CN106636081B - 一个与桃树流胶病抗性相关的snp分子标记 - Google Patents

Abstract

一个与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记，通过对桃树流胶病抗性基因位点进行定位，得到一个与桃树流胶病抗性相关QTL紧密连锁的SNP分子标记，其位于桃的第6号染色体上，位点为SNP_IGA_627726，该SNP位点与不同桃品系流胶病的发病率有显著相关性，具有良好的多态性，为抗流胶病品种选择过程中早期亲本选择及杂交后期后代选择提供了一个新的鉴定方法，能提高流胶病抗性检测的准确性，缩短育种周期，提高育种效率，加快实现高温高湿地区桃树抗流胶病新品种的选育。

Description

一个与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记

技术领域

本发明属于桃树育种技术领域，具体涉及一个与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记。

背景技术

桃是原产我国西部的蔷薇科核果类果树，也是世界栽培范围最广泛的果树之一。桃流胶病是影响桃产业健康有序发展的重要因素之一，给我国桃生产造成了严重危害。

桃树流胶病由真菌多主葡萄糖壳菌(Botryosphaeria dothidea)侵染所致，主要发生在树体主干和侧枝，发病严重时发展到结果枝及果实。发病初期皮孔流出淡黄色透明胶，胶凝结后渐变红褐色，病部稍肿，皮层及木质部变褐腐朽，腐生其他杂菌，树势逐渐衰弱，叶小而黄，果实产量及品质下降，严重时枝干枯死，整株死亡，果实发病由果核内分泌黄色胶质，溢出果面，病部硬化，严重时不能正常生长发育(赵密珍等，1996；马瑞娟等，2002；李智，2014)。

桃流胶病在我国南北方产区均有发生，但在长江流域及以南的高温多雨地区尤为严重，美国、日本等也有相关研究报道。调查显示，2003年我国重庆部分地区桃流胶病平均发病率66.8％，2005、2006年北京大兴区桃流胶病平均发病率为93.73％和91.05％，2008年广东省桃树种植区连平县桃流胶病发病率达100％。2009年湖北孝感、仙桃等地部分种植品种流胶病发病率达100％(陈彦等，2011；张平等，2013)。

桃流胶病的发生主要由生物和非生物因素造成，其发病程度与品种、栽培环境、栽培技术管理、树龄等密切相关。国内外研究者对于桃流胶病的研究主要集中在以下几个方面：(1)诱导桃流胶病的病原菌类型及侵染方式(Britton and Hendrix，1982；Weaver et等，1974；Wang等，2011)；(2)发病后生理生化变化(李智，2014；俞明亮等，2001)；(3)发病后的防治措施(杨文，2011；Li等，1995)；(4)植物生长物质对流胶病的影响(Li等，2014)，品种抗性方面也有相关报道。

杨文(2011)分析了6个桃品种对流胶病的敏感性，发现‘春雪’易感，‘庆丰’和‘仓方早生’中感，‘霞晖5号’、‘大红袍’和‘鄂桃1号’敏感性最弱。赵密珍等(1996)调查了273个桃品种的流胶病，发现绝大部分品种不抗流胶病，极少数品种具有高抗能力；高抗品种有天津水蜜、白沙、皱叶黄露、大红花，中抗品种有早甜桃、润州水蜜、金山水蜜、上山大玉露、大久保、冈山100号、西野、冈山白。油桃、蜜桃、硬肉桃感病稍轻，其次为水蜜桃品种群、黄桃品种群、蟠桃品种群感病重。

目前，基于全基因组重测序的SNP标记开发及构建高密度SNP芯片目前已应用到桃果实香气物质的合成及冷害的遗传机理研究中，对不同桃品种自身流胶病抗性的分子机理研究仍为空白，有必要通过分子育种手段，挖掘定位抗病基因，选择亲本，为新型抗病品种选育提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一个与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记，该SNP分子标记位于桃的第6条连锁群上第26.7区段，位点为SNP_IGA_627726，对应染色体物理位置为7604716，与桃的流胶病的发病率有显著相关性，具有良好的多态性，利用该SNP分子标记对不同桃品种或品系进行抗流胶病检测，准确率高，利于提高桃树的育种效率，加快实现高温高湿地区桃树抗流胶病新品种的选育。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一个与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记，其位于桃的第6条连锁群上，该SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共121bp，其中，n代表A或G，且第61位碱基为A或G。

进一步，所述SNP标记的GG基因型个体的流胶病显著低于AG型个体。

本发明还提供一种用于扩增所述SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记用于桃树品种或品系选育中。

一种获得与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记的方法，包括以下步骤：

1)构建高密度全基因组SNP芯片

以具有抗病性的品种和感病性的品种为亲本，进行杂交，获得杂交F₁代群体；以亲本及杂交F₁代群体的基因组DNA为模板，以高密度SNP芯片为探针，探针与目标基因组DNA片段分别进行杂交，分别获得亲本及杂交F₁代群体的高密度全基因组SNP芯片，测定基因型，进行基因分型数据处理；

2)构建F₁连锁图谱

进行SNP质量控制，即去掉所检测样本中基因型相同的、缺失率大于0.1、及不满足分离比检验(p<0.01)的SNP位点，得到多态性SNP位点，用于构建该F₁群体的遗传连锁图谱；

3)QTL定位

用QTL分析软件及复合区间作图法对杂交F₁代群体的流胶病表型数据进行QTL初级定位和效应检测；

设置窗口为0.5cM，模型选择向前/向后回归分析方法，运行参数设为默认值，进行QTL定位；

采用LOD阈值设置为2.5，QTL置信区间为LOD值从峰值下降2对应的区间，同时计算每个QTL对表型的贡献率和遗传效应，将影响桃树流胶病的主效QTL进行初步定位，再作进一步加密及标记筛选，最终确定桃树流胶病发病率紧密相关的位点。

优选地，步骤1)中，所述的高密度SNP芯片为桃国际通用的RosBREED_Peach_10K11494376的SNP芯片。

优选地，步骤1)中，所述的抗病性的品种为‘锦绣黄桃’，所述的感病性的品种为‘玉露蟠桃’。

利用所述与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记检测桃树流胶病的方法，包括以下步骤：

1)提取待测桃树的基因组DNA；

2)利用权利要求2所述的引物对，将所述待测桃树的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；

4)基于所述测序结果，确定所述待测桃树的所述SNP标记的基因型；

5)根据步骤4)的SNP标记的基因型，判定所述待测桃树的流胶病抗性，所述SNP标记位点的基因型为AG时，桃树流胶病发病率较高，基因型为GG时，桃树流胶病发病率较低或不发病。

本发明研究人员对桃树流胶病发生状况进行了多年调查，发现‘锦绣黄桃’在栽培过程中表现出高抗的特性，并采用此材料配置了多个杂交体系，其中，‘锦绣黄桃’ב玉露蟠桃’的杂交后代已出现流胶病性状的性状分离，通过构建该群体的高密度遗传图谱，找出流胶病性状相关基因，并定位在遗传图谱上，从而促进桃树抗流胶病育种的进程。

本发明的SNP分子标记可用于检测桃品种、品系或育种材料的流胶病抗病性。

本发明的SNP分子标记位于桃的第6条连锁群上，基于桃全基因组序列信息及国际通用的9K SNP芯片，该位点为RosBREED_Peach_10K11494376array上的SNP_IGA_627726位点，对应连锁群上的6：26.7区段，对应染色体物理位置7604716。

本发明的SNP分子标记与桃的流胶病有显著相关性，具有良好的多态性，对不同桃品种或品系的抗流胶病的检测具有重要应用价值，该分子标记在不同桃品种或品系流胶病病情鉴定中的应用，为抗流胶病品种选择过程中早期亲本选择及杂交后期后代选择提供了一个新的鉴定方法，提高流胶病抗性检测的准确性，提高育种效率，同时还能够克服桃树常规育种时周期长，占地面积大、育种效率低等问题。

本发明的有益效果：

1)本发明的SNP分子标记与桃树流胶病抗性相关的QTL紧密连锁，与桃流胶病有显著相关性，具有良好的多态性，利用该SNP分子标记对不同桃品种或品系进行抗流胶病检测，准确率高，利于提高桃树的育种效率，加快实现高温高湿地区桃树抗流胶病新品种的选育。

2)本发明在筛选SNP分子标记时，以具有抗病性的品种和感病性的品种为亲本，后代在流胶病抗性上分离度高，有利于进行QTL定位。

3)利用本发明的SNP分子标记对不同桃品种或品系进行抗流胶病检测，在桃树的育苗期就可以准确检测出是否为抗流胶病基因型，便于早期筛选，不需等到发病后才能采取相关措施，缩短育种周期，降低育种成本，同时还能克服桃树常规育种时占地面积大、育种效率低等问题。

附图说明

图1为本发明实施例的不同基因型发病情况对照。

图2为本发明的SNP分子标记的位点示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例与桃树流胶病抗性相关的QTL紧密连锁的SNP分子标记的获得，包括以下步骤：

1)构建F₁杂交群体

利用抗流胶病强的优良鲜食黄肉桃栽培品种‘锦绣黄桃’与抗流胶病弱的蟠桃品种‘玉露蟠桃’为亲本构建F₁群体，最终得到80份杂交后代，且后代群体存在流胶病性状分离。

2)提取基因组DNA

用Qiagen DNeasy mini Kit试剂盒提取2个桃亲本及80个杂交后代的基因组DNA，按照试剂盒提供方法，具体如下：

①称取0.1g冷冻叶片，在液氮中快速研磨，置于2ml灭菌的离心管中。

②加400μl AP1缓冲液和4μl RNase A到上述离心管中，涡旋混匀，65℃水浴10min，上下混匀2-3次。

③加130μl AP2缓冲液到混合液中混匀，冰浴5min，14000rpm 15-25℃离心5min。

④吸取上清到QIAshredder离心柱中，14000rpm，离心2min，转移回收管中的液体到2ml新管中。

⑤加1.5倍AP3/E缓冲液，混匀，吸取650μl混合液(含沉淀)加入到置于2ml回收管的新的DNeasy离心柱中(2ml回收管)，8000rpm离心1min，倒掉回收管中液体。

⑥将DNeasy Mini离心柱置于新的2ml回收管中，加入500μl AW缓冲液，8000rpm离心1min，弃管中液体，留回收管。

⑦加500μl Buffer AW到DNesay Mini离心管，14000rpm，离心2min，弃回收管。

⑧将DNeasy Mini离心柱放入1.5ml离心管中，加50μl AE缓冲液于过滤膜上，室温放置5min后，8000rpm离心1min，重复步骤⑧，合并DNA。

⑨采用核酸蛋白分析仪ND-1000(Thermo Scientific，USA)检测DNA浓度，A260/280比值在1.8-2.0判定为合格，同时，取1μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，取30μl DNA(浓度>100ng/μl)原液保存于-20℃中备用。

3)构建高密度全基因组SNP芯片

利用Illumina Infinium II array的Beadtype探针(桃国际通用RosBREED_Peach_10K 11494376的高密度SNP芯片)分别与步骤2)中的目标基因组DNA片段进行杂交，所用试剂盒及杂交方法步骤由Illumina公司提供，具体步骤如下：

①DNA模板扩增：利用λDNA和PicoGreen荧光染料进行基因组DNA浓度精确定量，取4μl 50ng/μl的基因组DNA加到装有20μl MA1的MSA3板中，加4μl 0.1N NaOH溶液，1600rpm混匀1min，280×g离心1min，室温孵育10min，然后加34μl MA2和38ul MSM混匀离心，盖膜，制成MSA3板，MSA3板置于杂交箱中37℃恒温20-24h，进行基因组扩增。

②DNA扩增产物片断化：扩增好的MSA3板50×g离心1min，加入25μl FMS试剂，盖盖，1600rpm混匀1min，22×g离心1min，然后37℃孵育1min。

③DNA沉淀：MSA3板中加50μl PM1试剂，封盖，1600rpm离心1min，37℃孵育1min，22℃50×g离心1min，弃硅胶盖，每孔加入155μl异丙醇，盖新的硅胶盖，颠倒混匀，4℃放置30min后3000×g离心20min，弃上清液，倒置96孔板1h，室温下晾干。

④DNA重悬：在MSA3板中加23μl RA1试剂，封膜后置于48℃杂交箱中孵育1h，1800rpm混匀1min后在280×g离心。

⑤DNA与芯片磁珠杂交：在Hyb槽内加入400μl PB2缓冲液，置于2-8℃保存，将重悬的MSA3板中的DNA样品95℃变性20min，然后室温静置30min，然后280×g离心，弃盖。将未开封的新的SNP芯片组装到杂交槽上，按照DNA顺序把12μl DNA样品点到芯片相应的位置上，封盖。最后将点好DNA样品的杂交槽放置在预热好的48℃的杂交炉中杂交16h。

⑥芯片清洗、单碱基延伸及染色：首先将高密度SNP芯片安装在齿条上，浸入PB1溶液中，在1，2号洗盘中分别清洗芯片1min。组装芯片在流相槽中，加入150ml PB1，固定芯片，并置凹槽与Fixture上。杂交后，用RA1试剂洗去未杂交上的和非特异性结合的DNA样品，然后在芯片表面加入XC1和XC2试剂准备进行延伸反应。加入200ul TEM试剂孵育15min到使单碱基扩增的引物与DNA样本杂交上，并使带有标记的核苷酸链接到扩增引物上。加入450μl95％的甲酰胺/1mM EDTA溶液孵育1min(2次)来移除杂交好的DNA，加入450μl XC3孵育1min(2次)试剂中和后，开始进行多次染色。

⑦包被芯片：染色结束后，取下芯片放在加有310ml PB1试剂的洗盘中上下异动10次，然后放置5min，然后在加有310ml XC4的洗盘中清洗，最后放在真空干燥泵中晾干50-55min。

⑧芯片上机扫描。

⑨将所得原始数据导入GenomeStudio数据分析软件(Illumina，Inc.)和“TOP/BOT”Strand分析方法，得到每个样本的SNP基因分型数据，分别设定GenTrain和Gencall10％为0.4和0.2来区分纯合和杂合位点。

4)鉴定F₁杂交群体流胶病抗性

于上海市农业科学院庄行试验基地桃种质资源圃进行杂交后代及亲本的流胶病抗性分析，对于资源圃内2年生桃树，流胶病病情调查分为6个等级。

病情等级划分标准如下：0级为全株正常，无流胶，无病斑植株；1级为主干、主枝和一级侧枝有散生或1-2个流胶点(流胶块直径小于3cm)；2级为主干、主枝和一级侧枝上有1/4以下面积的连片流胶，无法区分各流胶点；3级为主干、主枝和一级侧枝上有1/4-1/2以下面积的连片流胶，无法区分各流胶点，4级为主干、主枝和一级侧枝上有1/2-3/4以下面积的连片流胶，无法区分各流胶点；5级为主干、主枝和一级侧枝上有3/4以上面积的连片流胶，无法区分各流胶点。

根据加权平均法计算杂交后代的发病指数，主干占70％比重，主枝和一级侧枝之和占30％比重，从而计算得到流胶病表型数据，参见表1和图1。

表1

由表1及图1可见，所述SNP位点的基因型为AG时，桃树流胶病的发病率显著高于基因型为GG时。

5)分子标记与抗病基因的连锁分析

采用软件Joinmap 4.0构建遗传图谱，使用WinQTL cartographer 2.5QTL定位软件，采用复合区间作图法，设置窗口为0.5cM，模型选择向前/向后回归分析方法，运行参数设为默认值，进行QTL定位；采用LOD阈值设置为2.5，QTL置信区间为LOD值从峰值下降2对应的区间，同时计算每个QTL对表型的贡献率和遗传效应。

利用高密度SNP芯片对80个F₁杂交后代及2个亲本进行基因分型，最终构建了一张包含538个位点的连锁群，覆盖8个连锁群，总长度为530.38cM，其中，第6连锁群LG6包含84个SNP标记位点，基于该遗传连锁图谱及80份杂交后代的基因型数据和流胶病表型数据，采用复合区间作图法，进行QTL分析及效应检测，最终在第6连锁群检测到一个与流胶病抗性相关的QTL，位于第6连锁群的26.7区间，参见图2，附近标记为SNP_IGA_627726，对应染色体物理位置7604716，其LOD、贡献率较大，分别为4.71和20％。

<110> 上海市农业科学院

<120> 一个与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记

<160> 3

<210> SEQ ID NO. 1

<211> 121

<212> DNA

<213> 桃（Peach）

<220>

<221> gene

<235> (1)...(121)

<220>

<221> mutation

<235> (61)

<223> n=a或g

<400> 1

ttcttcaacc tttccagaac tcgcgaaccc atcaatcaag aactgatacg tcttgatatc 60

naatgccatt ccttcctttt ccatcacaag caatatcaga tccaactctg gaaagttcca 120

t 121

<210> SEQ ID NO. 2

<211> 11

<212> 人工合成

<213> 桃（Peach）

<220>

<221> primer_bind

<235> (1)...(11)

<223>

<400> 2

cttcaacctt tccagaactc g 11

<210> SEQ ID NO. 3

<211> 23

<212> 人工合成

<213> 桃（Peach）

<220>

<221> primer_bind

<235> (1)...(11)

<223>

<400> 3

tggaactttc cagagttgga t 11

Claims (6)

1.一个与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记，其位于桃的第6条连锁群上，该SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第61位碱基为A或G；第61位碱基为G的桃树具有流胶病抗性。

2.根据权利要求1所述的与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，第61位碱基为A时，SNP分子标记的基因型为AG型；第61位碱基为G时，SNP分子标记的基因型为GG型，所述SNP分子标记的AG基因型个体的流胶病发病率显著高于GG型个体。

3.用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。

4.如权利要求1或2所述的与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记在桃树品种或品系选育中的用途。

5.根据权利要求1所述的与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记是通过抗病性品种‘锦绣黄桃’和感病性品种‘玉露蟠桃’杂交后筛选获得的。

6.利用权利要求1所述的与桃树流胶病抗性相关的SNP分子标记检测桃树流胶病的方法，包括以下步骤：

1)提取待测桃树的基因组DNA；

2)利用权利要求3所述的引物对，将所述待测桃树的基因组DNA进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；

4)基于所述测序结果，确定所述待测桃树的所述SNP分子标记的基因型；第61位碱基为A时，SNP分子标记的基因型为AG型；第61位碱基为G时，SNP分子标记的基因型为GG型；

5)根据步骤4)所述SNP分子标记的基因型，判定所述待测桃树的流胶病抗性，所述SNP分子标记的基因型为AG时，桃树流胶病发病率显著高于基因型为GG的桃树。