CN113584214B - 适用于毛细管电泳检测技术的大麻ssr分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供适用于毛细管电泳检测技术的大麻SSR分子标记及其应用。所述的SSR分子标记，共11个SSR分子标记，基于这11个SSR分子标记，本发明还提供一套适于毛细管电泳平台的检测所述SSR分子标记的引物组合。利用这11个SSR分子标记可以：鉴定大麻品种及分析遗传多样性；区分大麻格列西亚和龙大麻1号、龙大麻5号和庆大麻3号、火麻一号和尤纱‑31品种。通过本发明的大麻SSR分子标记的应用，能够在基因组水平上拓展大麻可用标记位点的范围；为大麻品种、种质资源鉴定，亲缘关系评价，细胞质遗传特性等研究提供新工具，应用前景良好。

Description

适用于毛细管电泳检测技术的大麻SSR分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及农作物分子育种与鉴定技术领域，具体涉及适用于毛细管电泳检测技术的大麻SSR分子标记及其应用。
背景技术
大麻(Cannabis sativa L.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻属(Cannabis)一年生草本植物，是最古老的作物之一。工业大麻是重要的经济作物，其茎秆、籽粒、花叶乃至全株均是优质的原材料，具有重要的利用价值；其纤维可加工应用于纺织、造纸和复合材料等行业；麻籽可直接或加工食用，可应用于食品保健等行业；花叶提取物可应用于医药、化妆品等行业。大麻中的大麻二酚(CBD,cannabidiol)，其属于萜酚类化合物，具有丰富的药理学作用。大麻中致幻成分四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)是区分毒品大麻的重要指标，THC含量低于0.3％的大麻品种称为工业大麻。尤纱-31是中国从乌克兰引进的高纤维含量品种；格列西亚、龙大麻1号、龙大麻5号、庆大麻3号和火麻一号是中国经过育种改良的杂交品种，其除了纤维高、抗病抗倒伏的优点外，还适宜在中国东北部种植。将龙大麻5号、尤纱-31、庆大麻3号、龙大麻1号、格列西亚和火麻一号在田间种植，通过调查和观测其农艺性状发现，格列西亚和龙大麻1号、龙大麻5号和庆大麻3号、火麻一号和尤纱-31分别在子叶形状、子叶色、雄花色、雌花色、叶长和叶宽上有很大的相似性(表1)，在外观上很难加以分辨。大麻是雌雄异株、异花授粉作物，在培育过程中极易接受外来花粉干扰，品种间极易杂交。中国是大麻的起源中心，种质资源丰富，大麻产业对中国的经济有重要的推动前景，如若大麻种子混淆，势必会造成品种内混杂、纯度低，品种优势不得体现，不仅造成市场混乱，给经济带来影响，更为严重的是影响大麻育种研究工作。因此，大麻纯度鉴定及品种区分是大麻种子质量控制体系中的关键环节。
传统的品种真实性鉴定是田间种植后，通过对农艺性状的观测和调查来实现，这种方法工作量大、繁琐，费人力物力财力。随着分子生物技术的发展，分子标记种类和检测手段日趋完善，各种分子标记已经广泛应用于玉米遗传多样性研究中。其中，简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)标记因具有简便、快捷、重复性高、多态性高、共显性标记等优点而被广泛应用。传统的SSR操作通过聚丙烯酰胺凝胶电泳配合其他一些生物技术来进行基因的多态性分析，这些方法非自动化、耗时，不同等位变异难以准确识别、不同批次反应数据难以统一处理。荧光标记毛细管电泳检测技术因具有高效、自动化的优点，在多种植物分子标记研究中显示出极为广阔的应用前景。该方法采用几种不同颜色的荧光染料标记SSR引物，再将不同荧光标记、扩增片段长度有差异的PCR产物和标准分子量样品在同一泳道中进行电泳。通过图像采集和分析，可精确计算出等位变异扩增片段的大小，实现了SSR标记与高效、自动化技术的结合。在这个技术过程中，如何找出不同荧光标记的引物，并进行组合、且PCR产物长度有差异、能有效准确分辨产物大小，是SSR的关键技术环节。
表1大麻品种的主要农艺性状调查
性状 格列西亚 龙大麻1号 龙大麻5号 庆大麻3号 尤纱-31 火麻一号
子叶形状 卵圆 卵圆 长椭圆 卵圆 卵圆 卵圆
子叶色 绿 深绿 深绿 深绿 绿 绿
雄花色 绿 绿 紫 紫 绿 绿
雌花色 黄绿 黄绿 绿 黄绿 黄绿 黄绿
叶长(厘米) 10.23±1.87 11.54±1.24 8.11±1.98 9.38±1.35 23.08±2.17 22.49±2.59
叶宽(厘米) 16.66±2.09 17.39±1.56 10.04±1.71 11.23±1.38 28.54±2.33 26.55±2.86
发明内容
本发明的目的是提供适用于毛细管电泳检测技术的大麻SSR分子标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明通过收集来源广泛、表型和基因型种类丰富、代表性强的大麻材料，对相应材料的大麻基因组进行测序并比较，进而获得了一组适用于毛细管电泳检测技术的大麻SSR分子标记。
本发明提供的适用于毛细管电泳检测技术的大麻SSR分子标记包括以下11个SSR分子标记的一个或多个，11个大麻SSR分子标记分别为ANUCS501，B02CANN2，CAN0026，H06CANN2，41，CAN0690，48，ANUCS308，B05CANN1，CAN0486，CAN1419。
所述11个大麻SSR分子标记分别依次通过以下引物扩增得到：SEQ ID NO.1-2，SEQID NO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22。
上述SSR分子标记可采用本领域常规技术手段进行检测，同时，能够适用于毛细管电泳检测技术。基于毛细管电泳检测技术的SSR分子标记技术可以得到定量的DNA片段分析数据。与常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法相比，其结果更为精确、灵敏、高效，更适用于大批量品种的检测分析。
在进行毛细管电泳检测时，可将上述SSR分子标记分为若干个不同荧光标记组，每组内的荧光标记相同。
作为本发明的一种实施方式，可将上述SSR分子标记分为四个不同荧光标记组，每组内的荧光标记相同：
第一组由SSR分子标记ANUCS501，B02CANN2，CAN0026，H06CANN2组成；第二组由SSR分子标记41，CAN0690，48组成；第三组由SSR分子标记ANUCS308，B05CANN1，CAN0486组成；第四组由SSR分子标记CAN1419组成。
进一步，本发明提供了用于扩增上述SSR分子标记的特异性引物对。
优选地，所述特异性引物对包括如下引物对中的一个或多个：SEQ ID NO.1-2，SEQID NO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ ID NO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ IDNO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQ ID NO.19-20，SEQ ID NO.21-22。
本发明还提供一种试剂盒，其含有上述用于扩增上述大麻SSR分子标记的特异性引物对。
本发明还提供大麻基因组芯片，其含有上述大麻SSR分子标记。
本发明提供上述SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在构建大麻品种DNA指纹数据库中的应用。
本发明提供上述SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻种质资源遗传多样性分析或种子质量检测中的应用。
本发明提供上述SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻品种鉴定、亲缘关系分析、母系溯源中的应用。
对于大麻品种的鉴定，作为示例，本发明提供在区分格列西亚和龙大麻1号、龙大麻5号和庆大麻3号、火麻一号和尤纱-31品种中的应用。本发明提供用于区分格列西亚和龙大麻1号、龙大麻5号和庆大麻3号、火麻一号和尤纱-31品种的试剂盒，其含有针对本发明的11个大麻SSR分子标记的特异性引物组合。优选地，所述特异性引物组合的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-22所示。
本发明提供上述SSR分子标记、上述特异性引物、上述试剂盒、上述大麻基因组芯片在大麻分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供上述大麻SSR分子标记在制备大麻基因组芯片中的应用。
以上所述的应用，具体包括以下步骤：
1)提取待测大麻样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用上述SSR分子标记，进行PCR扩增；
3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。
上述应用的步骤2)中，PCR扩增采用20μL的反应体积，含样品DNA 10-40ng，正向引物、反向引物各0.4μM，2×聚合酶混合物10μL。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
步骤3)中，可通过进行一次性毛细管电泳，将得到的扩增产物的电泳图进行比较，通过分析电泳图的条带情况确定大麻品种。
本发明提供的上述11对SSR引物可以在荧光毛细管电泳平台上实现基因分型数据的获得。具体方案为，每对引物的其中一条的5'端标记荧光基团；配制PCR反应体系加入DNA、引物、聚合酶混合物；运行反应程序；扩增产物在荧光毛细管电泳系统上检测；利用毛细管电泳系统配套软件收集原始数据，导入基因型软件分析原始数据获得片段长度格式的基因型数据。
优选地，将本发明的11对特异性SSR引物进行荧光染料标记，共选用了PET、NED、VIC、FAM四种荧光染料。将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.5μL LIZ500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LIZ500进行比较，直接给出目标DNA片段的准确大小。
在本发明的实施例的一个较佳实施方案中，FAM荧光标记组的SSR分子标记为ANUCS501，B02CANN2，CAN0026，H06CANN2；VIC荧光标记组的SSR分子标记为41，CAN0690，48；NED荧光标记组的SSR分子标记为ANUCS308，B05CANN1，CAN0486；PET荧光标记组的SSR分子标记为CAN1419。以格列西亚DNA为模板，分别用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物的PCR产物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以格列西亚的DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物的PCR产物混合物进行一次毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与FAM、VIC、NED、PET四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1A-图1D)，可以看到，在FAM、VIC、NED、PET单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物组合(共11对引物)可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。以龙大麻1号(图2A-图2D)、龙大麻5号(图4A-图4D)、庆大麻3号(图5A-图5D)、火麻一号(图7A-图7D)和尤纱-31(图8A-图8D)DNA为模板进行相同的实验，可得到相同的结论。
实施例中分别以格列西亚和龙大麻1号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合进行一次性毛细管电泳，分别得到格列西亚和龙大麻1号的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，格列西亚在108、181、184、243和288bp出现FAM蓝色峰，龙大麻1号在108、181、184、243、288和291bp出现FAM蓝色峰；格列西亚在174、181、252、293和301bp出现VIC绿色峰，龙大麻1号在174、187、252、296和301bp出现VIC绿色峰；格列西亚在202、256、260、294和303bp出现NED黄色峰，龙大麻1号在202、256、294和300bp出现NED黄色峰；格列西亚在266bp出现PET红色峰，龙大麻1号在266和291bp出现PET红色峰。格列西亚及龙大麻1号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，且均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分大麻格列西亚和龙大麻1号。相同地，用本发明专利提供的荧光标记引物组合可在一次毛细管电泳中区分龙大麻5号和庆大麻3号(图6)、火麻一号和尤纱-31(图9)。
本发明的不同荧光标记的扩增产物可在同一泳道中进行电泳，其信号清晰，扩增片段大小差异明显，可精确计算片段大小，每个DNA样品电泳峰型各异，易于判断。具有灵敏度高、分辨力好，结果准确可靠、高效快速等优点。用本发明提供的引物组合，可方便快速地将格列西亚和龙大麻1号、龙大麻5号和庆大麻3号、火麻一号和尤纱-31品种区分开，实现了节约成本、提高效率、操作方便、结果准确的优势。本发明提供的该组引物可用于大麻指纹图谱构建、品种鉴定及遗传多样性分析等，应用前景十分广阔。
附图说明
图1A-图1D分别为格列西亚SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图1A为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图1B为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图1C为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图1D为格列西亚经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。各图比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的DNA指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。
图2A-图2D为龙大麻1号的SSR荧光标记毛细管电泳检测结果。其中，图2A为龙大麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图2B为龙大麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图2C为龙大麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图2D为龙大麻1号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。各图的比较结果分别说明，单色荧光标记引物的电泳图上出现的目的峰均能在四色荧光标记引物组合电泳图上分辨出来(箭头所指示为出现的目的峰)，且每个目的峰互不干扰，可清晰读出品种的DNA指纹信息。即说明本发明提供的引物组合可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果的同时又节省了时间、实验试剂与耗材。图1A-图1D和图2A-图2D均为了说明同一个目的，两个品种(格列西亚和龙大麻1号)的实验结果更能说明本专利提供的引物组合的实用性与可靠性。
图3为用本申请提供的11个大麻SSR分子标记对格列西亚和龙大麻1号进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。结果说明，格列西亚(上图)显示的FAM目的峰(蓝色)与龙大麻1号(下图)显示的FAM目的峰(均用箭头标出)清晰可辨，且目的峰分子量不同。同理，两个品种显示的VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本专利提供的引物组合能够对格列西亚及龙大麻1号进行品种区分。
图4A-图4D分别为龙大麻5号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图4A为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图4B为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图4C为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图4D为龙大麻5号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。
图5A-图5D分别为庆大麻3号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图5A为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图5B为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图5C为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图5D为庆大麻3号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。
图6为用本申请提供的11个大麻SSR分子标记对龙大麻5号和庆大麻3号进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。两个品种显示的FAM、VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本专利提供的引物组合能够对龙大麻5号及庆大麻3号进行品种区分。
图7A-图7D分别为火麻一号SSR荧光标记毛细管电泳图，其中，图7A为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图7B为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图7C为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图7D为火麻一号经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。
图8A-图8D分别为尤纱-31SSR荧光标记毛细管电泳图，图8A为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经FAM标记引物电泳结果的比较。图8B为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经VIC标记引物电泳结果的比较。图8C为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经NED标记引物电泳结果的比较。图8D为尤纱-31经FAM、VIC、NED及PET荧光标记引物组合电泳结果与只经PET标记引物电泳结果的比较。
图9为用本申请提供的11个大麻SSR分子标记对火麻一号和尤纱-31进行毛细管电泳图，并对两者进行比较的结果。同理，两个品种显示的FAM、VIC、NED、PET目的峰分子量各异，并清晰可辨。说明用本专利提供的引物组合能够对火麻一号及尤纱-31进行品种区分。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件。本发明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
若未特别说明，本发明实施例所用生化试剂均为市售，所用大麻材料均为本领域公知公用的大麻，其中，尤纱-31的品种审定登记编号为黑登记2006005，龙大麻1号的品种审定登记编号为黑登记2011003，龙大麻2号的的品种审定登记编号为黑登记2013009，火麻一号的品种审定登记编号为黑登记2015005，庆大麻1号的品种审定登记编号为黑登记2016012，龙大麻3号的品种审定登记编号为黑登记2016013，龙麻1号的品种审定登记编号为黑认定2017002，汉麻2号的品种审定登记编号为黑认定2017003，汉麻1号的品种审定登记编号为黑认定2017004，龙麻2号的品种审定登记编号为黑认定2017005，格列西亚的品种审定登记编号为黑认定2017006，汉麻5号的品种审定登记编号为黑认定2018001，汉麻4号的品种审定登记编号为黑认定2018002，牡麻1号的品种审定登记编号为黑认定2018003，庆大麻2号的品种审定登记编号为黑认定2018004，线麻1号的品种审定登记编号为黑认定2018005，龙大麻4号的品种审定登记编号为黑认定2019001，庆大麻3号的品种审定登记编号为黑认定2019002，庆大麻4号的品种审定登记编号为黑认定2019003，汉麻6号的品种审定登记编号为黑认定2019004，汉麻7号的品种审定登记编号为黑认定2019005，龙大麻5号的品种审定登记编号为黑认定2019006。
实施例1大麻SSR分子标记及引物的确定
根据22个大麻品种(尤纱-31、龙大麻1号、龙大麻2号、火麻一号、庆大麻1号、龙大麻3号、龙麻1号、汉麻2号、汉麻1号、龙麻2号、格列西亚、汉麻5号、汉麻4号、牡麻1号、庆大麻2号、线麻1号、龙大麻4号、庆大麻3号、庆大麻4号、汉麻6号、汉麻7号、龙大麻5号)的基因序列，寻找SSR位点，设计了300对SSR引物；提取格列西亚、龙大麻1号、龙大麻5号、庆大麻3号、火麻一号和尤纱-31的DNA，分别用这300对引物对这六个品种进行PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析比较每对引物的退火温度、是否可扩增、条带特异性、清晰度以及是否均能在六个品种中获得稳定的单一条带等参数，初步筛选出230对引物；对这些引物进行荧光标记，然后对这六个品种的DNA进行PCR和毛细管电泳，根据每个引物的出峰强度、基因型读取难易程度等条件，筛选出65对引物；再根据每对引物的等位基因的分子量范围、PIC值等，初步对这些引物进行分组，根据每个组合由尽可能多的引物组成、且组内所有引物等位基因范围不叠加、引物间互不干扰程的条件，以及最重要的是，能准确读取格列西亚、龙大麻1号、龙大麻5号、庆大麻3号、火麻一号和尤纱-31的基因型数据，且对相应的品种组合能加以区分的条件，最终确定了四组共11对SSR引物。将这个引物组合并分别合成带FAM、VIC、NED、PET荧光基团的引物(见表2)。本领域技术人员能够理解，本领域内还可选择包括FAM、VIC、NED、PET在内的其他荧光基团来修饰表2中的四组引物，只要每组内引物标记相同的荧光基团即可，不限于选择哪一种荧光基团。
表2大麻SSR毛细管电泳引物及引物组合
实施例2利用本发明提供的SSR分子标记区分大麻品种
(1)DNA快速提取
采用CTAB法对大麻种子进行DNA提取。此方法操作快速简便，提取的DNA质量高，适用于植物分子生物学领域的DNA制备，而且对大幅度缩短种子纯度检验、转基因检测时间，提高检测效率，降低检测成本具有重要意义。具体操作步骤为：取大麻种子若干粒进行研磨成粉，置于1.5mL离心管中；在离心管中加入700μL CTAB提取液，65℃孵育30min；在离心管中加入500μL氯仿-异戊醇(24：1)，剧烈震荡，12000rpm离心10min；取上清，加入0.7倍体积的异丙醇，12000rpm离心5min；去掉上清液，用75％乙醇洗涤沉淀2次；室温干燥沉淀，加入200μL TE缓冲液(pH 8.0)，充分溶解后备用。
(2)DNA样品的质量和数量
在紫外分光光度仪上检测DNA样品260nm和280nm的OD值，选择OD260/280值为1.8-1.9的样品用于检测。
(3)核心引物选择
通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、PCR扩增稳定性和扩增产物带型，选择实施例1确定的能够满足毛细管荧光检测技术的引物，具体见表2。
(4)PCR扩增和毛细管电泳检测
将筛选出的特异性SSR引物进行荧光染料标记，共选用PET、NED、VIC、FAM四种荧光染料。PCR扩增采用20μL的反应体积，含样品DNA 10-40ng，正向引物、反向引物各0.4μM，2×聚合酶混合物10μL。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min。
将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍；分别取等体积上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.5μL LIZ500分子量内标和8.5μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。用GeneMapper软件对收集的原始数据进行分析。软件系统根据目标峰的位置与同一泳道中的内标LIZ500进行比较，直接给出目标DNA片段的准确大小。表2中各组引物扩增格列西亚和龙大麻1号所得的扩增产物的目的条带大小见表3。表2中各组引物扩增龙大麻5号和庆大麻3号所得的扩增产物的目的条带大小见表4。表2中各组引物扩增火麻一号和尤纱-31所得的扩增产物的目的条带大小见表5。
表3格列西亚和龙大麻1号的目标条带大小比较
表4龙大麻5号和庆大麻3号的目标条带大小比较
表5火麻一号和尤纱-31的目标条带大小比较
(5)引物组合的判定
以格列西亚DNA为模板，分别用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的四组引物进行四次毛细管电泳，得到四个电泳图结果；再以格列西亚DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记的全部引物混合物进行毛细管电泳得到总电泳图结果。将总电泳图结果分别与FAM、VIC、NED、PET四组荧光标记引物电泳的结果进行比较(图1A-图1D)，可以看到，在FAM、VIC、NED、PET单独电泳图上出现的目的峰均能在总电泳图上分辨出来，且每个颜色的峰互不干扰，即说明本发明提供的引物混合物可用于一次毛细管电泳，目的条带互不干扰，易于判断结果。分别以龙大麻1号(图2A-图2D)、龙大麻5号(图4A-图4D)、庆大麻3号(图5A-图5D)、火麻一号(图7A-图7D)和尤纱-31(图8A-图8D)DNA为模板进行相同的实验，可得到相同的结论。
(6)大麻品种的区分
分别以格列西亚和龙大麻1号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到格列西亚和龙大麻1号的毛细管电泳图并进行比较。从图3中可以看出，格列西亚在108、181、184、243和288bp出现FAM蓝色峰，龙大麻1号在108、181、184、243、288和291bp出现FAM蓝色峰；格列西亚在174、181、252、293和301bp出现VIC绿色峰，龙大麻1号在174、187、252、296和301bp出现VIC绿色峰；格列西亚在202、256、260、294和303bp出现NED黄色峰，龙大麻1号在202、256、294和300bp出现NED黄色峰；格列西亚在266bp出现PET红色峰，龙大麻1号在266和291bp出现PET红色峰。格列西亚及龙大麻5号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，且均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分格列西亚和龙大麻1号。
分别以龙大麻5号和庆大麻3号DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到龙大麻5号和庆大麻3号的毛细管电泳图并进行比较。从图6中可以看出，龙大麻5号在108、184、243和288bp出现FAM蓝色峰，庆大麻3号在107、108、113、181、184、243和288bp出现FAM蓝色峰；龙大麻5号在174、181、252和301bp出现VIC绿色峰，庆大麻3号在174、181、187、252和301bp出现VIC绿色峰；龙大麻5号在202、256、260和303bp出现NED黄色峰，庆大麻3号在202、256、294和303bp出现NED黄色峰；龙大麻5号在266bp出现PET红色峰，庆大麻3号在266和291bp出现PET红色峰。
龙大麻5号及庆大麻3号的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，且均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分龙大麻5号和庆大麻3号。
分别以火麻一号和尤纱-31DNA为模板，用FAM、VIC、NED、PET荧光标记引物组合(见表2)进行一次性毛细管电泳，分别得到火麻一号和尤纱-31的毛细管电泳图并进行比较。从图9中可以看出，火麻一号在107、181、243和288bp出现FAM蓝色峰，尤纱-31在108、181、184、243和288bp出现FAM蓝色峰；火麻一号在174、252、296和301bp出现VIC绿色峰，尤纱-31在174、181、252、293和301bp出现VIC绿色峰；火麻一号在202、206、253、256、260、294、300和306bp出现NED黄色峰，尤纱-31在202、204、257、260和304bp出现NED黄色峰；火麻一号在266和291bp出现PET红色峰，尤纱-31在266bp出现PET红色峰。火麻一号及尤纱-31的每个荧光标记至少有2-3个差异峰的出现，且均不重叠，清晰可辨。因此，用本发明专利提供的荧光标记引物组合(表2)可在一次毛细管电泳中区分火麻一号和尤纱-31。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所
<120> 适用于毛细管电泳检测技术的大麻SSR分子标记及其应用
<130> KHP211118091.4
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagatcaag aaattgagat tcc 23
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtaaaacga cggccagtag caataatgga gtgagtgaac 40
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgttttcttc actgcaccc 19
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtaaaacga cggccagtca accaaatgag aatgcaacc 39
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggagcagaa caaaatggag 20
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtaaaacga cggccagtta aaccgggtca accatact 38
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgtgagtga tgacacgag 19
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtaaaacga cggccagttg gtttcagtgg tcctctc 37
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgctgactc actttccttc 20
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtaaaacga cggccagtgt cctgagctat ggcagttt 38
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgaagcgtt ggtactaggc 20
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtaaaacga cggccagtca aacaggggaa aagagaga 38
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggtatgcag tgtttggtta 20
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtaaaacga cggccagtgt cagttctctc tcaaatgc 38
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tggtgcaggt ttatacaatt t 21
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgtaaaacga cggccagtag atggtgttgg gtatcttt 38
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccccaatctc aatctcaacc c 21
<210> 18
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtaaaacga cggccagttt gatggtggtg aaacggc 37
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcttcatata ctgcaagccc 20
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgtaaaacga cggccagtgg gaagccacaa tttctcta 38
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgaggatcat catggttcag 20
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgtaaaacga cggccagttt ttccttctcc gctacatc 38

Claims (7)

1.用于扩增大麻SSR分子标记的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包括如下引物对：SEQ ID NO.1-2，SEQ ID NO.3-4，SEQ ID NO.5-6，SEQ ID NO.7-8，SEQ IDNO.9-10，SEQ ID NO.11-12，SEQ ID NO.13-14，SEQ ID NO.15-16，SEQ ID NO.17-18，SEQID NO.19-20以及SEQ ID NO.21-22。
2.试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异性引物组合。
3.权利要求1所述的特异性引物组合或权利要求2所述的试剂盒在构建大麻品种DNA指纹数据库中的应用。
4.权利要求1所述的特异性引物组合或权利要求2所述的试剂盒在大麻种质资源遗传多样性分析或种子质量检测中的应用。
5.权利要求1所述的特异性引物组合或权利要求2所述的试剂盒在大麻的品种鉴定、亲缘关系分析、母系溯源中的应用。
6.权利要求1所述的特异性引物组合或权利要求2所述的试剂盒在大麻分子标记辅助育种中的应用。
7.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测大麻样品的DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用所述特异性引物组合进行PCR扩增；
3)采用毛细管电泳系统检测PCR产物。
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