CN103725785A - 柚木无性系指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种柚木无性系指纹图谱的构建方法及其应用。柚木无性系指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：柚木无性系基因组DNA提取，基因组DNA的SSR扩增，PCR扩增产物上测序仪分型，获得柚木无性系指纹图谱；本发明通过试验研究，优化了柚木SSR分子标记PCR扩增体系和程序，设计和筛选出柚木SSR多态性引物。本发明用筛选出来的15对具有多态性的柚木SSR引物，构建了26个柚木无性系的DNA指纹图谱。该方法经济、精确、快速和高效，为今后快速进行无性系指纹图谱构建和鉴定、柚木种质资源遗传评价、遗传图谱构建、分子标记辅助育种提供了技术支撑。

Description

柚木无性系指纹图谱的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种乔木无性系指纹图谱的构建方法及其应用，具体涉及一种柚木无性系指纹图谱的构建方法及其应用。
背景技术
柚木（Tectona grandis L.f.）为马鞭草科（Verbenaceae）柚木属（Tectona）高大乔木，天然分布于北纬9°～26°，东经73°～104°的印度南部与中部、泰国北部、缅甸和老挝，是世界著名的热带珍贵用材树种，素有“万木之王”的美誉，其心材材质坚韧耐久，结构致密，纹理美观，是制造军舰、码头、桥梁、建筑、家具、雕刻和木地板等的高级用材。全球木材贸易网数据显示，2011年6月16～30日缅甸柚木市场的4类原木离岸价都已达到3471美元·m-3。国内市场进口柚木原木价格较高，杭州木材市场柚木价格为9000～18000元·m-3。正是具有生长快，材质优良，用途广和投资回报率高等特点，柚木在热带、南亚热带地区广为种植，是世界上人工林种植面积最大的4个树种之一，也是单位面积产值最高的造林树种。
我国引进柚木栽培已有180多年的历史，20世纪70年代初我国开始了柚木遗传改良和培育技术的系统研究，为我国发展柚木事业提供了栽培材料和技术的保障。目前，我国柚木推广种植范围遍及10个省（自治区）60多个县（市），总面积约1.5万hm2。近年来，云南省、海南省把柚木列为主要造林树种，广东、广西、福建、贵州省采用柚木造林的私人与企业也越来越多。柚木商品林种植多以组培优良无性系为主，选育出高产、优质和多抗的柚木优良新品系并加以推广利用，提高良种化程度，是大力发展柚木种植业的前提。我国柚木研究人员经过多年的努力，已获得了一批适合我国不同立地条件和气候的柚木优良无性系，授权指定了个别组培单位进行生产繁殖和推广。
但是，目前市场上出售的柚木苗繁殖方法多样，繁殖材料来源不清，苗木质量良莠不齐，而现有技术凭人工经验难以辨别出柚木不同无性系，导致我国柚木商品林发展良种使用率低，在很大程度上制约了我国柚木事业的发展。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种柚木无性系指纹图谱的构建方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述方法构建的柚木无性系指纹图谱在柚木无性系品种鉴定上的应用。本发明通过研制一套柚木无性系鉴定方法，构建出我国柚木无性系指纹图谱，为柚木无性系的鉴定和品种权保护提供技术支撑，并可有效监督和规范我国各地柚木种植苗木的良种信息情况，提高柚木商品林发展良种化程度。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种柚木无性系指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
（1）柚木无性系基因组DNA提取
以柚木无性系的叶片为材料，提取柚木无性系的基因组DNA，得到基因组DNA样品；
（2）柚木无性系基因组DNA的SSR扩增
以步骤（1）中得到的基因组DNA样品为模板，用柚木SSR多态性引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（3）柚木无性系PCR扩增产物上测序仪分型
取步骤（2）中获得的PCR扩增产物，加入超纯甲酰胺和LIZ-500分子量内标，得到上样液；将上样液变性，降温，然后进行柚木无性系SSR分型；
（4）获得柚木无性系的指纹图谱
用GeneMapper4.0软件进行谱带分析，读取每对引物扩增出的SSR片段的大小（单位bp），得到柚木SSR多态性引物构建出的柚木无性系指纹图谱（见表7）。
步骤（1）中所述的提取柚木无性系的基因组DNA优选采用CTAB法提取；
步骤（1）中所述的基因组DNA样品优选是放于-20℃保存备用；
步骤（2）中所述的柚木SSR多态性引物包括15对柚木SSR多态性引物，分别是AJ968929、AJ968930、AJ968931、AJ968932、AJ968933、AJ968934、AJ968935、AJ968936、AJ968938、AJ968940、AJ968941、AJ968942、AJ968943、AJ511753、AJ511764，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～30所示；
步骤（2）中所述的PCR扩增的反应体系优选为：含浓度为25mM Mg2+的10×buffer1.5μL，浓度为10mM的dNTPs0.03μL，酶活为5U/μL的Taq DNApolymerase（Taq DNA酶）0.3μL，浓度为10ng/μL的DNA1.5μL，浓度为5μM的forward primer（正向引物）0.15μL，浓度为5μM的reverse primer（反向引物）0.15μL，浓度为1nmol/μL的fluorescent-dUTP（荧光-dUTP）0.015μL，加ddH2O至15μL；
步骤（2）中所述的PCR扩增的反应程序优选为：采用Touch-Down PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s、Tm+10℃至Tm℃退火30s、72℃延伸1min，20个循环，每个循环降低0.5℃；94℃变性30s、Tm℃退火30s、72℃延伸1min，26个循环；72℃延伸10min；4℃forever；
所述的Tm（退火温度）优选为51、53或56℃；
步骤（3）中所述的上样液的体系优选为：PCR扩增产物2μL，超纯甲酰胺7.82μL，LIZ-500分子量内标0.18μL；
步骤（3）中所述的变性的条件优选为95℃变性5min；
步骤（3）中所述的降温的条件优选是放入冰浴或4℃中进行降温4分钟；降温后尽快上样分析；
步骤（3）中所述的进行柚木无性系SSR分型优选是将变性后PCR产物在ABI3130×1测序仪上进行柚木无性系SSR分型；
步骤（5）中所述的读取每对引物扩增出的SSR片段的大小，其中，不同无性系能得到不同或相同大小的SSR片段，也有的无性系不含有个别引物扩增的SSR片段，因此扩增没有产物；
一种柚木无性系指纹图谱，通过上述方法构建得到，如表7所示。
所述的柚木无性系指纹图谱在柚木无性系品种鉴定上的应用。
利用柚木无性系指纹图谱进行柚木品种鉴别；依据15对柚木SSR多态性引物的检测结果进行判定：利用上述构建方法，提取未知柚木无性系的基因组DNA，进行PCR扩增，将扩增产物上测序仪分型，获得每对引物扩增出的SSR片段大小（单位bp），若与上述柚木无性系指纹图谱中的片段完全一致，即获得该未知柚木无性系的品系名称。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
（1）本发明通过EMBL-EBI网站找到了柚木基因组DNA微卫星序列，利用Serafer等相关软件设计出了柚木SSR引物，通过试验研究，筛选出了15对柚木SSR多态性引物，确定了每对引物的退火温度；同时优化了柚木SSR分子标记PCR扩增体系和程序，最终获得了基于荧光-dUTP和自动化测序仪的柚木SSR分子标记技术体系。该方法经济、精确、快速和高效，为今后快速进行柚木种质资源遗传评价、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、无性系指纹图谱构建和鉴定提供了技术支撑。
（2）利用上述方法，用适宜数量的具有多态性的柚木SSR引物，对柚木无性系基因组DNA分别进行扩增和上测序仪进行SSR分型，由于不同无性系所含的微卫星片段重复数不同，从而对不同无性系扩增分析得到的微卫星片段大小不同，由此构建出无性系的指纹图谱。本发明用筛选出来的15对具有多态性的柚木SSR引物，构建了26个柚木无性系的DNA指纹图谱，可把26个柚木无性系区分开，将为柚木无性系的鉴定和品种权保护提供技术支撑，同时可有效监督和规范我国各地柚木种植苗木的良种信息情况，提高柚木商品林发展良种化程度。
附图说明
图1是26个柚木无性系的遗传聚类图。
图2为5对引物29、30、31、32、33扩增柚木无性系70-13的峰图；
其中，29为AJ968929、30为AJ968930、31为AJ968931、32为AJ968932、33为AJ968933。
图3为5对引物34、35、36、38、40扩增柚木无性系70-13的峰图；
其中34为AJ968934、35为AJ968935、36为AJ968936、38为AJ968938、40为AJ968940。
图4为5对引物41、42、43、53、64扩增柚木无性系70-13的峰图；
其中，41为AJ968941、42为AJ968942、43为AJ968943、53为AJ511753、64为AJ511764。
图5为5对引物29、30、31、32、33扩增柚木无性系70-29的峰图；
其中，29为AJ968929、30为AJ968930、31为AJ968931、32为AJ968932、33为AJ968933。
图6为5对引物34、35、36、38、40扩增柚木无性系70-29的峰图；
其中34为AJ968934、35为AJ968935、36为AJ968936、38为AJ968938、40为AJ968940。
图7为5对引物41、42、43、53、64扩增柚木无性系70-29的峰图；
其中，41为AJ968941、42为AJ968942、43为AJ968943、53为AJ511753、64为AJ511764。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下材料在文献“抽木种源主要性状聚合遗传值的评价.林业科学研究.1996,9(1):7-14”公开：印度种源3070、印度种源3071、印度种源3072、印度种源3074和尼日利亚种源3078。
以下材料在文献“农杆菌介导柚木腋芽原基遗传转化的研究.中国林业科学研究院.博士学位论文.2007”公开：无性系7531、无性系7544、无性系7552、无性系8301和无性系108。
以下材料在文献“柚木无性系促萌与采穗圃营建技术.中国林业科学研究院.硕士学位论文.2007”公开：无性系7514和无性系7559。
以下材料在文献“柚木愈伤组织诱导培养的研究.中南林业科技大学学报.2012,32(3)：53-58”公开：无性系7114。
以下材料在文献“柚木种子园无性系开花特性与结实差异分析.种子.2011,30(8)：5-8”公开：无性系70-13、无性系70-29、无性系71-5、无性系71-22、无性系71-38、无性系71-46、无性系72-10、无性系72-19和无性系7549。
以下材料在文献“柚木嫩枝扦插.中南林学院学报.2005,25(3)”公开：无性系71-12。
无性系7137、无性系7412、无性系J731、无性系Z408、无性系7509、无性系7542、无性系7555和无性系3078-5，均购自中国林业科学研究院热带林业研究所。
实施例1
（1）柚木无性系基因组DNA提取。
柚木无性系70-13（已在“柚木种子园无性系开花特性与结实差异分析”公开）的叶片材料，采用CTAB法提取柚木无性系70-13的基因组DNA，将DNA样品放于-20℃保存备用。
所述的CTAB法的具体步骤如下：
（a）取柚木无性系叶片0.2g于研钵中，液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
（b）将粉末转入1.5mL离心管中，加入600μL65℃预热的CTAB提取液，加入20μL RNase溶液（10mg/mL），充分混匀。
（c）将离心管放入65℃水浴中温浴30min，每隔7～8分钟混匀1次。
（d）取出离心管，加入600μL的Tris饱和酚：氯仿（1：1），轻轻混匀5min后4～25℃、12000rpm，离心10min。
（e）取上清液于新离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻混匀5min后4～25℃、12000rpm，离心10min。
（f）取上清液于新离心管中，加入预冷的1倍体积的预冷异丙醇，轻轻摇匀，室温放置2～3min。
（g）4～25℃、12000rpm，离心10min。倒去上清液，用75%的酒精颠倒漂洗沉淀2～3次。将酒精倒出后放入通风橱，把酒精挥发干后加入50μL1×TE溶解DNA。
所述的CTAB提取液包括如下成分：100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸二钠），l.4mol/L NaCl，2%CTAB（w/v），2%PVP（聚乙烯毗咯烷酮），1%β-琉基乙醇（每次提取之前混合均匀后使用）。
所述的1×TE包括如下成分：10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，PH=8.0。
（2）柚木无性系基因组DNA的SSR扩增。
以步骤（1）中得到的基因组DNA样品为模板，用筛选出的15对柚木SSR多态性引物（见表3）分别进行PCR扩增，PCR扩增体系见表2。
柚木SSR多态性引物筛选的具体步骤如下：
从EMBL网站上搜索到143条柚木基因组DNA微卫星，用SSRhunter软件分别找到其SSR序列的重复单元和重复数，再根据每条SSR序列两端的侧翼序列，用Primer5.0、0ligo6.0或Serafer软件设计出对应的143对SSR引物。从26个柚木无性系（见表6）中任选5个柚木无性系基因组DNA样品混合后作为样品，用所设计的引物分别进行PCR扩增。PCR体系见表1。
表1  柚木SSR引物预筛选PCR体系
成份 体积
10×buffer（含25mM Mg2+） 1.5μL
10mM dNTPs 0.03μL
5U/μL Taq DNA polymerase（Taq DNA酶） 0.3μL
10ng/μL DNA 1.0μL
5μM forward primer（正向引物） 0.15μL
5μM reverse primer（反向引物） 0.15μL
ddH2O 11.87μL
预筛选PCR程序为：94℃4min；94℃30s、Tm℃30s、72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃forever。用1.5%的琼脂糖电泳检测有无PCR产物。再从26个柚木无性系（见表6）的基因组DNA样品中任选5个样品（不混合），用有产物的引物分别对这5个样品进行PCR扩增。PCR体系见表2。
表2  柚木SSR引物终筛选PCR体系
采用Touch-Down PCR扩增程序：94℃4min；94℃30s，Tm+10℃至Tm℃(每个循环降低0.5℃)30s，72℃1min(20个循环)；94℃30s，Tm℃30s，72℃1min(26个循环)；72℃10min；4℃forever。
扩增后每个样品取2μLPCR产物，分别加超纯甲酰胺（Hi-DiTMFormamide，遗传分析级）7.82μL，LIZ-500分子量内标0.18μL，然后95℃变性5分钟，迅速放入冰浴或4℃冰箱4分钟（4分钟后尽快上机检测为好），即可上自动化测序仪进行SSR分析。检测引物对每个样品扩增产物是否具有多态性（不同样品产生的片段大小越多不同，说明多态性越丰富）。最终筛选确定了15对柚木SSR多态性引物（见表3）用于构建柚木无性系指纹图谱。
表3  筛选出的15对柚木SSR多态性引物序列（其序列如序列表SEQ ID No.1～30所示）
Figure BDA0000454914410000072
Figure BDA0000454914410000081
采用Touch-Down PCR扩增程序：94℃4min；94℃30s，Tm+10℃至Tm℃(每个循环降低0.5℃)30s，72℃1min(20个循环)；94℃30s，Tm℃30s，72℃1min(26个循环)；72℃10min；4℃forever。
所述的Tm的值为51、53或56℃。
（3）柚木无性系PCR扩增产物上测序仪分型
柚木无性系70-13扩增后取PCR产物2μL，分别加超纯甲酰胺（Hi-DiTMFormamide，遗传分析级）7.82μL，LIZ-500分子量内标0.18μL，然后95℃变性5min，迅速放入冰浴或4℃冰箱中降温4分钟后，尽快上样分析，变性后PCR产物在ABI3130×1测序仪上进行柚木无性系SSR分型。
（4）获得柚木无性系的指纹图谱
用GeneMapper4.0软件进行谱带分析，人工读取每对引物对柚木无性系70-13扩增出的SSR片段的大小（单位bp）。本发明用15对柚木SSR引物构建出了柚木无性系70-13的指纹图谱（见表4）。
表4  15对引物扩增柚木无性系70-13的不同大小片段构建的指纹图谱（bp）
Figure BDA0000454914410000082
Figure BDA0000454914410000091
实施例2
实施例1中的柚木无性系70-13换成柚木无性系70-29（已在“柚木种子园无性系开花特性与结实差异分析”公开），其余步骤相同。用15对柚木SSR引物构建出了柚木无性系70-29的指纹图谱（见表5）。
表5  15对引物扩增柚木无性系70-29的不同大小片段构建的指纹图谱（bp）
Figure BDA0000454914410000092
实施例3
实施例1中的柚木无性系70-13分别换成其它柚木无性系，其余步骤相同。柚木无性系（共26个）的信息见表6。就某一对引物而言，不同无性系可得到不同或相同大小的SSR片段，有的无性系不含有个别引物扩增的SSR片段，因此扩增没有产物。本发明用15对柚木SSR引物构建出了柚木无性系的指纹图谱（见表7），完全能把我国培育出的26个柚木无性系区分开。
表6  26个柚木无性系信息表
Figure BDA0000454914410000101
应用实施例1
获得某未知柚木无性系的叶片材料，根据实施例1的方法和步骤，用15对柚木SSR引物进行PCR扩增，分别读取每对引物对应的片段大小（bp）（见表8）。
表815对引物扩增某未知柚木无性系的不同大小片段（bp)
Figure BDA0000454914410000121
根据表8的结果，对该未知柚木无性系在柚木无性系指纹图谱（表7）中进行鉴定，可知，该未知柚木无性系为柚木无性系108。
本发明利用上述技术体系和筛选出的15对柚木SSR多态性引物，构建了26个柚木无性系的DNA指纹图谱，可把26个柚木无性系区分开，将为柚木无性系的鉴定和品种权保护提供技术支撑，同时可有效监督和规范我国各地柚木种植苗木的良种信息情况，提高柚木商品林发展良种化程度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000454914510000011
Figure IDA0000454914510000031
Figure IDA0000454914510000041
Figure IDA0000454914510000051
Figure IDA0000454914510000061
Figure IDA0000454914510000071
Figure IDA0000454914510000081

Claims (10)

1.一种柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）柚木无性系基因组DNA提取
以柚木无性系的叶片为材料，提取柚木无性系的基因组DNA，得到基因组DNA样品；
（2）柚木无性系基因组DNA的SSR扩增
以步骤（1）中得到的基因组DNA样品为模板，用柚木SSR多态性引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
（3）柚木无性系PCR扩增产物上测序仪分型
取步骤（2）中获得的PCR扩增产物，加入超纯甲酰胺和LIZ-500分子量内标，得到上样液；将上样液变性，降温，然后进行柚木无性系SSR分型；
（4）获得柚木无性系的指纹图谱用GeneMapper4.0软件进行谱带分析，读取每对引物扩增出的SSR片段的大小，得到柚木SSR多态性引物构建出的柚木无性系指纹图谱；
步骤（2）中所述的柚木SSR多态性引物包括15对柚木SSR多态性引物，分别是AJ968929、AJ968930、AJ968931、AJ968932、AJ968933、AJ968934、AJ968935、AJ968936、AJ968938、AJ968940、AJ968941、AJ968942、AJ968943、AJ511753、AJ511764，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～30所示。
2.根据权利要求1所述的柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤（1）中所述的基因组DNA样品是放于-20℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR扩增的反应体系为：含浓度为25mM Mg2+的10×buffer1.5μL，浓度为10mM的dNTPs0.03μL，酶活为5U/μL的Taq DNA酶0.3μL，浓度为10ng/μL的DNA1.5μL，浓度为5μM的正向引物0.15μL，浓度为5μM的反向引物0.15μL，浓度为1nmol/μL的荧光-dUTP0.015μL，加ddH2O至15μL。
4.根据权利要求1所述的柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤（2）中所述的PCR扩增的反应程序为：采用Touch-Down PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s、Tm+10℃至Tm℃退火30s、72℃延伸1min，20个循环，每个循环降低0.5℃；94℃变性30s、Tm℃退火30s、72℃延伸1min，26个循环；72℃延伸10min；4℃forever；
所述的Tm为51、53或56℃。
5.根据权利要求1所述的柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤（3）中所述的上样液的体系为：PCR扩增产物2μL，超纯甲酰胺7.82μL，LIZ-500分子量内标0.18μL。
6.根据权利要求1所述的柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤（3）中所述的变性的条件为95℃变性5min。
7.根据权利要求1所述的柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤（3）中所述的降温是放入冰浴或4℃中进行降温4分钟。
8.根据权利要求1所述的柚木无性系指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤（3）中所述的进行柚木无性系SSR分型是将变性后PCR产物在ABI3130×1测序仪上进行柚木无性系SSR分型。
9.通过权利要求1～8任一项所述的构建方法得到的柚木无性系指纹图谱在柚木无性系品种鉴定上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：利用柚木无性系指纹图谱进行柚木品种鉴别；依据15对柚木SSR多态性引物的检测结果进行判定：利用权利要求1～8任一项所述的构建方法，提取未知柚木无性系的基因组DNA，进行PCR扩增，将扩增产物上测序仪分型，获得每对引物扩增出的SSR片段的大小，若与上述柚木无性系指纹图谱中的片段完全一致，即获得该未知柚木无性系的品系名称。
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