CN109554494A - 水稻抗褐飞虱bph9复等位基因的通用共显性分子标记及其检测方法和应用 - Google Patents

水稻抗褐飞虱bph9复等位基因的通用共显性分子标记及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水稻抗褐飞虱BPH9复等位基因的通用共显性分子标记及其检测方法和应用。本发明提供水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的通用分子标记，其位于水稻第12号染色体第22874098～22874099bp处，其多态性为5’‑TG‑3’/5’‑CC‑3’/5’‑CA‑3’。本发明提供的抗褐飞虱复等位基因的通用共显性分子标记可通用于复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的纯合或杂合基因型的鉴定，实现抗褐飞虱水稻资源的BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9基因型的高效准确鉴定。

Description

水稻抗褐飞虱BPH9复等位基因的通用共显性分子标记及其检 测方法和应用
技术领域
本发明涉及植物分子育种领域，具体涉及水稻抗褐飞虱BPH9复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的通用共显性分子标记及其检测方法和应用。
背景技术
褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal,简称BPH)属于同翅目飞虱科昆虫,是水稻的主要害虫。褐飞虱在我国分布广泛，有极强的季节性、迁飞性和繁殖能力，爆发时常造成稻株枯萎、减产甚至绝收。稻飞虱在取食水稻的同时还传播水稻病害，加重了对水稻的危害，从而对水稻种植造成更大的损失。已有研究表明，利用水稻自身抗性培育抗褐飞虱水稻品种是防治褐飞虱最有效、最经济、最安全的措施之一。然而由于褐飞虱的迁飞性以及具有不同生物型等特点，含有单一抗性基因的水稻品种在种植几年后会逐渐丧失其抗性。因此挖掘和利用广谱性基因、聚合多个抗性基因或采用含有不同抗性基因的品种进行轮作等措施，是获得具有持久、广谱抗褐飞虱性状的水稻品种的重要途径。
近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，水稻的褐飞虱抗性基因陆续被定位、克隆。目前已经定位了30个以上的抗褐飞虱主效基因，其中大部分基因在染色体上成簇分布，其中，在水稻的第12号染色体上分布着最大的抗褐飞虱基因簇，包括BPH1、BPH2、BPH7、BPH9、BPH10、BPH18、BPH21、BPH26共8个基因。研究表明。这8个抗褐飞虱基因为复等位基因，并将该位点命名为BPH1/9。根据基因序列及抗性机理将这8个复等位基因分为4类，分别为BPH1/9-1(BPH1、BPH10、BPH18、BPH21)、BPH1/9-2(BPH2、BPH26)、BPH1/9-7(BPH7)与BPH1/9-9(BPH9)，这4类复等位基因针对不同褐飞虱生物型具有不同的抗性水平，例如，BPH1/9-9(BPH9)对褐飞虱生物型1、2、3具有广谱抗性。在水稻的遗传育种中可以采用分子标记辅助育种选择，将同位点的不同复等位基因导入水稻父母本中，通过杂交配组，进一步提高杂交稻的褐飞虱抗性水平，从而延长水稻品种的寿命。因此，开发高效的抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9的分子标记具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9的通用共显性分子标记及其检测方法和应用。
本发明的技术方案如下：
通过对分别含有4类抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的水稻材料进行大量的基因组测序和序列比对分析，在抗褐飞虱复等位基因的第3外显子处发现一个特异的MNP位点，该MNP位点位于日本晴水稻第12号染色体第22874098～22874099处(日本晴水稻基因组版本号IRGSP1.0，第12号染色体GenBank登录号为AP014968.1)。其中4类抗虫复等位BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9在该处均为5’-TG-3’，而感虫等位则为5’-CC-3’或5’-CA-3’。基于该MNP位点，本发明开发了高效、准确的复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9基因型鉴定通用的共显性分子标记。
首先，本发明提供水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的通用分子标记，其位于水稻第12号染色体第22874098～22874099bp处，其多态性为5’-TG-3’/5’-CC-3’/5’-CA-3’。
在上述分子标记的基础上，本发明提供一种检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的基因型的方法，通过对水稻第12号染色体第22874098～22874099处的核苷酸序列(5’-TG-3’/5’-CC-3’/5’-CA-3’)进行检测，根据检测结果判断水稻抗褐飞虱复等位基因的基因型，如该处核苷酸序列为5’-TG-3’/5’-TG-3’的纯合基因型，则为水稻在抗褐飞虱复等位基因处携带BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9中的一种或两种；如该处的核苷酸序列为5’-CC-3’/5’-CA-3’、5’-CC-3’/5’-CC-3’、5’-CA-3’/5’-CA-3’的基因型，则水稻携带感虫等位；如该处的核苷酸序列为5’-TG-3’/5’-CC-3’或者5’-TG-3’/5’-CA-3’，则水稻的抗褐飞虱复等位基因为杂合基因型。
本发明提供用于检测所述的通用分子标记的引物。
具体地，所述用于检测所述的通用分子标记的引物包括：
正向引物1：BPH1/9-RF:TCTCAGCCGCCTGGAATC；
反向引物1：BPH1/9-RR:TTGCTCCCACCGAAGTCA；
正向引物2：BPH1/9-SF:TGGTGGTTCTCAAGCCCC；
反向引物2：BPH1/9-SR:GTCCTCCTTCAATCTTCGTG
在此基础上，本发明提供一种用于检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的试剂盒，其包括所述的用于检测所述的通用分子标记的引物。
优选地，所述试剂盒还包括Mg2+、dNTPs、PCR反应缓冲液和DNA聚合酶。
进一步地，本发明提供所述的通用分子标记或所述用于检测所述的通用分子标记的引物或包含所述引物的试剂盒的如下任意一种应用：
(1)在检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9中的应用；
(2)在检测水稻抗褐飞虱性状中的应用；
(3)在水稻抗抗褐飞虱分子辅助育种中的应用；
(4)在水稻种质资源改良中的应用。
进一步地，本发明提供一种检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的方法，其以待测水稻的基因组为模板，利用本发明所述的引物或所述的试剂盒进行扩增，分析扩增产物的序列。
优选地，所述分析扩增产物的序列为将扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带判断扩增产物的序列。
更优选地，所述检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的方法包括如下步骤：
(1)提取待测水稻的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，利用所述的引物或所述的试剂盒进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带判断扩增产物的序列；
所述判断扩增产物的序列的标准如下：当扩增产物为360bp条带时，待测水稻携带BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9抗褐飞虱等位基因的任意一种或两种；当扩增产物为220bp条带时，待测水稻携带褐飞虱易感等位基因；当扩增产物为360bp和220bp两种带型时，待测水稻为BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9抗褐飞虱等位基因的任意一种和褐飞虱易感等位基因的杂合基因型。
上述方法中，步骤(2)的PCR扩增的反应条件为：94℃～98℃预变性3～10分钟；94℃～98℃变性10～30秒，52℃～60℃退火10～30秒，72℃延伸30～60秒，共25～35个循环；72℃延伸3～10分钟。
上述方法中，步骤(2)的PCR扩增的反应体系(10μL)如下：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM dNTP 0.8μL，BPH1/9-RF、BPH1/9-SR、BPH1/9-SF、BPH1/9-RR四个检测引物(10μM)各0.15μL，DNA聚合酶0.1μL，基因组DNA模板2μL，加水补足10μL。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9的通用共显性分子标记是基于基因外显子之间的差异开发的共显性分子标记，在鉴定时能够有效排除假阴性的影响，可通用于复等位基因BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9的纯合或杂合基因型的鉴定，实现抗褐飞虱水稻资源的高效准确筛选；
(2)利用本发明提供的分子标记的检测方法，可以根据扩增产物的电泳条带差异判定待测水稻材料的复等位基因BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9的基因型，成本低廉、无需酶切，检测程序方便快捷；
(3)利用本发明提供的分子标记进行水稻辅助育种时，能够在杂交后代材料中实现同时对复等位基因BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9的基因型的准确、高效的检测，而无需针对每个复等位基因分别进行鉴定；还可实现水稻生长早期的非破坏性检测，适于商业化大规模育种中对复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的基因型的大量筛选以及对水稻种质资源中复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9基因型的鉴定。
附图说明
图1为本发明实施例1中4类抗褐飞虱复等位基因BPH7、BPH9、BPH18、BPH26以及9311和日本晴的分子标记所在目标序列的比对结果。
图2为本发明实施例4中利用通用分子标记对水稻育种常用亲本材料进行检测的电泳结果图，其中，M为DL1000marker，泳道1-32依次为：Mudgo、T12、HP209、Pokkali、华占、玉针香、华恢272、日本晴、丰玉占、镇稻819、成恢19、R6444、绵恢3728、农垦31、特青、华润2号、R1141、越粳0618、热粳35、沪粳6、龙稻9号(糯)、杨粳5507、浙粳75、辽盐287、盐稻531、R1128、CO2、龙5、一上S01、R608、R1206、IRTA129的扩增产物。
图3为本发明实施例5中利用通用分子标记分别对Mudgo/华占//华占BC1F2和ADR52/华占//华占BC1F2的分离群体进行检测的电泳结果，其中，M为DL1000marker，泳道1-20(A)为Mudgo/华占//华占BC1F2的扩增产物的检测结果；泳道21-40(B)为ADR52/华占//华占BC1F2的扩增产物的检测结果。
图4为利用通用分子标记分别对T12/华占//华占BC1F2和Pokkali/华占//华占BC1F2进行检测的电泳结果，其中，M为DL1000marker，泳道1-20(C)为T12/华占//华占BC1F2的扩增产物的检测结果；泳道21-40(D)为Pokkali/华占//华占BC1F2的扩增产物的检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例所用的水稻材料均为可从商业途径或国家种质库得到或为本领域技术人员广泛推广使用的材料。
实施例1水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9通用共显性分子标记的开发
水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9位于水稻第12号染色体长臂，通过对抗褐飞虱亲本Mudgo(BPH1/10/18/21)、ADR52(BPH2/26)、T12(BPH7)、Pokkali(BPH9)以及感虫亲本9311、日本晴、华占、638S等二十余种水稻材料基因组序列的测定和比对分析，在抗褐飞虱基因第3外显子处发现一个特异MNP(多核苷酸多态性)，位于日本晴第12号染色体第22874098～22874099bp处，其中BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9抗虫等位基因为5’-TG-3’，感虫等位为5’-CC-3’或5’-CA-3’。4类抗褐飞虱复等位基因BPH7、BPH9、BPH18、BPH26和9311、日本晴的序列分析结果如图1所示。针对该MNP开发BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7和BPH9的通用共显性分子标记，可以实现该位点的基因型鉴定。
实施例2复等位基因BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9基因共显性分子标记的检测引物的设计
针对实施例1开发的复等位基因特异性分子标记设计检测引物，引物设计原理如下。
首先设计用于扩增抗褐飞虱等位基因(以下简称抗虫等位基因)的特异性引物，以抗虫复等位BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9均具有的5’-TG-3’MNP互补的5’-CA-3’为引物3’端设计反向引物BPH1/9-RR，再在其上游设计与之配对使用的正向引物BPH1/9-RF，引物BPH1/9-RR与BPH1/9-RF只能特异性扩增BPH1/10/18/21或BPH2/26或BPH7或BPH9产生360bp条带，而对于其它等位无扩增条带；
然后，设计扩增褐飞虱易感等位基因(以下简称感虫等位基因)的特异性引物，以上述MNP中的感性等位特异的5’-CC-3’或5’-CA-3’中的C碱基为引物3’端设计正向引物BPH1/9-SF，同时将3’端第2位碱基设计为C，再在下游设计与之匹配的反向互补引物BPH1/9-SR，引物BPH1/9-SF与BPH1/9-SR只能特异扩增感虫等位获得一条220bp条带，而扩增BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7或BPH9抗虫等位均无条带。
上述BPH1/9-RR与BPH1/9-RF、BPH1/9-SF与BPH1/9-SR的引物序列如表1所示，四条引物组成BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9的通用分子标记的检测引物组。当扩增产物为360bp条带时，待测水稻携带BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9抗虫等位基因中的一种或两种；当扩增产物为220bp条带时，待测水稻携带感虫等位；当扩增产物为360bp和220bp两种带型时，待测水稻为BPH1/10/18/21或BPH2/26或BPH7或BPH9中的任意一种与感虫等位的杂合基因型水稻。
表1BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9通用分子标记引物序列及参数
实施例3水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9通用分子标记检测方法的建立
根据实施例2设计的BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9通用分子标记的检测引物，设计PCR的反应程序和反应体系，经过不断优化，确定如下反应程序和体系：
PCR反应体系(10μL)：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM dNTP0.8μL，4条引物(10μM)各0.15μL，Taq DNA聚合酶0.1μL；DNA模板2μL，双蒸水补足余量。
PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，共35个循环；72℃延伸8分钟。
实施例4BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9通用分子标记在检测水稻抗褐飞虱及褐飞虱易感品种中的应用
(1)生物材料
抗褐飞虱亲本Mudgo(BPH1/10/18/21)、ADR52(BPH2/26)、T12(BPH7)、Pokkali(BPH9)以及28份水稻育种亲本材料或市售水稻品种，具体包括：华占、玉针香、华恢272、日本晴、丰玉占、镇稻819、成恢19、R6444、绵恢3728、农垦31、特青、华润2号、R1141、越粳0618、热粳35、沪粳6、龙稻9号(糯)、杨粳5507、浙粳75、辽盐287、盐稻531、R1128、CO2、龙5、一上S01、R608、R1206、IRTA129。
(2)水稻基因组DNA提取及引物合成
采用CTAB法提取上述水稻材料的基因组DNA并合成如表1所示的引物序列，具体为：
BPH1/9-RF:TCTCAGCCGCCTGGAATC；
BPH1/9-RR:TTGCTCCCACCGAAGTCA；
BPH1/9-SR:GTCCTCCTTCAATCTTCGTG；
BPH1/9-SF:TGGTGGTTCTCAAGCCCC。
(3)PCR检测
PCR的反应体系和反应程序如实施例3所述。PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
(4)结果分析
PCR扩增产物的电泳结果如图2所示，其中，1-4泳道依次为抗褐飞虱亲本Mudgo(BPH1/10/18/21)、ADR52(BPH2/26)、T12(BPH7)和Pokkali(BPH9)，这4个抗褐飞虱亲本的扩增产物均为360bp的条带，5-32泳道依次为华占、玉针香、华恢272、日本晴、丰玉占、镇稻819、成恢19、R6444、绵恢3728、农垦31、特青、华润2号、R1141、越粳0618、热粳35、沪粳6、龙稻9号(糯)、杨粳5507、浙粳75、辽盐287、盐稻531、R1128、CO2、龙5、一上S01、R608、R1206、IRTA129水稻材料的扩增产物，这些水稻材料的扩增产物均为220bp的条带(图2中546bp条带为非特异性扩增，不影响基因型的判断和检测的准确性)。为了验证PCR检测的结果的准确性，将各亲本材料分子标记目标区进行了DNA测序分析。结果表明，分子标记的检测结果与测序结果一致，证明本发明提供的分子标记及其检测引物能够准确鉴定抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9的基因型，可实现准确高效的水稻品种资源的筛选。
实施例5BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9通用分子标记在水稻分子辅助育种中的应用
(1)生物材料
Mudgo和华占杂交并再与华占回交(Mudgo/华占//华占BC1F2)，ADR52和华占杂交并再与华占回交(ADR52/华占//华占BC1F2)，T12和华占杂交并再与华占回交(T12/华占//华占BC1F2)，Pokkali和华占杂交并再与华占回交(Pokkali/华占//华占BC1F2)构建四个水稻BC1F2代分离群体随机选择100株，以上杂交和会交育种方法均采用本领域常规方法。
(2)水稻基因组DNA的提取和PCR检测
水稻基因组DNA的提取和PCR检测的引物、反应程序和体系如实施例4所述。
(3)结果分析
利用实施例1～3中提供的BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9通用分子标记及其检测方法对上述(1)中所述的四个BC1F2代分离群体进行分子标记辅助选择，部分检测结果如图3和图4所示，图3中A(1-20)为Mudgo/华占//华占BC1F2的检测结果；B(21-40)为ADR52/华占//华占BC1F2标记检测结果；图4中C(1-20)为T12/华占//华占BC1F2的检测结果；D(21-40)为Pokkali/华占//华占BC1F2的检测结果(图3和图4中546bp条带为非特异性扩增，不影响基因型的判断和检测的准确性)。为了验证PCR检测的结果的准确性，将4个不同供体材料杂交的分离群体材料的分子标记目标区进行了DNA测序分析，结果表明，PCR扩增的检测结果与测序结果完全一致，本发明提供的通用标记为共显性标记，可以将BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9抗虫等位5’-TG-3’与感虫等位的5’-CC-3’、5’-CA-3’的不同纯合子以及杂合子基因型进行有效区分。
本发明提供的BPH1/10/18/21，BPH2/26，BPH7，BPH9通用共显性分子标记及其检测引物和检测方法，能够实现抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7和BPH9基因型的高效、准确鉴定，可以用于水稻资源的筛选鉴定，也可用于水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21或BPH2/26或BPH7或BPH9的分子辅助育种。
上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司 湖南隆平高科种业科学研究院有限公司 湖南亚华种业科学研究院
<120> 水稻抗褐飞虱BPH9复等位基因的通用共显性分子标记及其检测方法和应用
<130> KHP181118141.6
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctcagccgc ctggaatc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgctcccac cgaagtca 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggtggttct caagcccc 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcctccttc aatcttcgtg 20

Claims (10)

1.水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的通用分子标记，其特征在于，位于水稻第12号染色体第22874098～22874099bp处，其多态性为5’-TG-3’/5’-CC-3’/5’-CA-3’。
2.用于检测权利要求1所述的通用分子标记的引物。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，包括：
正向引物1：BPH1/9-RF：5’-TCTCAGCCGCCTGGAATC-3’；
反向引物1：BPH1/9-RR:5’-TTGCTCCCACCGAAGTCA-3’；
正向引物2：BPH1/9-SF：5’-TGGTGGTTCTCAAGCCCC-3’；
反向引物2：BPH1/9-SR：5’-GTCCTCCTTCAATCTTCGTG-3’。
4.一种用于检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的引物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Mg2+、dNTPs、PCR反应缓冲液和DNA聚合酶。
6.权利要求1所述的通用分子标记或权利要求2或3所述的引物或权利要求4或5所述的试剂盒在检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9或在检测水稻抗褐飞虱性状中的应用。
7.权利要求1所述的通用分子标记或权利要求2或3所述的引物或权利要求4或5所述的试剂盒在水稻抗抗褐飞虱分子辅助育种或水稻种质资源改良中的应用。
8.一种检测水稻抗褐飞虱复等位基因BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9的方法，其特征在于，以待测水稻的基因组为模板，利用权利要求2或3所述的引物或权利要求4或5所述的试剂盒进行扩增，分析扩增产物的序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述分析扩增产物的序列为将扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带判断扩增产物的序列。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测水稻的基因组DNA；
(2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求2或3所述的引物或权利要求4或5所述的试剂盒进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行电泳检测，根据电泳条带判断扩增产物的序列；
所述判断扩增产物的序列的标准如下：当扩增产物为360bp条带时，待测水稻携带BPH1/10/18/21、BPH2/26、BPH7、BPH9抗褐飞虱等位基因的任意一种或两种；当扩增产物为220bp条带时，待测水稻携带褐飞虱易感等位基因；当扩增产物为360bp和220bp两种带型时，待测水稻为BPH1/10/18/21、BPH226、BPH7、BPH9抗褐飞虱等位基因的任意一种和褐飞虱易感等位基因的杂合基因型。
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