CN113862389A

CN113862389A - 一种秋茄dna指纹图谱的构建及应用

Info

Publication number: CN113862389A
Application number: CN202111192639.0A
Authority: CN
Inventors: 刘星; 王金旺; 杨升; 魏馨; 卢翔; 李效文; 陈秋夏
Original assignee: ZHEJIANG SUBTROPICAL CROPS RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: ZHEJIANG SUBTROPICAL CROPS RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2021-10-13
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2021-12-31
Anticipated expiration: 2041-10-13
Also published as: CN113862389B

Abstract

本发明涉及一种秋茄DNA指纹图谱的构建及应用，具体而言，所述DNA指纹图谱包含14对InDel标记,能够同时准确区分至少14个不同来源地的秋茄品种。本发明的秋茄InDel标记具有特异性好、稳定性强，操作简单，检测快速的特点。

Description

一种秋茄DNA指纹图谱的构建及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种秋茄DNA指纹图谱的构建及应用。

背景技术

秋茄是红树科、秋茄属植物，是红树林的常见品种，果实形状似笔，成熟后跟茄子非常相似，因此得名。由于受到海水周期性浸淹，秋茄富含单宁酸，被砍伐后会氧化变成红色。秋茄是最能够耐寒的红树林种类之一，兼具陆地植物群落和海洋植物群落的双重特性，在自然生态平衡中有特殊作用。红树林群落除了在湿地生态系统中具有促进土壤沉积物形成、过滤有机物和污染物以及净化水质等重要作用外，还有抵抗潮汐和洪水冲击、减缓风浪、调节水流以及保护堤岸等功能，是海防造林重要的物种，因而颇受人们的青睐。

植物学家根据秋茄的分布地理区系、染色体数目、生理生态适应能力以及叶的解剖结构，认为秋茄树按照地理位置可清楚地分为两个不同的种，即Kandelia candel或Kandelia obovate。人们发现二者在激素信号转导和病原菌互作等生物学过程中的明显差异，这可能表明两种秋茄在不同的分布区域有着差异性的生物学过程。人们知道，物种进化过程是种群遗传结构不断变化和演变的过程，通过研究遗传结构来推测种群间基因流、种群重建的历史是亲缘地理研究的基础。因此，快速准确的对秋茄品种进行鉴定，对防风减灾、促淤保滩、固岸护堤、净化海水、研究物种进化等方面具有重要的意义和价值。

在品种鉴定中，田间种植鉴定虽具有适用范围广泛、鉴定结果可靠等优点，但该方法时间长、效率低、工作量大、结果滞后。一般而言，所需鉴定目标性状大多为数量性状，受环境影响较大，需要具有一定田间检验经验的人员才能保证检测准确性，而DNA指纹图谱技术则具有高效、准确、实验操作简单、不受环境影响等优点，已广泛应用于植物品种真实性鉴定及纯度检测研究。

目前比较成熟、应用比较广泛的DNA指纹图谱技术包括RAPD、 ISSR、InDel等，这些技术各有优势。例如，RAPD、ISSR分子标记方法所需DNA量少、操作简单，最突出的优势是不需预知研究对象的基因组序列。InDel是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失(insertion- deletion),是同源序列比对产生空位(gap)的现象。InDel变异序列两侧多是相对保守的单拷贝序列，可以通过设计特异性引物，对基因组 DNA进行PCR扩增，通过检测扩增产物片段长度区分InDel变异。由于InDel分子标记具有数量丰富、多态性高、重复性好、遗传共显性、谱带扩增稳定、精度高、检测时间短、技术成熟等特点，在植物品种鉴定及纯度检测的方面具有广阔的应用前景。

尽管InDel作为一种高通量遗传标记,目前已开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域, 但其大规模的开发应用仍存在较大的阻碍。最大的原因在于，InDel位点主要通过同源序列比对分析获得,但序列已知的生物种类有限,大多为模式物种或经济作物,对于非模式生物而言,大量基因组序列未知,导致InDel引物设计与开发存在一定的难度(杨洁等，InDel标记的研究和应用进展，生物多样性，2016,24(2):237–243)。科研人员熟知，InDel检测的基本流程包括：1)对个体基因组进行测序得到相应的测序片段；2)将前一步骤中生成的测序片段比对到参考基因组上；3)在比对结果中寻找异常并进行分析判断InDel。因此，获得 InDel标记最重要的前提是具备可靠的参考基因组序列。

然而，目前对红树林植物的研究大多涉及生态功能、资源状况及其保护情况等，对红树林化学成分、生物活性及其药理作用也有一些研究，但对红树林尤其是秋茄在分子水平上的信息十分有限，例如，阮宇利用叶绿体基因和核基因相结合的方式研究秋茄种群遗传(阮宇，秋茄种群遗传结构特征及亲缘地理关系的研究，北京林业大学博士学位论文，2014)；何姗姗通过从头测序和组装获得了秋茄的初步基因组(何姗姗，红树植物秋茄Kandelia obovata的低温驯化机制研究和秋茄属基因组多态性分析，厦门大学硕士学位论文，2018)等。迄今，人们关于秋茄基因组的了解还只是依靠初步的、不完整的、不精确的测序结果，这些结果没有经过不同实验者的反复校准，基因组信息中存在大量的遗漏片段，有的是实验设计导致的，有的是测序拼接错误导致的等，因此，根本无法建立标准的参考基因组，这也使构建秋茄 DNA指纹图谱的InDel标记变得十分困难——很显然，没有人能在缺乏参考基因组的前提下容易地确定：对于在庞大的基因组测序数据中那些数以万计的插入和缺失之处，哪些位置是操作问题、哪些位置是测序错误、哪些位置是真正的InDel变异。

开发秋茄InDel标记的另一挑战是目前还没有公认的标准来评价用于检测InDel的生物信息学方法的好坏。这是因为，InDel产生主要与基因组的特征和DNA复制错误有关，然而大部分插入/缺失突变的产生机制现在仍旧未知。插入和删除的比例会因为测序错误而增加，并且在这些测序错误区域，真实InDel多态性率也增加，这带来了额外的分析挑战。

综上，不难理解，将测序片段映射到标准参考基因组上是所有使用高通量测序数据进行结构变异检测的方法的第一步。与模式物种或经济作物等不同，由于缺乏可靠的标准参考基因组，开发秋茄的InDel 分子标记进行秋茄品种鉴定已成为本领域亟待攻克的技术难关。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种秋茄的InDel标记。

本发明的目的还在于提供一种秋茄的InDel标记的构建方法。

本发明的目的还在于提供一种秋茄的InDel标记的应用。

附图说明

图1 14个InDel标记引物对的琼脂糖凝胶电泳胶图。

图2秋茄品种的DNA指纹图谱信息。

图3 6个对比引物对的琼脂糖凝胶电泳胶图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1InDel标记的开发思路

由于没有可靠的秋茄全基因组参考序列，开发InDel标记用于构建秋茄DNA指纹图谱需要科研人员进行独创性的工作。

首先，尽管很多都是不完善的信息或是初步测序的结果，发明人还是尽多收集了秋茄分子水平的信息。其次，发明人使用了新的生物信息学判定方法，其是在经典的Needleman-Wunsch算法进行了改进，这样更有利于准确地判断缺失或插入位点是否为InDel标记。这种改进的算法的原理如下：

假设有两条序列S＝"AATCGTTA"，T＝"ATCGA"，规定打分规则为1、match＝6；2、mismatch＝-2；3、gap_open＝-6；4、gap_extend ＝-3。对于序列S上i位置与序列T上j位置的比对得分设为：

1)初始化

构造(|S|+1)×(|T|+1)阶矩阵V，设置初始条件为：

V(i,0)＝0,0≤i≤|S|

V(0,j)＝0,0≤j≤|T|

2)填充

填充规则如下：

其中

表示该元素的值来源于上方领域的元素，

表示该元素的值来源于左边领域的元素，这两种形式表示有空位的插入，V(i, j)有三种来源：V(i-1,j-1)、V(i-1,j)、V(i,j-1)。

3)回溯

从V(|S|,|T|)开始回溯过程，追溯其到前驱元素之间的路径(对角、垂直或水平方向)，到V(0,0)为止，得到序列最优全局比对的路径。

实施例2秋茄InDel标记及其引物

发明人初步确定了几百个InDel标记，并设计对应引物进行生物学验证，最终确认了14个InDel标记并对应设计了14对最佳引物。所述引物的序列信息如下：

>Qq_ID01-F(SEQ ID.NO.1)：

AGTGGTCCACCAGGCCTTA

>Qq_ID01-R(SEQ ID.NO.2)：

GGGAGTAAAGAAAACAACAACAACAACA

>Qq_ID02-F(SEQ ID.NO.3)：

TCATGTGCAGTTTGCCGTAGC

>Qq_ID02-R(SEQ ID.NO.4)：

GCAACCGGCAAAATGTTGGG

>Qq_ID03-F(SEQ ID.NO.5)：

AGCCCTAAGGAGAACAGCATACA

>Qq_ID03-R(SEQ ID.NO.6)：

CGAAAGTCTCTGTAAGCCTGCC

>Qq_ID04-F(SEQ ID.NO.7)：

GAATGAAGGCACTTTTGGTATGCAA

>Qq_ID04-R(SEQ ID.NO.8)：

GACGGACAGAGATGTTTGGAAGT

>Qq_ID05-F(SEQ ID.NO.9)：

GGCACGGTGCTTGTGGG

>Qq_ID05-R(SEQ ID.NO.10)：

CAGCTGCACTTGCACTGGG

>Qq_ID06-F(SEQ ID.NO.11)：

GTTCACTCTCTTGGTCCCCCA

>Qq_ID06-R(SEQ ID.NO.12)：

ACGAGAGCCCCGGACAC

>Qq_ID07-F(SEQ ID.NO.13)：

ACAAGCACAAGTACCCCAAACT

>Qq_ID07-R(SEQ ID.NO.14)：

ACAGACCACTTGAGATATTTGGCA

>Qq_ID08-F(SEQ ID.NO.15)：

TTCTTGCTAAATTTGGCTTTGATAAGTTTC

>Qq_ID08-R(SEQ ID.NO.16)：

ACCCACAAGCAAGTCTCCACT

>Qq_ID09-F(SEQ ID.NO.17)：

GGGCATCCACCGACCGA

>Qq_ID09-R(SEQ ID.NO.18)：

CTGCTGCTGGTGCTGCG

>Qq_ID10-F(SEQ ID.NO.19)：

AGTGACAGGCCATGGAACG

>Qq_ID10-R(SEQ ID.NO.20)：

TCTATCTGCCTCACCAACATTACCT

>Qq_ID11-F(SEQ ID.NO.21)：

CGGCCAACGGGCGATTT

>Qq_ID11-R(SEQ ID.NO.22)：

GGACTTAAGGAATGACGGAAGGGA

>Qq_ID12-F(SEQ ID.NO.23)：

AGGAGCAGTGTCACTACAACCA

>Qq_ID12-R(SEQ ID.NO.24)：

TCAGGTCATTACTAAGGAGCATTTTGT

>Qq_ID13-F(SEQ ID.NO.25)：

TGCTGAGTGTGTTGAACAGCTTG

>Qq_ID13-R(SEQ ID.NO.26)：

ACTCTGGCACACCGGCA

>Qq_ID14-F(SEQ ID.NO.27)：

TGGCCCCACATGCTCCC

>Qq_ID14-R(SEQ ID.NO.28)：

CGCAAAAAGGAGAGGAAGATGGA。

实施例3秋茄InDel标记的应用验证方法

本实施例采用的秋茄品种有14个，分别为：LG(浙江温州市龙港)、DZG(海南东寨港)、DZ(海南儋州)、FT(深圳福田)、ST (广东汕头)、ZJ(广东湛江)、ZJK(福建漳江口)、QZ(福建泉州)、SK(广西山口)、YQ(浙江乐清)、JLJ(福建九龙江)、BLH (广西北仑河口)、FD(福建福鼎)、JJ(浙江台州市椒江)。

(1)秋茄基因组DNA提取：

取鲜嫩叶片于2mL离心管内，-20℃过夜研磨杵研磨后，加1mL DNA提取液研磨成匀浆，60℃水浴1h，在12000rpm的转速下，5min 离心取上清，然后加入等体积的氯仿，剧烈震荡，离心5min取上清，再加入等体积的氯仿，重复一次后，然后加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h，离心5min弃上清，加入500uL 70％乙醇洗两次，风干，加入100uL TE缓冲液溶解；

(2)PCR扩增；

PCR反应体系可为10ul、20ul等均可，以10ul为例，2×Taq mix 5ul，DNA模板2ul(80ng)，10uM Primer F/R各0.2ul，补ddH2O 至10ul。

PCR扩增一般反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s， 56℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环，接着72℃反应5min，最后室温或4℃保存。采用普通PCR仪即可进行反应。

(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

聚丙烯酰胺凝胶浓度6％-8％，电压300V，电流180mA，时间30min。电泳结束后采用GelRed染料进行染色并拍照记录。

(4)数据统计与分析；

根据聚丙烯酰胺凝胶检测的胶图，分析各品种在各标记下的条带大小，即带型。

实施例4对比试验

发明人在实施例3中做了同比试验，用于对比的6对引物序列 (Qq_ID 21-26)如下：

>Qq_ID21-F(SEQ ID.NO.29)：

AGGGAAGCACTCAAGCGCA

>Qq_ID21-R(SEQ ID.NO.30)：

GCCTTCTGCTGATATGCTCCG

>Qq_ID22-F(SEQ ID.NO.31)：

AGTGACAGGCCATGGAACG

>Qq_ID22-R(SEQ ID.NO.32)：

TCTATCTGCCTCACCAACATTACCT

>Qq_ID23-F(SEQ ID.NO.33)：

AGTGGTCCACCAGGCCTTA

>Qq_ID23-R(SEQ ID.NO.34)：

GGGAGTAAAGAAAACAACAACAACAACA

>Qq_ID24-F(SEQ ID.NO.35)：

GCGAAAGAAAGAGACGACAGACA

>Qq_ID24-R(SEQ ID.NO.36)：

TCTGAAAGCTTCGTAAATTCCCCC

>Qq_ID25-F(SEQ ID.NO.37)：

GGGCATCCACCGACCGA

>Qq_ID25-R(SEQ ID.NO.38)：

CTGCTGCTGGTGCTGCG

>Qq_ID26-F(SEQ ID.NO.39)：

CATCCAACGAAATCGATGC

>Qq_ID26-R(SEQ ID.NO.40)：

ATGCCATTGAGGATATGAGAT。

结果表明，本发明的14对引物对能够特异地将14种不同来源地的秋茄品种进行区分(见图1-图2)，而引物对21-26在不同秋茄材料中表现多条带、杂带或扩增效率低，不能纳入指纹图谱(见图3)。充分证明了本发明InDel标记及引物具有特异性好、稳定性强的特点。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省亚热带作物研究所

<120> 一种秋茄DNA指纹图谱的构建及应用

<130> 20211011

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agtggtccac caggcctta 19

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gggagtaaag aaaacaacaa caacaaca 28

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcatgtgcag tttgccgtag c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcaaccggca aaatgttggg 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

agccctaagg agaacagcat aca 23

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cgaaagtctc tgtaagcctg cc 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gaatgaaggc acttttggta tgcaa 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gacggacaga gatgtttgga agt 23

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggcacggtgc ttgtggg 17

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cagctgcact tgcactggg 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gttcactctc ttggtccccc a 21

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acgagagccc cggacac 17

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acaagcacaa gtaccccaaa ct 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

acagaccact tgagatattt ggca 24

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

ttcttgctaa atttggcttt gataagtttc 30

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

acccacaagc aagtctccac t 21

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gggcatccac cgaccga 17

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ctgctgctgg tgctgcg 17

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

agtgacaggc catggaacg 19

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

tctatctgcc tcaccaacat tacct 25

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

cggccaacgg gcgattt 17

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

ggacttaagg aatgacggaa ggga 24

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

aggagcagtg tcactacaac ca 22

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

tcaggtcatt actaaggagc attttgt 27

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

tgctgagtgt gttgaacagc ttg 23

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

actctggcac accggca 17

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

tggccccaca tgctccc 17

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

cgcaaaaagg agaggaagat gga 23

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

agggaagcac tcaagcgca 19

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

gccttctgct gatatgctcc g 21

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

agtgacaggc catggaacg 19

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

tctatctgcc tcaccaacat tacct 25

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

agtggtccac caggcctta 19

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

gggagtaaag aaaacaacaa caacaaca 28

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

gcgaaagaaa gagacgacag aca 23

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

tctgaaagct tcgtaaattc cccc 24

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 37

gggcatccac cgaccga 17

<210> 38

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

ctgctgctgg tgctgcg 17

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

catccaacga aatcgatgc 19

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

atgccattga ggatatgaga t 21

Claims

1.一种秋茄InDel分子标记的引物，其特征在于，所述引物为14对引物：第1对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.2所示；第2对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.4所示；第3对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.6所示；第4对引物，上游引物序列如SEQID.NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.8所示；第5对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.10所示；第6对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.12所示；第7对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.13所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.14所示；第8对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.15所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.16所示；第9对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.17所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.18所示；第10对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.19所示，下游引物序列如SEQ ID.NO.20所示；第11对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.21所示，下游引物序列如SEQID.NO.22所示；第12对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.23所示，下游引物序列如SEQID.NO.24所示；第13对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.25所示，下游引物序列如SEQID.NO.26所示；第14对引物，上游引物序列如SEQ ID.NO.27所示，下游引物序列如SEQID.NO.28所示。

2.一种鉴定秋茄品种的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的InDel分子标记引物。

3.一种构建权利要求1所述引物的方法，包括如下步骤：收集秋茄基因组的信息，然后判断缺失或插入位点是否为InDel标记，根据判断后确认的InDel标记构建特异性引物；其中，所述判断方法包括采用如下的算法：假设有两条序列S＝″AATCGTTA″，T＝″ATCGA″，规定打分规则为1、match＝6；2、mismatch＝-2；3、gap_open＝-6；4、gap_extend＝-3；对于序列S上i位置与序列T上j位置的比对得分设为：