CN113584213B - 一组大麻ssr分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农作物分子生物学技术领域，具体涉及一组大麻SSR分子标记及其应用。本发明提供一组大麻SSR分子标记，共11个SSR分子标记，还提供一套适于毛细管电泳平台的检测所述SSR分子标记的引物组合。利用这11个SSR分子标记可以：鉴定大麻品种及分析遗传多样性；区分庆大麻3号和汉麻7号、龙大麻5号和火麻一号、龙麻1号和尤纱‑31等品种。通过本发明的大麻SSR分子标记的应用，能够在基因组水平上拓展大麻可用标记位点的范围；为大麻品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供新工具，应用前景良好。

Description

一组大麻SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及农作物分子生物学技术领域，具体涉及一组大麻SSR分子标记及其应用。

背景技术

大麻(Cannabis sativa L.)是一种传统经济作物，主要用于纺织和榨油，是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物。大麻作为一种具有特殊功效的经济作物，其皮、秆、籽、根、叶、花均具有利用价值，在纺织、食品、造纸、建筑、医药、交通运输和国防军工等方面应用广泛。尤其是大麻中的大麻二酚(CBD,cannabidiol)，其属于萜酚类化合物，具有丰富的药理学作用。由于大麻中致幻成分四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)易被不法分子利用，因此，降低THC含量成为大麻育种的重要指标之一。为了与毒品大麻进行区分，将THC含量低于0.3％的大麻品种称为工业大麻(Industrial hemp)。

由于大麻在工业中的广泛应用，其种植和育种技术也在不断改进，越来越多的大麻品种不断涌现。尤纱-31是中国从乌克兰引进的大麻品种，具有纤维含量高的特点。庆大麻3号、汉麻7号、龙大麻5号、火麻一号和龙麻1号都是中国经过育种改良的杂交品种。庆大麻3号属于纤用大麻，纤维含量相对较高；汉麻7号属于药用大麻，CBD含量相对较高，但二者在育种过程中有相同的祖先，即遗传背景相似，因此在遗传育种前需要对二者进行品种区分。龙大麻5号和火麻一号也是类似情况，遗传背景相似，也需要进行二者的区分和鉴定。龙麻1号和尤纱-31属于纤维含量相对较高的品种，二者的种子在外观上十分相似，难以分辨，两者在育种时非常容易发生田间种植混乱、授粉漂移所引起的种子混淆，因此在种子收获后进行品种鉴定同样是必须的工作。汉麻7号、龙大麻5号和龙麻1号都属于THC含量相对更低的优势品种，THC含量的高低对大麻在市场上的价值有很大影响，为了严格合理地使用品种，在流入市场前必须对品种进行严格的鉴定，保证种子的纯度。各品种的特性及品种鉴定缘由见表1。

这些大麻品种的区分给大麻品种鉴定工作带来新的考验。传统的品种鉴定是根据种子、幼苗及植株的形态特征和农艺形状进行鉴定的，主要测试品种的特异性、一致性和稳定性。但这些鉴定方法存在时间长、工作量大、准确度不高、占用土地等应用局限性问题，同时这种方法也只适用于品种间差异明显的样品的鉴定。而分子技术进行品种鉴定则具有快速高效、不受环境影响、可用标记多等优点。SSR(Simple Sequence Repeat，SSR)简单重复序列，也称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，由1-6个碱基为重复单位，形成长达数十个核苷酸的串联重复序列，如(AT)n、(AC)n、(GA)n、(AAG)n、(AAT)n、(CATG)n等。微卫星序列广泛分布于植物基因组中，且SSR序列在不同物种中长度、重复单位次数、突变情况有所不同，在染色体上的分布也存在差异，等位基因的多样性也由此形成。基于PCR的SSR标记技术具有成本低、简单易行、稳定、高效等优点，已广泛应用于动植物群体分析、构建DNA指纹图谱、品种鉴定以及辅助育种等多个方面，是有效鉴别品种真实性的理想方法。

表1各品种的特性及品种鉴定缘由

发明内容

本发明的目的是提供一组大麻SSR分子标记及其扩增引物。本发明的另一目的是提供大麻SSR分子标记及其扩增引物的应用。

本发明的目的是提供适用于毛细管电泳检测技术的一组大麻SSR分子标记。

为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型种类丰富、代表性强的大麻材料，对相应材料的大麻基因组进行测序并比较，进而获得了一组大麻SSR分子标记。

本发明提供了一组大麻SSR分子标记，所述分子标记包括以下11个SSR分子标记的一个或多个，11个SSR分子标记分别为C08CANN2，31，ANUCS206，06，H11CANN1，36，32，CAN0033，39，03，27。

所述11个SSR分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.1-2，SEQ IDNO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22。

上述SSR分子标记可采用本领域常规技术手段进行检测，同时，能够适用于毛细管电泳检测技术。基于毛细管电泳检测技术的SSR分子标记技术可以得到定量的DNA片段分析数据。与常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，其结果更为精确、灵敏、高效，更适用于大批量品种的检测分析。

在进行毛细管电泳检测时，可将上述SSR分子标记分为若干个不同荧光标记组，每组内的荧光标记相同。

作为本发明的一种实施方式，可将上述SSR分子标记分为四个不同荧光标记组，每组内的荧光标记相同：

第一组由SSR分子标记C08CANN2，31组成；第二组由SSR分子标记ANUCS206，06，H11CANN1组成；第三组由SSR分子标记36，32，CAN0033组成；第四组由SSR分子标记39，03，27组成。

进一步，本发明提供了用于扩增上述SSR分子标记的特异性引物对。

优选地，所述特异性引物对包括如下引物对中的一个或多个：SEQ ID NO.1-2，SEQID NO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22。

本发明还提供一种试剂盒，其含有上述用于扩增上述SSR分子标记的特异性引物对。

本发明还提供大麻基因组芯片，其含有上述大麻SSR分子标记。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在构建大麻品种DNA指纹数据库中的应用。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻种质资源遗传多样性分析或种子质量检测中的应用。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻品种鉴定、亲缘关系分析、母系溯源中的应用。

对于大麻品种的鉴定，作为示例，本发明提供在区分庆大麻3号和汉麻7号、龙大麻5号和火麻一号、龙麻1号和尤纱-31品种中的应用。

本发明提供用于区分庆大麻3号和汉麻7号、龙大麻5号和火麻一号、龙麻1号和尤纱-31品种的试剂盒，其含有针对本发明的11个大麻SSR分子标记的特异性引物组合。优选地，所述特异性引物组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-22所示。

本发明提供上述大麻SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供上述大麻SSR分子标记在制备大麻基因组芯片中的应用。

以上所述的应用，具体包括以下步骤：

1)提取待测大麻样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用上述SSR分子标记，进行PCR扩增；

3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。

上述应用的步骤2)中，PCR扩增采用20μL的反应体积，含样品DNA 10-40ng，正向引物、反向引物各0.4μM，2×聚合酶混合物10μL。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。

步骤3)中，可通过进行一次性毛细管电泳，将得到的扩增产物的电泳图进行比较，通过分析电泳图的条带情况确定大麻品种。

本发明提供的上述11对SSR引物可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，每对引物的其中一条的5'端标记荧光基团；配制PCR反应体系加入DNA、引物、聚合酶混合物；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。

优选地，将本发明的11对特异性SSR引物进行荧光染料标记，共选用了PET、NED、VIC、FAM四种荧光染料。将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.5μL LIZ500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LIZ500进行比较，直接给出目标DNA片段的准确大小。

在本发明的实施例的一个较佳实施方案中，FAM荧光标记组的SSR分子标记为C08CANN2，31；VIC荧光标记组的SSR分子标记为ANUCS206，06，H11CANN1；NED荧光标记组的SSR分子标记为36，32，CAN0033；PET荧光标记组的SSR分子标记为39，03，27。以庆大麻3号DNA为模板，分别用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物的PCR产物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以庆大麻3号的DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物的PCR产物混合物进行一次毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与FAM、VIC、NED、PET四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1A-图1D)，可以看到，在FAM、VIC、NED、PET单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物组合(共11对引物)可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以汉麻7号(图2A-图2D)、龙大麻5号(图4A-图4D)、火麻一号(图5A-图5D)、龙麻1号(图7A-图7D)和尤纱-31(图8A-图8D)DNA为模板进行相同的实验，可得到相同的结论。

实施例中分别以庆大麻3号和汉麻7号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合进行一次性毛细管电泳，分别得到庆大麻3号和汉麻7号的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，庆大麻3号在172和257bp出现FAM蓝色峰，汉麻7号在211和260bp出现FAM蓝色峰；庆大麻3号在177、232、240和299bp出现VIC绿色峰，汉麻7号在183、232、246和315bp出现VIC绿色峰；庆大麻3号在173、177、240、243、312和315bp出现NED黄色峰，汉麻7号在195、243、247和312bp出现NED黄色峰；庆大麻3号在178、230、236、286和289bp出现PET红色峰，汉麻7号在181、227、233、279和289bp出现PET红色峰。庆大麻3号及汉麻7号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，且均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分庆大麻3号和汉麻7号。相同地，用本发明提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分龙大麻5号和火麻一号(图6)、龙麻1号和尤纱-31(图9)。

本发明的不同荧光标记的扩增产物可在同一泳道中进行电泳，其信号清晰，扩增片段大小差异明显，可精确计算片段大小，每个DNA样品电泳峰型各异，易于判断。具有灵敏度高、分辨力好，结果准确可靠、高效快速等优点。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将庆大麻3号和汉麻7号、龙大麻5号和火麻一号、龙麻1号和尤纱-31品种区分开，实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势。本发明提供的该组引物可用于大麻指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。

附图说明

图1A-图1D分别为庆大麻3号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图1A为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图1B为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图1C为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图1D为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。各图比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的DNA指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。

图2A-图2D为汉麻7号的SSR荧光标记毛细管电泳检测结果。其中，图2A为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图2B为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图2C为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图2D为汉麻7号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。各图的比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的DNA指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。图1A-图1D和图2A-图2D均为了说明同一个目的，两个品种(庆大麻3号和汉麻7号)的实验结果更能说明本发明提供的引物组合的实用性与可靠性。

图3为用本发明提供的11个大麻SSR分子标记对庆大麻3号和汉麻7号进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。结果说明，庆大麻3号(上图)显示的FAM目的峰(蓝色)与汉麻7号(下图)显示的FAM目的峰(均用箭头标出)清晰可辨，且目的峰分子量不同。同理，两个品种显示的VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本发明提供的引物组合能够对庆大麻3号及汉麻7号进行品种区分。

图4A-图4D分别为龙大麻5号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图4A为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图4B为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图4C为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图4D为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图5A-图5D分别为火麻一号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图5A为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图5B为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图5C为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图5D为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图6为用本发明提供的11个大麻SSR分子标记对龙大麻5号和火麻一号进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。两个品种显示的FAM、VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本发明提供的引物组合能够对龙大麻5号及火麻一号进行品种区分。

图7A-图7D分别为龙麻1号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图7A为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图7B为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图7C为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图7D为龙麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图8A-图8D分别为尤纱-31SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图8A为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图8B为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图8C为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图8D为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。

图9为用本发明提供的11个大麻SSR分子标记对龙麻1号和尤纱-31进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。同理，两个品种显示的FAM、VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本发明提供的引物组合能够对龙麻1号及尤纱-31进行品种区分。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

若未特别说明，本发明实施例所用生化试剂均为市售，所用大麻材料均为本领域公知公用的大麻，其中，尤纱-31的品种审定登记编号为黑登记2006005，龙大麻1号的品种审定登记编号为黑登记2011003，龙大麻2号的的品种审定登记编号为黑登记2013009，火麻一号的品种审定登记编号为黑登记2015005，庆大麻1号的品种审定登记编号为黑登记2016012，龙大麻3号的品种审定登记编号为黑登记2016013，龙麻1号的品种审定登记编号为黑认定2017002，汉麻2号的品种审定登记编号为黑认定2017003，汉麻1号的品种审定登记编号为黑认定2017004，龙麻2号的品种审定登记编号为黑认定2017005，格列西亚的品种审定登记编号为黑认定2017006，汉麻5号的品种审定登记编号为黑认定2018001，汉麻4号的品种审定登记编号为黑认定2018002，牡麻1号的品种审定登记编号为黑认定2018003，庆大麻2号的品种审定登记编号为黑认定2018004，线麻1号的品种审定登记编号为黑认定2018005，龙大麻4号的品种审定登记编号为黑认定2019001，庆大麻3号的品种审定登记编号为黑认定2019002，庆大麻4号的品种审定登记编号为黑认定2019003，汉麻6号的品种审定登记编号为黑认定2019004，汉麻7号的品种审定登记编号为黑认定2019005，龙大麻5号的品种审定登记编号为黑认定2019006。

实施例1大麻SSR分子标记及引物的确定

根据22个大麻品种(尤纱-31、龙大麻1号、龙大麻2号、火麻一号、庆大麻1号、龙大麻3号、龙麻1号、汉麻2号、汉麻1号、龙麻2号、格列西亚、汉麻5号、汉麻4号、牡麻1号、庆大麻2号、线麻1号、龙大麻4号、庆大麻3号、庆大麻4号、汉麻6号、汉麻7号、龙大麻5号)的基因序列，寻找SSR位点，设计了300对SSR引物；提取庆大麻3号、汉麻7号、龙大麻5号、火麻一号、龙麻1号和尤纱-31的DNA，分别用这300对引物对这六个品种进行PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析比较每对引物的退火温度、是否可扩增、条带特异性、清晰度以及是否均能在六个品种中获得稳定的单一条带等参数，初步筛选出230对引物；对这些引物进行荧光标记，然后对这六个品种的DNA进行PCR和毛细管电泳，根据每个引物的出峰强度、基因型读取难易程度等条件，筛选出75对引物；再根据每对引物的等位基因的分子量范围、PIC值等，初步对这些引物进行分组，根据每个组合由尽可能多的引物组成、且组内所有引物等位基因范围不叠加、引物间互不干扰程的条件，以及最重要的是，能准确读取庆大麻3号、汉麻7号、龙大麻5号、火麻一号、龙麻1号和尤纱-31的基因型数据，且对相应的品种组合能加以区分的条件，最终确定了四组共11对SSR引物。将这个引物组合并分别合成带FAM、VIC、NED、PET荧光基团的引物(见表2)。本领域技术人员能够理解，本领域内还可选择包括FAM、VIC、NED、PET在内的其他荧光基团来修饰表2中的四组引物，只要每组内引物标记相同的荧光基团即可，不限于选择哪一种荧光基团。

表2大麻SSR毛细管电泳引物及引物组合

实施例2利用本发明提供的SSR分子标记区分大麻品种

(1)DNA快速提取

采用CTAB法对大麻种子进行DNA提取。此方法操作快速简便，提取的DNA质量高，适用于植物分子生物学领域的DNA制备，而且对大幅度缩短种子纯度检验、转基因检测时间，提高检测效率，降低检测成本具有重要意义。具体操作步骤为：取大麻种子若干粒进行研磨成粉，置于1.5mL离心管中；在离心管中加入700μL CTAB提取液，65℃孵育30min；在离心管中加入500μL氯仿-异戊醇(24：1)，剧烈震荡，12000rpm离心10min；取上清，加入0.7倍体积的异丙醇，12000rpm离心5min；去掉上清液，用75％乙醇洗涤沉淀2次；室温干燥沉淀，加入200μL TE缓冲液(pH 8.0)，充分溶解后备用。

(2)DNA样品的质量和数量

在紫外分光光度仪上检测DNA样品260nm和280nm的OD值，选择OD_260/280值为1.8-1.9的样品用于检测。

(3)核心引物选择

通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、PCR扩增稳定性和扩增产物带型，选择实施例1确定的能够满足毛细管荧光检测技术的引物，具体见表2。

(4)PCR扩增和毛细管电泳检测

将筛选出的特异性SSR引物进行荧光染料标记，共选用PET、NED、VIC、FAM四种荧光染料。PCR扩增采用20μL的反应体积，含样品DNA 10-40ng，正向引物、反向引物各0.4μM，2×聚合酶混合物10μL。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。

将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.5μL LIZ500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LIZ500进行比较，直接给出目标DNA片段的准确大小。表2中各组引物扩增庆大麻3号和汉麻7号所得的扩增产物的目的条带大小见表3。表2中各组引物扩增龙大麻5号和火麻一号所得的扩增产物的目的条带大小见表4。表2中各组引物扩增龙麻1号和尤纱-31所得的扩增产物的目的条带大小见表5。

表3庆大麻3号和汉麻7号的目的条带大小比较

表4龙大麻5号和火麻一号的目的条带大小比较

表5龙麻1号和尤纱-31的目的条带大小比较

(5)引物组合的判定

以庆大麻3号DNA为模板，分别用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以庆大麻3号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与FAM、VIC、NED、PET四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1A-图1D)，可以看到，在FAM、VIC、NED、PET单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物混合物可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。分别以汉麻7号(图2A-图2D)、龙大麻5号(图4A-图4D)、火麻一号(图5A-图5D)、龙麻1号(图7A-图7D)和尤纱-31(图8A-图8D)DNA为模板进行相同的实验，可得到相同的结论。

(6)大麻品种的区分

分别以庆大麻3号和汉麻7号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到庆大麻3号和汉麻7号的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，庆大麻3号在172和257bp出现FAM蓝色峰，汉麻7号在211和260bp出现FAM蓝色峰；庆大麻3号在177、232、240和299bp出现VIC绿色峰，汉麻7号在183、232、246和315bp出现VIC绿色峰；庆大麻3号在173、177、240、243、312和315bp出现NED黄色峰，汉麻7号在195、243、247和312bp出现NED黄色峰；庆大麻3号在178、230、236、286和289bp出现PET红色峰，汉麻7号在181、227、233、279和289bp出现PET红色峰。庆大麻3号及汉麻7号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分庆大麻3号和汉麻7号。

分别以龙大麻5号和火麻一号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到龙大麻5号和火麻一号的毛细管电泳图并进行比较。从图6中可以看出，龙大麻5号在172和242bp出现FAM蓝色峰，火麻一号在169、179和263bp出现FAM蓝色峰；龙大麻5号在177、181、232和312bp出现VIC绿色峰，火麻一号在177、232、240和311bp出现VIC绿色峰；龙大麻5号在173、177、240、243、312和315bp出现NED黄色峰，火麻一号在177、181、240、243、312和315bp出现NED黄色峰；龙大麻5号在178、181、233、281和289bp出现PET红色峰，火麻一号在178、230、236和286bp出现PET红色峰。龙大麻5号及火麻一号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分龙大麻5号和火麻一号。

分别以龙麻1号和尤纱-31DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到龙麻1号和尤纱-31的毛细管电泳图并进行比较。从图9中可以看出，龙麻1号在172和254bp出现FAM蓝色峰，尤纱-31在172、203和249bp出现FAM蓝色峰；龙麻1号在177、181、232和311bp出现VIC绿色峰，尤纱-31在177、232和312bp出现VIC绿色峰；龙麻1号在177、240、243、312和315bp出现NED黄色峰，尤纱-31在173、177、240、243、253、312和315bp出现NED黄色峰；龙麻1号在178、181、233、286和289bp出现PET红色峰，尤纱-31在178、233、236、286和289bp出现PET红色峰。龙麻1号及尤纱-31的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分龙麻1号和尤纱-31。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所

<120> 一组大麻SSR分子标记及其应用

<130> KHP211118087.9

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaagaagta gagagacaat cc 22

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgtaaaacga cggccagtcc ctcaacactc attaactcac 40

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccccaaatt cccaatctat 20

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaaaacga cggccagtgc ctcgtgatcc atctctct 38

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccaataaga tttcacagtc g 21

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtaaaacga cggccagtta acgggttctt tgggtatt 38

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgaatgggat gattttgtgt g 21

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtaaaacga cggccagttt gtttctcgta atcccttttc a 41

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgaattggtt acgatggcg 19

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtaaaacga cggccagtgt ggtggtgatg atgataatgg 40

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcgtaggaa tggtttgctg 20

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgtaaaacga cggccagtga gaaaaagaga aagggaaatg g 41

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aactgccgaa gcttctcctt 20

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtaaaacga cggccagtgc tagggctaat taataagatg aagag 45

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctcactgaac gaacgatttg 20

<210> 16

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgtaaaacga cggccagtgc agttggacta ctctcgct 38

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agcagcttca tcggactcat 20

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtaaaacga cggccagtga tgctgcattg gtgaattg 38

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

aggtcagaac ccagctcaga 20

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgtaaaacga cggccagttc gatccaaaag gaagcaac 38

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgtccaatat cttgccgaat 20

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgtaaaacga cggccagtta gccacggagg aagaagaa 38

Claims (9)

1.包含大麻SSR分子标记的核酸片段的组合，其特征在于，所述包含大麻SSR分子标记的核酸片段分别依次通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.3-4，SEQ IDNO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ ID NO.13-14，SEQ IDNO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22。

2.用于扩增权利要求1所述的包含大麻SSR分子标记的核酸片段的组合的特异性引物组，其特征在于，所述特异性引物组包括如下引物对：SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.3-4，SEQID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ ID NO.13-14，SEQ IDNO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22。

3.试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引物组。

4.大麻基因组芯片，其特征在于，含有权利要求1所述的包含大麻SSR分子标记的核酸片段的组合。

5.权利要求1所述的包含大麻SSR分子标记的核酸片段的组合或权利要求2所述的特异性引物组或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的大麻基因组芯片在构建大麻品种DNA指纹数据库中的应用。

6.权利要求1所述的包含大麻SSR分子标记的核酸片段的组合或权利要求2所述的特异性引物组或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的大麻基因组芯片在大麻种质资源遗传多样性分析或种子质量检测中的应用。

7.权利要求1所述的包含大麻SSR分子标记的核酸片段的组合或权利要求2所述的特异性引物组或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的大麻基因组芯片在大麻的品种鉴定、亲缘关系分析、母系溯源中的应用。

8.权利要求1所述的包含大麻SSR分子标记的核酸片段的组合或权利要求2所述的特异性引物组或权利要求3所述的试剂盒或权利要求4所述的大麻基因组芯片在大麻分子标记辅助育种中的应用。

9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测大麻样品的DNA；

2)以步骤1)提取的DNA为模板进行PCR扩增；

3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。