CN109517924B - 一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种柑橘果实花青苷积累形成的红肉性状的分子检测方法。所述方法通过提取柑橘DNA，根据Cs6g17570转录因子上游插入的逆转座子与其第一个外显子之间的核苷酸序列设计特异性上、下游引物，进行PCR扩增。PCR产物包含一段特异扩增片段，全长304bp。如果待测样本中含有此条扩增片段，则表明样本果实具有红肉性状，即果肉中积累了具有保健功能的花青苷。利用此方法对不同柑橘品种、杂交后代、嫁接突变体进行红肉性状的分子鉴定，相关实验结果表明本方法可以快速鉴定柑橘果实花青苷积累形成的红肉性状。样本取材方便，检测灵敏度高，成本较低，操作简单，便于推广应用于富含花青苷的柑橘新品种早期鉴定。

Description

一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，应用于具有保健功能的红肉性状的快速鉴定，本发明对杂交、芽变等材料进行早期大规模分子辅助筛选，加快富含花青苷的柑橘新品种、新材料的选育进度。

背景技术

柑橘不同品种的果皮和果肉呈鲜艳的橙黄色、橙红色、粉红色、红色或紫红色，除了类胡萝卜素、番茄红素的大量积累所致外，果实中花青苷合成使果肉呈现漂亮的紫红色。花青苷由类黄酮生物合成途径产生，是大多数植物的呈色物质。血橙果皮、果肉都富含花青苷，其果汁中花青苷主要成分是矢车菊素-3-葡萄糖苷，矢车菊素-3-(6-丙二酰葡萄糖苷)和6种其它次要成分。血橙特有的花青苷呈现紫红色使其表现出有别于其他品种的明显颜色差异。同时，花青苷是一种体内自由基清除剂，具有高抗氧化生物活性。因此经常食用富含花青苷的食品，可以显著降低心血管系统疾病的发生率。目前血橙在外观和功效上均广受消费者喜爱，具有较好的推广前景。

同时，如何快速、准确、高效地鉴定柑橘是否具有花青苷积累形成红肉性状的能力成为选种、育种迫切需要解决的问题。柑橘长期无性繁殖，使其形成了形形色色的突变类型。芽变最为普遍，红肉脐橙是华盛顿脐橙的芽变，但因其往往源于原有品种的微小变化，采用传统的形态学、同工酶、核酸标记技术难以鉴定遗传差异极小的芽变等突变体。

血橙等果树中都发现了相似MYB-bHLH-WD40蛋白复合体(MBW)，包括一个具有R2R3MYB保守结构域蛋白、一个bHLH型蛋白和一个WD40重复序列蛋白，该复合体调控类黄酮生物合成途径下游基因的转录，促进花青苷生物合成结构基因的转录和花青苷在果肉中的积累。

本发明利用分子标记技术，提取植株DNA进行PCR扩增，根据特异扩增条带快速鉴定柑橘不同品种、杂交后代与突变体的果实是否具有花青苷生物合成能力，即红肉性状。本发明将应用于富含花青苷的柑橘新品种、新材料的早期鉴定(然而柑橘童期大约3年，过后才能观察其果肉颜色)，显著提高血橙新品种的选育效率。

发明内容

本发明首先提供了一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，该方法包括：提取待测柑橘植株DNA，针对基因组内LTR与Cs6g17570第一外显子之间的序列进行PCR扩增，根据扩增产物来鉴定待测品种的果实是否具有花青苷积累形成红肉性状的特性。

具体地，一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，该方法包括：提取待测柑橘植株DNA进行PCR扩增，根据扩增产物中是否含有核酸序列SEQ ID NO.1来鉴定待测柑橘是否具有花青苷积累形成红肉性状的特性，SEQ ID NO.1(304bp)为：TGCTTCACCCACCAATTTCCTAACATTAACAAGTATTGTTTACTATTTTTGGACGAAGAATAGTAGAAGTAGTTTCCTTGTGGATGCAAGACAAGCACGTCACTCTCTCCGAAAAGGCTTAATTGATCGACGTAGCATGAAGTGAGGAGCACGTATTATTATACAAGCAGCTGTTCTGTAGGCTCTTTAAATTTTATAAAAAAAGAGAGTTGAGTAAGTGTAGGTGCTAATTAAATTTTGATTTTTTAGGTAAGCACATATACTACACATAGGGTCTTTATGGCGGATTCCTTAGGAGTTCGTA。

具体地，一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，该方法包括：提取待测柑橘植株DNA进行PCR扩增，根据扩增产物是否含有304±10bp的核苷酸片段来鉴定待测柑橘果实是否具有花青苷积累形成红肉性状。

上述柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，所述PCR扩增的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。SEQ ID NO.2为：tgcttcacccaccaatttcctaaca；SEQ IDNO.3为：tacgaactcctaaggaatccgccat。

进一步地，上述柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，根据扩增产物是否含有304bp的核酸片段来鉴定待测柑橘是否具有花青苷积累形成红肉性状的特性。

进一步地，上述柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，根据扩增产物的核苷酸序列是否为SEQ ID NO.1来鉴定待测柑橘是否具有花青苷积累形成红肉性状的特性。

进一步地，上述柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，所述提取待测柑橘植株DNA包括称取柑橘嫩叶50-100mg，在液氮中研磨成粉，转入2ml离心管中；加入500μLBuffer CP1，6μL2-巯基乙醇，涡旋震荡30s，加入5μL RNAse1.65℃水浴15min，每隔3min上下颠倒混匀一次，加入氯仿：异戊醇＝24:1的混合液800μL，涡旋震动30s，离心，10000g，10min；取新1.5ml离心管，转300μL上清液至离心管；加入150μL Buffer CP2和300μL无水乙醇，上下颠倒数次混匀；分两次加入吸附柱(附收集管)中，离心，10000g，1min；换新收集管，加入650μL wash Buffer，离心，10000g，1min，重复三次；换新收集管，空离一次，14000g，2min；加入50-100μL 65℃水浴预热的Elution Buffer洗脱，12000g，1min。

进一步地，上述柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，PCR扩增的体系包括：DNA模板：2μL，Buffer：2.5μL，dNTP：0.5μL，Fannie-F：0.5μL，Cici-R：0.5μL，Taq：0.5μL，ddH₂O：16.5μL。

进一步地，上述柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，PCR扩增的条件为：预变性：94℃ 5min；变性：94℃ 30s，复性：59℃ 30s，延伸：72℃ 30s，合计35个循环；延伸：72℃ 5min。

进一步地，上述柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，在PCR扩增结束后，取扩增反应液5μL，混匀2μL loading buffer，待测样本的扩增产物与DL2000(核酸分子Marker)在1.5％琼脂糖凝胶上样，80V恒压水平电泳25min后，在凝胶像仪上自动曝光成像，最后根据扩增产物碱基数大小，鉴定待测柑橘果实是否具有花青苷积累形成红肉性状。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的发明人在对花青苷生物合成起调控作用的转录因子Cs6g17570的上游调控序列中，发现插入了一个逆转座子。利用逆转座子插入多态性标记技术，在该逆转座子侧翼的长末端重复序列(LTR)与Cs6g17570的第一个外显子之间设计特异引物，扩增出特异大小的核苷酸片段来鉴别柑橘果实是否具有花青苷积累形成红肉性状，弥补了传统形态学、同工酶、核酸标记技术难以鉴定此类微小突变的不足。

2、采用凝胶电泳，可以同时实现对多个样品的快速、高通量分析，且为共显性标记。该方法对不同柑橘品种、杂交后代与突变体进行了红肉性状的分子鉴定，且灵敏度高，成本较低，快速简单，便于推广应用。

附图说明

图1不同柑橘品种的果肉中花青苷含量与Cs6g17570表达量

1是“脐血橙”(花青苷积累形成红肉性状)，2是“晚红血橙”(花青苷积累形成红肉性状)，3是“21世纪脐橙”(无花青苷的普通黄肉性状)，4是“卡拉卡拉红肉脐橙”(番茄红素积累形成红肉性状)。结果表明：高花青苷含量的“脐血橙”与“晚红血橙”果实中Cs6g17570在基因转录水平上，显著高于对照品种(21世纪脐橙与卡拉卡拉红肉脐橙)。

图2果实不同发育时期的果肉中花青苷含量与Cs6g17570转录量变化

随着果实发育成熟，“晚红血橙”果肉中花青苷含量显著升高。同时，其果肉中Cs6g17570转录量显著升高。花青苷含量变化与其转录量呈极显著关系(γ＝0.798，P＝0.01)。

图3红肉性状的柑橘基因结构与其引物设计

LTR代表逆转座子的长末端重复序列，E1代表Cs6g17570第一个外显子，E2代表Cs6g17570第二个外显子，E3代表Cs6g17570第三个外显子，本发明设计一对特异性引物Fannie-F(SEQ ID NO.2)和Cici-R(SEQ ID NO.3)，扩增LTR和E1之间的基因组核苷酸序列，用以检测待测样本的果实是否具有红肉性状。

图4本发明方法开展柑橘红肉性状的分子鉴定

根据已知碱基数的核酸片段(分子marker)，具有红肉性状的叶片基因组中扩增出大约300bp片段。同时扩增片段的测序结果表明：具有红肉性状的基因型都含有304bp核酸序列(SEQ ID NO.1)。

图5本发明方法对不同果肉颜色性状的柑橘品种进行验证

其中1-9和11为普通黄肉品种，而10和12-20是花青苷积累形成红肉性状的品种，本发明方法检测结果与果肉颜色完全匹配，其红色果肉性状与扩增条带紧密连锁。

图6本发明方法对不同花青苷含量的杂交后代进行验证

利用中国农业科学院柑橘研究所提供“W默科特”橘橙与“塔罗科”血橙杂交后代群体，本发明对不同花青苷含量的橘橙杂交后代进行验证。结果表明具有红肉性状的F1杂交后代(编号70)有扩增条带(大约304bp)，而黄肉性状的F1杂交后代(编号71、72、73、74、75、76、96)没有扩增条带。

图7本发明方法对具有红肉性状的嫁接突变体进行验证

日本大和田会将“太田”椪柑珠心胚实生枝条(亲本2)嫁接到“摩洛”血橙(亲本1)，然后取两者结合部发生的周缘嵌合突变体选育而成“媛红”椪柑(嫁接突变体)。“媛红”椪柑同时具有两个亲本的条带(白色与黑色箭头表示)，其中包含红肉性状特异连锁的304bp扩增条带(黑色箭头表示)。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的内容作进一步的阐述。

为了标记柑橘红肉性状，本发明首先定位了一个柑橘的Cs6g17570转录因子。Cs6g17570转录因子只在具有红肉性状的柑橘品种有表达，如图1所示。此外，这个转录因子随着血橙果实发育，其转录水平逐渐增高，如图2所示。另外，在这个转录因子上游调控序列内，发现插入了一个逆转座子，如图3所示。基于此，发明人首次根据逆转座子的长末端重复序列(LTR)与转录因子的第一个外显子(E1)之间的序列设计了特异引物。利用引物对进行PCR扩增，根据扩增产物检测待测样本是否具有红肉性状的果实。

根据以上研究结果可以进行杂交、芽变等突变体材料的早期辅助筛选，而普通杂交苗需要3年的生长才能度过童期，最终观察其果实的颜色性状。本发明为红肉性状的品种选育提出了一种快速分子检测方法。该方法是检测样本基因组中是否包含了一段特异的核酸片段。更具体而言，是针对逆转座子LTR与Cs6g17570第一外显子之间设计特异性引物，并进行PCR扩增，再根据扩增产物的核酸序列来鉴定待测品种是否具有因花青苷积累而形成的红肉性状。

本发明人设计了一对特异性引物来进行上述的PCR扩增。只在具有红肉性状的样本中，得到大约300bp的扩增产物。在一些具体实施例中，扩增产物为304bp；而不具有红肉性状的柑橘样品不存在目标大小的扩增片段。因此，作为本发明的一种具体的检测方法，是通过判断扩增产物是否具有304±10bp的核酸片段来鉴定红肉性状。

此外，本发明人对扩增产物的核酸序列进行了研究，发现具有红肉性状的样品的扩增产物具有以下核酸序列，SEQ ID NO.1：TGCTTCACCCACCAATTTCCTAACATTAACAAGATTGTTTACTATTTTTGGACGAAGAATAGTAGAAGTAGTTTCCTTGTGGATGCAAGACAAGCACGTCACTCTCTCCGAAAAGGCTTAATTGATCGACGTAGCATGAAGTGAGGAGCACGTATTATTATACAAGCAGCTGTTCTGTAGGCTCTTTAAATTTTATAAAAAAAGAGAGTTGAGTAAGTGTAGGTGCTAATTAAATTTTGATTTTTTAGGTAAGCACATATACTACACATAGGGTCTTTATGGCGGATTCCTTAGGAGTTCGTA。因此，作为本发明的另一种具体的检测方法，是通过判断扩增产物是否包括以上序列来鉴定红肉性状。

本发明的详细的检测方法，以及该检测方法的准确性，将通过以下具体实例来体现。下述实例中的试剂和材料除特别说明外，均可商购获得。

实施例1

分别榨取“脐血橙”(花青苷积累形成的红肉性状)、“晚红血橙”(花青苷积累形成的红肉性状)、“21世纪脐橙”(普通黄肉性状)与“卡拉卡拉红肉脐橙”(番茄红素积累形成的红肉性状)果汁，使用分光光度计测定待测样本的果汁分别在两种缓冲液中的吸收光值(510nm波长下)，再计算得到果汁中花青苷的总含量。结果如图1所示，果肉红肉性状与花青苷的含量成正相关。采用荧光定量PCR方法检测果肉中Cs6g17570的相对转录量。结果如图1所示，花青苷的含量越高的果肉中Cs6g17570的转录水平越高。

实施例2

选用“晚红血橙”研究果肉中Cs6g17570转录量随果实发育的变化。

随着果实发育与成熟，分别测量果肉中花青苷含量与Cs6g17570的转录量。结果表明随着“晚红血橙”果实发育成熟，其果肉中Cs6g17570的转录量与果汁中花青苷含量变化呈极显著正相关(γ＝0.798，P＝0.01)。

本发明人研究了Cs6g17570及其上游调控序列中插入了逆转座子。如图3所示，根据基因结构设计了以下引物，通过PCR扩增检测待测样品的红肉性状。

Fannie-F:tgcttcacccaccaatttcctaaca SEQ ID NO.2

Cici-R:tacgaactcctaaggaatccgccat SEQ ID NO.3

实施例3

DNA提取

称取不同品种叶片50-100mg，在液氮中研磨成粉，转入2ml离心管中。加入500μLBuffer CP1，6μL2-巯基乙醇，涡旋震荡30s。加入5μL RNAse1.65℃水浴15min，每隔3min上下颠倒混匀一次。配置氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24:1)，加入800μL混合物，涡旋震动30s，离心，10000g，10min。取新1.5ml离心管，转300μL上清液至离心管。加入150μLBuffer CP2和300μL无水乙醇，上下颠倒数次混匀。分两次加入吸附柱(附收集管)中，离心，10000g，1min。换新收集管，加入650μL wash Buffer，离心，10000g，1min，重复三次。换新收集管，空离一次，14000g，2min。加入50-100μL Elution Buffer(65℃水浴预热)洗脱，12000g，1min。DNA提取完成后，利用超微量分光光度计进行基因组的浓度(OD260/OD280＝1.8-2.0)与其纯度测量(50-80ng/μL)。

引物序列

Fannie-F:tgcttcacccaccaatttcctaaca

Cici-R:tacgaactcctaaggaatccgccat

PCR体系

DNA模板：2μL(大约100ng)，Buffer：2.5μL，dNTP：0.5μL，Fannie-F：0.5μL，Cici-R：0.5μL，Taq：0.5μL，ddH₂O：16.5μL。

反应方法

预变性：94℃ 5min；变性：94℃ 30s，复性：59℃ 30s，延伸：72℃ 30s，合计35个循环；延伸：72℃ 5min。

电泳检测

取扩增反应液5μL与2μL Loading buffer混匀后，在1.5％琼脂糖凝胶上样。恒压电泳25min后，在凝胶像仪上自动曝光成像。结果如图4所示，可见大约300bp的特异扩增片段。

实施例4

本发明方法对不同品种进行红肉性状的分子鉴定

20种柑橘品种中，黄肉品种(编号1-9、11)依次为：21世纪脐橙、南丰蜜桔、柠檬、酸橙、锦橙、柚、金柑、温州蜜柑、红橘、纽荷尔脐橙；红肉品种(编号10、12-20)依次为：摩洛血橙、1号血橙(塔罗科血橙株心系选育，未审定)、2号血橙(塔罗科血橙株心系选育，未审定)、3号血橙(塔罗科血橙株心系选育，未审定)、春红血橙(塔罗科血橙株心系选育，四川省农业科学院园艺研究所选育)、5号血橙(塔罗科血橙株心系选育，未审定)、6号血橙(塔罗科血橙株心系选育，未审定)、7号血橙(塔罗科血橙株心系选育，未审定)、晚红血橙(塔罗科血橙株心系选育，四川省农业科学院园艺研究所选育)、早红血橙(塔罗科血橙株心系选育，四川省农业科学院园艺研究所选育)、10号血橙(塔罗科血橙株心系选育，未审定)。

柑橘品种的扩增结果并联合分析其果肉颜色。结果如图5所示，花青苷积累形成的红肉性状与扩增条带紧密连锁(大约300bp)。

实施例5

本发明方法对杂交后代进行红肉性状的分子鉴定

中国农业科学院柑橘研究所以“W默科特”橘橙与“塔罗科”血橙为亲本，获得杂交后代。编号70-76、96分别是杂交后代，检测方法如实施例3，结果如图6所示，根据本发明检测方法获得的结果，具有红肉性状的F1杂交后代(编号70)有扩增条带(约300bp)，同时杂交种具有花青苷积累形成的红肉性状；然而黄肉性状的F1杂交后代(编号71-76、96)没有扩增条带，所以不具有花青苷积累形成的红肉性状。

实施例6

采用本发明方法对嵌合突变体进行红肉性状的分子鉴定。

待测样品包括亲本1(“摩洛”血橙)，亲本2(“太田”椪柑)，以及日本大和田会将亲本2嫁接到亲本1，然后取两者结合部发生的周缘嵌合体选育而成的“媛红”椪柑(突变体)。检测方法同实施例3，结果如图7所示。“媛红”椪柑同时包含两个亲本的条带(白色与黑色箭头表示)，其中红肉性状特异连锁扩增条带(约300bp)，因而突变体具有因花青苷积累形成的红肉性状。

以上实施例可以看出，本发明具有准确、快速、高效的优点。本发明弥补了现有技术难以对微小(点)突变进行检测导致不能区分花青苷积累形而成的红肉性状的不足。这为红肉性新品种选育提供了有效的检测手段。

以上仅是本发明较佳的一些实例，但不应理解为本发明的范围仅限于此，根据本发明的发明思路和全文内容，对上述内容所做的调整和修改，均属于本发明保护的范畴。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川省农业科学院园艺研究所

<120> 一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法

<130> 201901

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 304

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(304)

<400> 1

tgcttcaccc accaatttcc taacattaac aagtattgtt tactattttt ggacgaagaa 60

tagtagaagt agtttccttg tggatgcaag acaagcacgt cactctctcc gaaaaggctt 120

aattgatcga cgtagcatga agtgaggagc acgtattatt atacaagcag ctgttctgta 180

ggctctttaa attttataaa aaaagagagt tgagtaagtg taggtgctaa ttaaattttg 240

attttttagg taagcacata tactacacat agggtcttta tggcggattc cttaggagtt 300

cgta 304

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 2

tgcttcaccc accaatttcc taaca 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 3

tacgaactcc taaggaatcc gccat 25

Claims (5)

1.一种柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，其特征在于，该方法包括：提取待测柑橘植株叶片DNA，使用PCR引物对进行PCR特异扩增，所述PCR引物对的F引物和R引物的核酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，根据扩增产物的核苷酸序列是否如SEQID NO.1所示来鉴定待测样本的果实是否具有花青苷积累形成红肉性状；

扩增产物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示的待测柑橘具有红肉性状。

2.根据权利要求1所述的柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，其特征在于，根据扩增产物大小是否为304bp来鉴定待测柑橘是否具有花青苷积累形成红肉性状；

扩增产物为304bp的待测柑橘具有红肉性状。

3.根据权利要求1或2任一项所述的柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，其特征在于，所述PCR特异扩增的体系包括：DNA模板2μL，Buffer2.5μL，dNTP0.5μL，F引物 0.5μL，R引物 0.5μL，Taq酶 0.5μL，ddH₂O16.5μL。

4.根据权利要求1或2任一项所述的柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，其特征在于，PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸30s，合计35个循环；72℃延伸5min。

5.根据权利要求1或2任一项所述的柑橘花青苷积累形成红肉性状的分子检测方法，其特征在于，PCR结束后，取扩增产物5μL，加入2μL loading buffer混匀，将扩增产物与DL2000在1.5％琼脂糖凝胶上上样，80V恒压水平电泳25min后，在凝胶成像仪上自动曝光成像，最后根据扩增产物大小是否为304bp，来鉴定待测样本的果实是否具有花青苷积累形成红肉性状；

扩增产物为304bp的待测柑橘具有红肉性状。

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