20mmol／LEDTA，pH8.0；
1.4mol／LNaCl]600μL；
步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀;
步骤a4,取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中;
步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上;
步骤a7,此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干;
步骤a8，用100μL的TE缓冲液(10mmol／LTris-Hcl；1mmol／LEDTA，pH8.0)回溶待用；
步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增。
步骤b，PCR扩增；PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mMTris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each ofdNTPs，0.2μM of each primet，5％(v／v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA聚合酶；
本实施例采用ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5min；每个循环94℃预变性1min，550c退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸8min。
步骤c，PCR产物检测；
在上述步骤b中的扩增产物中加入上样缓冲液，取5μL上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，接通电极，在80W的恒定功率下电泳2-3小时，关闭电源；取下凝胶，银染显色，照相统计。
步骤d，统计分析；
步骤d1，PIC值计算：标记位点的多态性信息量(Polymorphisminformation content，PIC)依据下述公式计算，
PIC=1-∑fi2
式中，fi表示i位点的基因频率。
PIC值的大小不仅与检测位点的等位片段数有关，而且与这些等位片段在试验材料中的分布频率有关。不同位点检测到相同的等位片段数时，各等位片段分布频率均匀的位点具有较高的PIC值。
步骤d2,遗传多样性分析：将扩增产物的每一条带视为一个位点，具有多态性的条带赋值为″1"，无此带时赋值为″0″。
将数据输入NTSYSpc2.1软件中，各材料间的遗传距离GD按下式计算：
GD=-ln2Nxy／(Nx+Ny)，
式中Nxy为材料x、y的公共条带数，Nx为材料x的条带数，Ny为材料y的条带数。
根据所得的遗传距离，采用算术平均非加权聚类法(unweighted pairgroup method with arithmetic averages UPGMA)进行聚类分析，并通过NTSYSpc2.1软件绘制树状图。
请参阅表1所示，其为本发明32个用于粳稻遗传多样性分析的引物的基本信息表。
表1
请参阅图1A所示其为本发明所用材料的489个标记的聚类比较图，图1B为本发明所用材料的32个标记的聚类比较图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，.其特征在于，所述分子标记包括32对SSR标记，覆盖了水稻12条染色体，其中第4、6和9号染色体上有1个标记，第5、7、8和10号染色体上各有2个标记，第2、3和12染色体上各有3个标记，第1和11染色体上各有6个标记。
2.根据权利要求1所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，其特征在于，上述分析标记获取时，采用亲缘关系较近的日本粳稻品种一目惚、丰锦、笸锦、日本晴、秋田小町；东北稻区导入少量籼稻血缘的沈农265、辽粳263、辽粳294；以及广亲和粳稻02428为材料。
3.根据权利要求2所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记，其特征在于，所述分子标记以PIC值>0.50作为参考指标。
4.一种用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，该具体过程为：
步骤a，DNA提取；
步骤a1，取长至10cm左右黄化苗4-5株剪碎，放于研钵中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量离心管(EP)中；
步骤a2,加入预热至65℃的CTAB抽提液；
步骤a3，轻轻混匀，使粉末充分散开，呈悬浮状态，放于60℃的水浴30-60min，期间每5min轻轻倒转离心管使之分散均匀；
步骤a4,取出后，待冷至室温后加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温振荡，充分混匀，然后于台式冷冻离心机上10000rpm离心10min，取上清液转入另一离心管中；
步骤a5，重复3-4次，直至中间没有蛋白层为止；
步骤a6，将上清液逐滴加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇中，-20℃放置30min以上;
步骤a7，此时可见DNA成棉絮状小团漂于液面，用玻璃钩勾出，以灭菌的滤纸条吸去残液，在超净工作台上吹干；
步骤a8，用100μL的TE缓冲液回溶待用；
步骤a9，取1.5μL用于PCR扩增;
步骤b，PCR扩增;PCR反应体系为15μL，含50mM KCl，10mMTris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM MgCl2，200μM each ofdNTPs，0.2μM of each primer，5％(v／v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA聚合酶；
步骤c，PCR产物检测；
在上述步骤b中的扩增产物中加入上样缓冲液，取5μL上样于6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，接通电极，在80W的恒定功率下电泳2-3小时，关闭电源;取下凝胶，银染显色，照相统计；
步骤d，统计分析；具体为：
步骤d1，对标记位点的多态性信息量(PIC值)进行计算；
步骤d2，遗传多样性分析，计算各材料间的遗传距离GD。
5.根据权利要求4所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，上述步骤a2中，所述CTAB抽提液包括2％(w／v)CTAB;100mmol／LTris-Hcl，pH8.0;20mmol／LEDTA，pH8.0;1.4mol／LNaCl]600L。
6.根据权利要求4所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，上述步骤d2中，PIC值依据下述公式计算，
PIC=1-∑fi2
式中，fi表示i位点的基因频率。
7.根据权利要求6所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，在上述步骤d2中，对遗传多样性分析时，将扩增产物的每一条带视为一个位点，具有多态性的条带赋值为″1"，无此带时赋值为″0″。
8.根据权利要求7所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，在上述步骤d2中，
各材料间的遗传距离GD按下式计算：
GD＝-ln2Nxy／(Nx+Ny)，
式中Nxy为材料x、y的公共条带数，Nx为材料x的条带数，Ny为材料y的条带数。
9.根据权利要求6所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，在上述步骤b中，采用ABI-9700进行扩增，反应程序为94℃预变性5min;每个循环94℃预变性1min，550℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环;最后72℃延伸8min。
10.根据权利要求9所述的用于粳稻遗传多样性分析的分子标记鉴定方法，其特征在于，在上述步骤a8中，所述TE缓冲液包括10mmol／LTris-Hcl；1mmol／LEDTA，pH8.0。
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