CN108866225B - 一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法 - Google Patents

一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法，属于生物遗传背景技术领域。获得水稻品种的分子标记序列信息；获得能够区分不同水稻品种的变异位点；制备扩增变异位点的引物；制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA；制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的变异位点测序文库；对变异位点测序文库进行高通量测序，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组；分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得每个变异位点的主基因型；分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得可比较变异位点；对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行序列比对，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和样品间的差异率。

Description

一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法
技术领域
本发明属于生物遗传背景技术领域，具体涉及一种遗传修饰水稻，包括转基因修饰水稻、分子标记辅助回交修饰水稻和CRISPR/Cas9修饰水稻的遗传背景的筛查方法。
背景技术
基因的表达和功能不仅受自身调控元件的影响，同时受所处遗传背景下在同一个信号传递网络的其他基因的表达所调控。比如水稻白叶枯抗病基因Xa3/Xa26，在籼稻和粳稻背景下的表达不同，因而抗病功能也不相同；水稻稻瘟病抗性基因Pi21受紧密连锁的米质控制基因的影响，含Pi21基因的水稻在表现出抗病性状的同时往往伴随着产量低或是品质差的现象。
研究基因功能最理想的材料是近等基因系，即两个材料只在目的基因的位置有差异，而其他的遗传背景完全一致。转基因，分子标记辅助回交和最近发展的CRISPR/Cas9技术是目前常用的遗传修饰技术。研究基因功能需要对遗传修饰和受体遗传背景的进行鉴定。通常的鉴定手段是通过田间种植鉴定和室内分子标记鉴定进行。(1)田间种植鉴定的缺点是：周期长、工作量大，依赖于观察者的经验，且环境会影响性状，导致判断不准确。(2)已有的室内分子标记是PCR技术结合电泳技术进行，这样的鉴定的缺点是：需要分别处理每个样本的每个检测区域，工作量大，因此只能检测少数位点，通量低；只能判断序列长度变化，而对于碱基变化去无能为力，导致判断不准确；任何需要比较的样品都需要将样品重新进行平行的电泳，灵活度差，可比较性差。
发明内容
本发的明目的是提供一种转基因、分子标记辅助回交和CRISPR/Cas9遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法，包括以下步骤：
(1)获得水稻品种的分子标记序列信息；
(2)获得能够区分不同水稻品种的变异位点；
(3)制备扩增变异位点的引物；
(4)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA；
(5)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的变异位点测序文库；
(6)对变异位点测序文库进行高通量测序，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组；
(7)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得每个变异位点的主基因型；
(8)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得可比较变异位点；
(9)对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行序列比对，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和样品间的差异率。
进一步地，该方法利用水稻SSR变异位点群，包括以下步骤：
(1)获得水稻品种的SSR序列信息；
(2)获得水稻品种的SSR变异位点；
(3)计算每个变异位点在品种间的多态性，获得能有效区分不同品种的SSR位点，组成SSR变异位点群；
(4)制备扩增SSR变异位点群的引物群；
(5)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA；
(6)用扩增SSR变异位点群的引物群扩增待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA，制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的SSR位点群测序文库；
(7)对SSR变异位点群测序文库进行高通量测序，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组；
(8)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得每个变异位点的主基因型；
(9)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得可比较变异位点；
(10)对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行序列比对，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和样品间的差异率；根据差异位点在遗传修饰水稻的位置和数目，确定遗传修饰水稻的遗传背景。
进一步地，所述步骤(2)获得能够区分不同水稻品种的变异位点是将已公布的8个水稻品种3105个SSR位点的高通量测序信息，统计所有测序片段在基因组上覆盖深度高于20且滑脱率(即支持次基因型和主基因型的测序片段数量比)低于0.5的位点，在8个样品中的基因型；然后将每个位点在8个品种中两两比较，获得不同水稻品种的变异位点；计算每个变异位点可以区分开的水稻样品的对数，然后除以8个样品两两比较的总对数之和，得到每个位点的多态性指数；选择多态性指数高于0.3，且距离基因组上相邻位点大于1M的位点作为最后的有效检测位点。
优选地，所述滑脱率为支持次基因型和主基因型的测序片段数量比。
进一步地，所述步骤(3)制备扩增变异位点的引物中引物为所有变异位点检测引物形成的引物库。
优选地，所述步骤(4)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA，使用常用的十六烷基三甲基溴化铵法(简称CTAB)法提取获得基因组DNA后，要进行琼脂糖凝胶电泳检测完整性和干净程度，有RNA和蛋白污染的需进行基因组DNA纯化。
进一步地，所述步骤(7)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得每个变异位点的主基因型，利用Bowtie2(2.1.0版本)将所述遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组进行序列比对分析，根据序列比对信息确定每个测序片段所代表的基因型；每个测序片段代表了所扩增位点的一个可能的基因型，测序片段数量最多基因型即为主基因型。
优选地，所述步骤(7)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，在遗传修饰和受体亲本中测序片段覆盖深度均大于10、且滑脱率低于0.5的位点即为可比对变异位点。
进一步地，所述步骤(9)对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行序列比对，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和样品间的差异率，即对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行一一比较，若长度相同且无碱基差异，则认为二者在该位点相同，否则记为不同；差异位点的数目除以有效比对位点的数目即为两个样品的差异率。
本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法的方法，该方法基于扩增子测序技术的高通量快速准确筛查遗传修饰水稻遗传背景的技术。该技术在基因组范围内检测水稻中的SSR位点，可以高通量、准确和快捷的对遗传修饰植物的遗传背景进行筛查，为进行功能基因的研究提供技术支持。
(2)本方法利用利用水稻SSR位点群，使用超多重PCR，一次性对476个SSR位点进行扩增，然后结合高通量测序技术一次性的对所有扩增产物进行测序，然后结合生物信息分析技术对测序获得的片段进行序列分析，从而可以快速准确的检测水稻样品中SSR位点的基因型。本发明通过生物信息分析技术，一次测序后将品种的基因型进行储存，可灵活的用于任何需要和其进行基因型比对的分析中。本发明还将该SSR位点群应用于目前常用的三种遗传修饰技术所获得遗传修饰水稻，包括转基因水稻、分子标记辅助回交水稻和CRISPR/Cas9水稻的遗传背景筛查，通过将上述三种遗传修饰水稻和各自受体亲本同时进行SSR位点群基因型的检测和分析，可以精准的对各种遗传修饰水稻的遗传背景进行筛查。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明做进一步说明，本实施例可以区分不同水稻品种的变异位点类型为简单序列重复标记(简称SSR标记)。SSR标记是由一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此可做为多态性的分子标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的，因此可以在两端设计成对引物，通过PCR技术，经过传统的电泳检测技术或是新发展的高通量测序技术，显示SSR位点在不同个体间的多态性。使用传统的电泳检测技术，为了比较样品间的差异，必须将PCR产物进行平行电泳，且只能识别大的长度差异而不能识别碱基变异，因此具有通量低、灵活度差、检测灵敏度低的局限；而使用超多重PCR技术，可以高通量的对成百上千个SSR位点进行同时PCR扩增，然后对PCR产物进行高通量测序，则可以一次性对多个SSR位点进行序列分析，可以识别碱基序列变异和长度变化，且可以灵活的进行任何样品间的比对，因此可以高效、精准的筛查不同品种的遗传背景。
本实施例根据彭海对8个水稻品种的3105个SSR位点的高通量测序信息(Anaccurate and efficient method for large-scale SSR genotyping andapplications.Nucleic acid research.2017.doi:10.1093/nar/gkx093),筛查在8个品种中都有效扩增且存在多态性的476个SSR位点做为变异检测区域。筛查方法如下：去掉所有测序片段在基因组上覆盖深度低于20的位点以及滑脱率大于0.5的位点，然后统计剩余每个位点在8个样品中的主基因型，每个测序片段的序列代表了所测位点的一种基因型，测序片段覆盖数量最多的基因型为该位点的主基因型；将每个位点在8个品种中的主基因型进行两两比对，计算该位点可以区分开的样品对数，并除以8个样品两两比较的总对数之和，得到该位点的多态性指数；我们选择多态性指数高于0.3，且距离基因组相邻位点大于1M的位点做为最后的变异位点。
制备扩增所述变异位点的引物包括将所述SSR变异位点和两端保守的区域提交到life Technology公司多重PCR引物在线设计网页http://ampliseq.com/protected/help/pipelineDetails.action进行引物设计。在本实例中，网页上的各项操作具体包括在“Applicationtype”选项选择“DNA hotspot designs(single-pool)”。还可以选择multi-pool，这样需要多次多重PCR，增加了成本，single-pool的引物只需要一次多重PCR。因为本实例中选择水稻日本晴的基因组序列做为参考基因组，在“Select the genome you wishto use”选择“Custom”，“DNA type”选项选择“Standard DNA”，在“Add Hotspot”选项添加需要检测的SSR位点在染色体的位置信息，包括染色体信息，SSR的起始和结束位点，部分实例见表1。最后点击“Submit targets”按钮即可得到设计的多重PCR引物。上述成功设计的476个SSR位点即为变异检测区域。
本实施例对转基因水稻、分子标记辅助回交水稻和CRISPR/Cas9水稻和各自受体的遗传背景相似性进行了筛查。其中转基因水稻和受体亲本的遗传背景相似性筛查以籼稻品种D62B和DXT为材料，其中DXT是通过转基因的技术，将白叶枯病抗性基因Xa21转入到D62B中获得的转基因材料。分子标记辅助回交水稻和受体亲本的遗传背景相似性筛查是以籼稻品种D62B和DXB为材料，其中DXB是通过分子标记辅助回交技术，将白叶枯病抗性基因Xa21转入到D62B中获得的分子标记辅助回交材料。CRISPR/Cas9水稻和受体亲本的的遗传背景相似性筛查是以转基因水稻DXT和Xa21m为材料，其中Xa21m是通过CRISPR/Cas9技术，将转基因水稻DXT中的白叶枯病抗性基因Xa21编辑后获得的CRISPR/Cas9材料。
本实施例对D62B和DXT的遗传背景相似性、D62B和DXB的遗传背景相似性以及DXT和Xa21m的遗传背景相似性进行了筛查，具体如下：
三组遗传修饰材料中共包括了4个水稻品种，即D62B和DXT、DXB和Xa21m。采用天根生化科技有限公司的高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP350)提取D62B和DXT、DXB和Xa21m叶片的基因组DNA；然后在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA的完整性，只有一条完整的DNA条带的即为质量合格的DNA；采用百泰克公司的DNA纯化试剂盒(D6492)进行基因组DNA的纯化，纯化完成后用Qubit荧光定量仪进行精准的定量，然后将浓度调整为3.3ng/ul用于后续的扩增子文库构建。
扩增子文库的构建采用美国life technology公司的扩增子文库构建试剂盒2.0(英文名称Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0，货号4475345)，该试剂盒中包括了5倍浓度的高保真DNA聚合酶混合物(5*HiFi mix),多余引物消化试剂(FuPa)，接头试剂(Ion P1adapter),转换试剂(switch solution)和DNA连接酶(Ligase)。另购置用于区分不同样品的标签试剂(Ion XpressTM Barcode Adapters 1-16Kit，货号4471250)，具体如下：
目标检测区域扩增
扩增体系采用10ul的体系，具体组份如下：
D62B和DXT、DXB和Xa21m的DNA浓度调整为3.3ng/ul，取3ul做模板，每个品种1个反应体系，合计4个反应体系；
Figure GDA0003480619340000081
在PCR仪上按照下面程序进行PCR扩增：99℃，2min；99℃，15秒；60℃，8分钟，循环16次(循环次数依据引物对数来确定)；温度降到10度后结束反应。
反应结束后，在PCR反应液中添加1ul的多余引物消化试剂(FuPa)，然后在PCR仪上，按照下面程序进行引物的消化：50℃，10分钟；55℃，10分钟；60℃，20分钟；10℃20分钟。
接头连接
首先配制Barcode混合物，配制方法如下：
Figure GDA0003480619340000082
在本实施例中用的Ion Xpress Barcode 1、2、3和4，用于区分4个样品。
配制好Barcode混合物，添加下面体系的试剂到步骤1获得的消化掉引物的PCR反应液中，进行接头和Barcode的连接反应。
Figure GDA0003480619340000083
连接反应程序为：22℃，30分钟；72℃，10分钟。
连接反应完成后，使用贝克曼库尔特公司的核酸纯化试剂盒(Agencourt AMPureXP)进行连接产物的纯化。纯化后的连接产物使用Taqman探针法，在荧光定量PCR仪上对纯化后的连接产物进行定量，具体的：
连接产物按1:100进行稀释
配置6.8pM,0.68pM,0.068pM三个浓度梯度的标准品，进行10ul体系的荧光定量PCR，每个样品做3个重复。.
Figure GDA0003480619340000091
PCR程序：
95℃,2分钟；95℃,20秒；(95℃,3秒；60℃,20s)×40循环。
计算每个样品的浓度，即为构建好的扩增子文库。
一个芯片可以检测多个文库，将构建好的文库依据要使用的芯片将多个文库进行混合。本实例使用的是ABI的Ion 530芯片，可以承载体积为25ul，浓度为60pM的混合文库。因为对每个文库要求的数据量相同，所以本实例进行的是等量混合。混合的文库按照Ion520TM&530TMKit–Chef(Cat.no.A30010)试剂盒的操作步骤在Ion chef system上进行Chef步骤，这个过程完成后，混合文库样品已经被均匀的铺到芯片上。铺好的芯片再在Ion-S5测序仪器上进行高通量测序，测序深度设置为每个扩增子500倍覆盖，得到所述转基因水稻、分子标记辅助回交水稻和CRISPR/Cas9水稻和受体亲本的测序数据组。
利用Bowtie2(2.1.0版本)将所述遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组进行比对分析，然后根据序列比对信息确定每个测序片段所代表的基因型。每个测序片段代表了所扩增位点的一个可能的基因型，最多数量测序片段支持的基因型即为主基因型；在遗传修饰和受体亲本中测序片段覆盖深度均大于10、且滑脱率低于0.5的位点即为可比对位点。
对所述遗传修饰水稻和受体亲本的可比对位点进行比对，获得所述遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和差异率，包括将D62B和DXT中各个可比对位点的主基因型进行一一比较；将D62B和DXB中各个可比对位点的主基因型进行一一比和将DXT和Xa21m中各个可比对位点的主基因型进行一一比较。若长度相同且无碱基差异，则认为二者在该位点相同，否则记为不同；差异位点的数目除以有效比对位点的数目即为两个样品都差异率。
转基因水稻和受体亲本比较结果是DXT中共有287个位点有效扩增，D62B有效扩增的位点是293个，两个样品的有效比对位点共有278个。在278个可比较位点中，两个样品的差异位点有0个，差异率为0。这个结果说明转基因水稻DXT的遗传背景和受体保持一致，没有显著差异。
分子标记辅助回交水稻和受体亲本的比较结果是D62B有效扩增的位点是293个，DXB有效扩增的位点是261，两个样品的有效比对位点共有261个。在261个可比较位点中，两个样品的差异位点有61个，差异率为23.4％。这个结果说明分子标记辅助回交水稻DXB和受体亲本的遗传背景差异明显。
CRISPR/Cas9水稻和受体亲本的比较结果是DXT中共有287个位点有效扩增，Xa21m有效扩增的位点是254，两个样品的有效比对位点共有254个。在254个可比较位点中，两个样品的差异位点有2个，差异率为0.01％。这个结果说明CRISPR/Cas9水稻Xa21m和受体亲本DXT的遗传背景保持一致，没有显著差异。
表1部分变异位点的染色体信息和检测引物序列
Figure GDA0003480619340000111
本发明提供了一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法的方法，该方法基于扩增子测序技术的高通量快速准确筛查遗传修饰水稻遗传背景的技术。该技术在基因组范围内检测水稻中的SSR位点，可以高通量、准确和快捷的对遗传修饰植物的遗传背景进行筛查，为进行功能基因的研究提供技术支持。本方法利用利用水稻SSR位点群，使用超多重PCR，一次性对476个SSR位点进行扩增，然后结合高通量测序技术一次性的对所有扩增产物进行测序，然后结合生物信息分析技术对测序获得的片段进行序列分析，从而可以快速准确的检测水稻样品中SSR位点的基因型。本发明通过生物信息分析技术，一次测序后将品种的基因型进行储存，可灵活的用于任何需要和其进行基因型比对的分析中。本发明还将该SSR位点群应用于目前常用的三种遗传修饰技术所获得遗传修饰水稻，包括转基因水稻、分子标记辅助回交水稻和CRISPR/Cas9水稻的遗传背景筛查，通过将上述三种遗传修饰水稻和各自受体亲本同时进行SSR位点群基因型的检测和分析，可以精准的对各种遗传修饰水稻的遗传背景进行筛查。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法，其特征在于，所述筛查方法利用水稻SSR位点群，使用超多重PCR，对SSR位点进行扩增，包括以下步骤：(1)获得水稻品种的分子标记序列信息；(2)获得能够区分不同水稻品种的变异位点；(3)制备扩增变异位点的引物；(4)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA；(5)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的变异位点测序文库；(6)对变异位点测序文库进行高通量测序，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组；(7)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得每个变异位点的主基因型；其中，所述步骤(7)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，在遗传修饰和受体亲本中测序片段覆盖深度均大于10、且滑脱率低于0.5的位点即为可比对变异位点；所述滑脱率为支持次基因型和主基因型的测序片段数量比；(8)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得可比较变异位点；(9)对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行序列比对，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和样品间的差异率；其中，所述步骤(9)对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行序列比对，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和样品间的差异率，即对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行一一比较，若长度相同且无碱基差异，则认为二者在该位点相同，否则记为不同；差异位点的数目除以有效比对位点的数目即为两个样品的差异率；
其中，根据对8个水稻品种的3105个SSR位点的高通量测序信息，筛查在8个品种中都有效扩增且存在多态性的476个SSR位点做为变异检测区域；筛查方法如下：去掉所有测序片段在基因组上覆盖深度低于20的位点以及滑脱率大于0.5的位点，然后统计剩余每个位点在8个样品中的主基因型，每个测序片段的序列代表了所测位点的一种基因型，测序片段覆盖数量最多的基因型为该位点的主基因型；将每个位点在8个品种中的主基因型进行两两比对，计算该位点可以区分开的样品对数，并除以8个样品两两比较的总对数之和，得到该位点的多态性指数；选择多态性指数高于0.3，且距离基因组相邻位点大于1M的位点做为最后的变异位点；
其中，所述遗传修饰水稻是转基因水稻、分子标记辅助回交水稻和CRISPR/Cas9水稻；其中转基因水稻和受体亲本的遗传背景相似性筛查以籼稻品种D62B和DXT为材料，其中DXT是通过转基因的技术，将白叶枯病抗性基因Xa21转入到D62B中获得的转基因材料；分子标记辅助回交水稻和受体亲本的遗传背景相似性筛查是以籼稻品种D62B和DXB为材料，其中DXB是通过分子标记辅助回交技术，将白叶枯病抗性基因Xa21转入到D62B中获得的分子标记辅助回交材料；CRISPR/Cas9水稻和受体亲本的遗传背景相似性筛查是以转基因水稻DXT和Xa21m为材料，其中Xa21m是通过CRISPR/Cas9技术，将转基因水稻DXT中的白叶枯病抗性基因Xa21编辑后获得的CRISPR/Cas9材料。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法，其特征在于，该方法利用水稻SSR变异位点群，包括以下步骤：(1)获得水稻品种的SSR序列信息；(2)获得水稻品种的SSR变异位点；(3)计算每个变异位点在品种间的多态性，获得能有效区分不同品种的SSR位点，组成SSR变异位点群；(4)制备扩增SSR变异位点群的引物群；(5)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA；(6)用扩增SSR变异位点群的引物群扩增待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA，制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的SSR位点群测序文库；(7)对SSR变异位点群测序文库进行高通量测序，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组；(8)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得每个变异位点的主基因型；(9)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得可比较变异位点；(10)对待测遗传修饰水稻和受体亲本的可比对变异位点的主基因型进行序列比对，获得待测遗传修饰水稻和受体亲本的差异位点和样品间的差异率；根据差异位点在遗传修饰水稻的位置和数目，确定遗传修饰水稻的遗传背景；其中，所述步骤(2)获得能够区分不同水稻品种的变异位点是将已公布的8个水稻品种3105个SSR位点的高通量测序信息，统计所有测序片段在基因组上覆盖深度高于20且滑脱率低于0.5的位点，在8个样品中的主基因型；然后将每个位点在8个品种中两两比较，获得不同水稻品种的变异位点；计算每个变异位点可以区分开的水稻样品的对数，然后除以8个样品两两比较的总对数之和，得到每个位点的多态性指数；选择多态性指数高于0.3，且距离基因组上相邻位点大于1M的位点作为最后的有效检测位点。
3.根据权利要求1所述的遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法，其特征在于，所述步骤(3)制备扩增变异位点的引物中引物为所有变异位点检测引物形成的引物库。
4.根据权利要求1所述的遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法，其特征在于，所述步骤(4)制备待测遗传修饰水稻和受体亲本的基因组DNA，使用常用的十六烷基-三甲基溴化铵法(简称CTAB)提取获得基因组DNA后，要进行琼脂糖凝胶电泳检测完整性和干净程度，有RNA和蛋白污染的需进行基因组DNA纯化。
5.根据权利要求1所述的遗传修饰水稻遗传背景的筛查方法，其特征在于，所述步骤(7)分析待测遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组，获得每个变异位点的主基因型，利用Bowtie2，2.1.0版本，将所述遗传修饰水稻和受体亲本的测序数据组进行序列比对分析，根据序列比对信息确定每个测序片段所代表的基因型；每个测序片段代表了所扩增位点的一个可能的基因型，测序片段数量最多的基因型即为主基因型。
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