CN105985952B - 莲藕淀粉相关基因gbss功能分子标记引物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物及应用。申请人基于新发现分子标记FMGBSS‑I3设计了引物gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。该引物对可用于辅助鉴别莲藕中支链淀粉、直链淀粉、总淀粉及总干重含量关系，进而用于藕莲育种选择。本发明的方法可以在幼苗阶段筛选，对培育高（或低）淀粉、高（或低）直链或高（或低）支链淀粉的藕莲品种具有重要指导作用，可以加快育种速度，降低育种成本，并具有操作简单、成本低廉、周期短的优点，适于推广应用，为莲藕种质的鉴定和莲藕育种选择提供了一种快捷的选择方法，具有很高的开发和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体涉及莲藕淀粉相关基因GBSS(合成颗粒结合型淀粉合成酶)功能分子标记引物及应用
背景技术
莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn)是睡莲科多年水生草本植物，在中国、日本和东南亚国家和地区普遍种植。淀粉约占莲藕根状茎总干物重的70％，因此淀粉含量、淀粉组成及其组成特性直接影响莲藕的品质。根据淀粉含量不同，通常将莲藕分为两类：一类是脆质类型，目前中国加工出口的莲藕产品及适于日常炒食所用鲜藕，都属于这一类。该类型莲藕含水量和含糖量相对较高，而淀粉含量和粗纤维含量相对较低，食用脆嫩爽口；第二类为粉质类型，其主要特点是含水量较低，淀粉含量高，尤其支链淀粉所占比例大，煮食口感酥粉柔软，也适合加工藕粉。
植物淀粉主要有直链淀粉和支链淀粉两类，影响莲藕加工品质的是以淀粉为主的碳水化合物和淀粉中直链淀粉、支链淀粉含量。直链淀粉是由α-1,4糖苷键连接而成的葡萄糖聚合体，它是一种线性大分子，没有或很少有分支；支链淀粉则是先由α-1,4糖苷键连接葡萄糖残基所形成的长链，再在长链上通过α-1,6糖苷分支键形成分支链而形成的葡萄糖聚合体，其分子量比直链淀粉大，淀粉合成酶(GBSS,Granule-Bound Starch Synthase)在此过程中起决定性作用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物，其为：gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。该引物可用于鉴定莲藕中的淀粉含量。
本发明的另一个目的在于提供了一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物的应用，该应用包括鉴定不同淀粉含量的莲藕品系，莲藕的早期育种筛选。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
申请人发现，GBSS等位基因中第三个内含子处出现了序列差异，特将该分子标记命名为FMGBSS-I3，针对该分子标记设计了引物如下：
一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物其为：gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。
一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物的应用，包括鉴定不同淀粉含量的莲藕品系，莲藕的育种筛选。该应用通过以下方式实现：
利用引物gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。对莲藕DNA进行PCR扩增，扩增结果两条带为高淀粉含量的莲藕，扩增结果一条带为低淀粉含量的莲藕。
具体请详见具体实施方式。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1、本发明所用引物少，且效率高；并具有操作简单，成本低廉，周期短的优点，适于推广应用，为莲种质资源的鉴定与莲藕育种选择提供了一种快捷的方法，具有很高的应用价值。
2、本发明所用引物直接开发于GBSS基因上，基因序列的长度差异直接对应于品种的表型差异，可靠性更高。
附图说明
图1为引物gbf3和gbr3针对GBSS基因的设计位点。
其中黑色加粗斜体为引物序列，灰度背景色为内含子序列，透明背景色黑色字体为外显子。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：
莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物的获得：
1、取45份成熟莲样品，利用常规技术测莲藕的支链淀粉占干物质百分含量、直链占干物质百分含量、总淀粉/干物质百分含量、支链淀粉占总淀粉含量和直链淀粉占总淀粉含量。
见表1。
表1莲藕样品的淀粉含量
2、在NCBI中找出莲淀粉相关基因GBSS(合成颗粒结合型淀粉合成酶)的DNA序列和cDNA序列，blast比对，找出GBSS中的外显子和内含子序列，考虑到外显子选择压力大、变异小，所以最终将引物设计于外显子之上。设计了的引物如下表2。
表2：基因GBSS外显子上设计的14对引物序列
3、取45份莲样品的嫩叶用Plant Genomic DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒提取莲总DNA。具体如下：
①取30mg莲干叶片，打磨成粉末。
②将粉末迅速转移到装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。
③加入700μL氯仿，充分混匀，12，000rpm离心5min。
④小心的将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。
⑤将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm离心30s，弃掉废液。
⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12，000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑦向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12，000rmp离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
⑧重复操作步骤⑦。
⑨将吸附柱CB3放入收集管中，12，000rmp离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液。
⑩将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加65μL的ddH2O,室温放置2-5min，12,000rmp离心2min，将溶液收集到离心管中。
4、在25μL的PCR体系中取上述稀释十倍的DNA提取液1μL，加入10μM的正向引物和反向引物各1μL，10mMol的dNTP(三磷酸碱基脱氧核苷酸)1.2μL，10×Taq Buffer(DNA聚合酶缓冲液)2.5μL，20mMol的Mg2+2μL，2U/μL的Taq酶0.5μL，加16.8μL的ddH2O。
| 组分 | 终浓度 | 加入体积 |
| ddH2O | - | 15.5μL |
| 10×Buffer(含20mmol/L Mg2+) | 1× | 2.5μL |
| dNTP(25mmol/L) | 600μmol/L | 0.6μL |
| 引物(20μmol/L) | 均1.2μmol/L | 1.5μL(正反) |
| Taq酶(2U/μL) | 2U | 1.0μL |
| DNA(10ng/μL) | 14ng | 1.4μL |
反应液上加盖15μL矿物油(Sigma)，以防止反应过程中水分蒸发。
5、PCR反应程序：94℃、4分钟，预变性45秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃终延伸8分种；4℃保存。
6、将PCR扩增产物进行6％聚丙烯酰胺电泳。在25μLPCR扩增产物中加入10μL3×Loading Buffer，混匀后，在95℃变性5min，立即放至冰上冷却5min以上，得到样品。每一个加样孔点入4μL样品(分子量标准为pBR322DNA/MspI)，在65W恒功率下电泳约60-80min。电泳结束后，进行银染显色。染色液由2g AgNO3、20mL HNO3和2L水组成，染色10-15min。显影液由40g NaOH、1mL 5％依来锘黑T和3mL 37％(体积百分含量)甲醛组成，至带纹出现。定影液为10％(体积百分含量)醋酸水溶液，定影5min。再用ddH2O漂洗5分钟。
7、结果表明：在十四对引物中，只有第三对引物gbf3(正向)和gbr3(反向)扩增的PCR产物有长度多态性，GBSS等位基因中第三个内含子处出现了序列差异。
8、在该多态性的条带中，将有一条目的条带的品种和两条目的条带的品种分成两组；将两组份的各数据进行t-检验，得出结果，支链淀粉占干物质百分含量、总淀粉占总干物质百分含量、支链淀粉占总淀粉百分含量、直链淀粉占总淀粉百分含量四个指标在两种标记类之间均具有显著性差异。见表3。
表3t-检验结果
“*”表示显著性相关，“NS”表示无相关
有两条PCR目的条带的样品平均总淀粉占干物质百分含量为37.33％，比有一条PCR目的条带的样品高(平均总淀粉占干物质百分含量为27.20％)，因此引物GBSS分子标记引物gbf3(正向)和gbr3(反向)可用于筛选不同淀粉含量的莲藕品系。
9、多态性的结果及其与表型的关系：有两条GBSS目的条带的样品支链淀粉占干物质百分含量、总淀粉占干物质百分含量和支链淀粉占总淀粉百分含量均较高，为高淀粉含量的莲藕；有一条GBSS目的条带的样品总淀粉占干物质百分含量较低、直链淀粉占干物质百分含量和直链淀粉占总淀粉百分含量均较高，为低淀粉含量的莲藕。
实施例2：
一种莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物的应用，包括鉴定不同淀粉含量的莲藕品系，莲藕的早期育种筛选，通过以下方式实现：
1.取莲湖野莲成熟的莲藕样品，提取基因组DNA；
2.用引物gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC和gbr3：GAAGCGAAGTTGGTTGTCA，对莲湖野莲基因组DNA进行PCR扩增。结果显示莲湖野莲基因组DNA进行PCR扩增产物有两条目的条带。因此可判定该莲湖野莲为高淀粉含量的莲藕。
利用常规方法对莲湖野莲成熟莲藕样品中支链淀粉占干物质百分含量、直链占干物质百分含量、总淀粉占干物质百分含量；支链淀粉占总淀粉含量百分含量、直链淀粉占总淀粉含量百分含量的指标进行检测，结果如下：
通过常规检测可知：
莲湖野莲成熟莲藕样品中总淀粉占干物质百分含量为46.76％(＞37.33％)，总淀粉含量偏高；为高淀粉含量的莲藕。
莲湖野莲成熟莲藕样品中支链淀粉占干物质百分含量为45.68％、支链淀粉占总淀粉百分含量为97.69％。
上述结果说明利用功能标记检测与常规的淀粉含量检测结果一致，表明本发明开发的分子标记引物可对不同淀粉含量的莲藕进行初步筛选，同时可以区分支链淀粉含量高和支链淀粉含量低的莲藕品种，直链链淀粉含量高和直链淀粉含量低的莲藕品种。该功能标记可代替常规的淀粉含量检测，提高检测效率。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物及应用
<130> 莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物及应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgcttcttc cactgctac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagcgaagt tggttgtca 19
Claims (5)
1.莲藕淀粉相关基因GBSS功能分子标记引物，gbf3:TCGCTTCTTCCACTGCTAC；gbr3:GAAGCGAAGTTGGTTGTCA。
2.权利要求1所述的分子标记引物在鉴定不同淀粉含量莲藕品系中的应用。
3.权利要求1所述的分子标记引物在莲藕的淀粉含量相关早期育种筛选中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的应用为在鉴定直链淀粉含量高和直链淀粉含量低的莲藕品种中的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的应用为在鉴定支链淀粉含量高和支链淀粉含量低的莲藕品种中的应用。
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