CN108277221B

CN108277221B - 一种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2的功能标记及其应用

Info

Publication number: CN108277221B
Application number: CN201810337659.4A
Authority: CN
Inventors: 孔令让; 王彪; 李学峰
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2021-07-20
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN108277221A

Abstract

本发明公开了一种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy‑e2的功能标记，其中PCR引物序列为PSY‑F和PSY‑R。检测步骤如下：采用Buffer S法提取小麦叶片的全基因组DNA；利用psy‑e2基因功能标记检测提取DNA进行PCR扩增；PCR产物进行PAGE电泳，采用银染法进行显色反应后观察结果。本发明中psy‑e2的功能分子标记不依赖于分子遗传作图，利用该功能标记可提高分子标记辅助选择的效率，并且可直接应用于生产实践，为通过分子标记辅助选择的方法选育黄色素含量低的改良系或杂交种提供技术支撑。

Description

一种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2的功能标记及其应用

技术领域

本发明属于小麦分子育种的技术领域，尤其涉及一种鉴定八氢番茄红素合成酶基因psy-e2的功能标记及其方法。

背景技术

小麦是全世界最重要的粮食作物之一。近年来，随着生活水平的提高，人们对优质小麦的需求日益增加，越来越重视面粉及其制品的营养问题。如何使馒头、水饺、面条等传统蒸煮类食品做到既好吃又好看又富有营养成为优质小麦育种的目标之一。而小麦籽粒中黄色素的含量与蒸煮面食品的色泽及其营养品质等密切相关。中国和欧美等地亮白色的面制品备受青睐。黄色素是造成面粉白度下降的重要因子，降低小麦籽粒中黄色素含量成为我国小麦品质改良的重要方向之一。相反，在日本、东南亚国家消费的黄碱面条要求亮黄色，黄色素含量高的面粉可制作出高品质的黄亮的面制食品。因此，黄色素含量的高低影响着小麦的外观品质，黄色素含量成为了小麦品质育种的重要一环。

黄色素的主要成分是类胡萝卜素。而八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase，PSY）是类胡萝卜素生物合成途径中关键限速酶，直接影响籽粒胚乳的颜色。位于小麦第七同源群的psy成为类胡萝卜素生物合成的关键基因。越来越多的研究发现，鉴定的普通小麦及近缘种psy等位变异主要分布于A、B、D、S和E亚基因组上，其中以A亚基因组上最多。然而，我们发现与黄色素密切相关的psy-e2位于E亚基因组的7el₂上。因此，如何有效的鉴定psy- e2成为有效区别不同亚基因组来源的首要问题。

小麦是异源六倍体，基因组复杂，单纯依靠传统方法进行农艺性状的遗传改良效率低，不能适应当前育种需求，利用功能基因标记进行辅助选择可以提高小麦育种的效率，加速育种进程。因此，开发的psy-e2功能标记可以为选育黄色素含量的优质小麦提供技术支撑。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2的功能标记及其应用。

本发明的目的是提供特异性识别扩增小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记，以在育种方面进行应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记， PCR引物序列PSY-F为SEQ ID NO.1所示序列，引物序列PSY-R为SEQ ID NO.2所示序列；

SEQ ID NO.1：tggcttcaataggatcaaagta；

SEQ ID NO.2：ccagctcgtctgtcctcctg 。

本发明还提供种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记的应用，在鉴定小麦黄色素基因型中的应用。

本发明提供鉴定小麦黄色素基因型为利用引物PSY-F和PSY-R进行扩增，扩增出157bp、183bp和186bp三个条带，代表小麦样品含有psy-e2基因；扩增出183bp和186bp两个条带，代表小麦样品不含有psy-e2基因。

优选的，PCR扩增和条带检测包括以下步骤：

（1）采用Buffer S法提取样品基因组DNA；

（2）以提取DNA为模板进行PCR扩增；

（3）非变性8%PAGE凝胶检测PCR产物，银染后显色。

更优选的，DNA模板1μL，10×Buffer反应缓冲液2.5μL，浓度为1U/μL rTaq DNA聚合酶0.2μL，浓度都为10μmol/L的引物PSY-F和PSY-R各为0.5μL，浓度为2.5μmol/L的dNTP为1.0μL，加水至25μL。

更优选的，所述PCR其反应反应程序是95℃ 5min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 50s，32循环；72℃ 10min。

本发明还提供了在小麦分子育种中的应用。

本发明的有益之处是：本发明所述的一种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记，是建立在等位基因的核心序列长度差异的基础上的共显性分子标记，不依赖于分子遗传作图，从而提高了分子标记辅助选择的效率。该功能标记可以有效区分不同亚基因来源的psy基因，可以直接服务于生产实践，进而提高小麦育种的效率，加速育种进程，在小麦分子育种中进行推广应用。

附图说明

图1 小麦八氢番茄红素合成酶基因psy核心序列比对（psy-a：CS-7A；psy-b：CS-7B；psy-d：CS-7D；psy-e2；字体加粗处为引物序列位置）。

图2 本发明八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记PAGE电泳的检测结果图（图中M, DL2000 Marker 条带依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1，7el₂；2，SDAU2003；3，7el₁；4，JM22；5，H₂O）。

图3 本发明对群体F₄后代样品的检测结果（图中M, DL2000 Marker 条带依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；1，SDAU2003；2，中国春ph1b；3-20，F₄后代样本；21，H₂O）。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的技术范围。

实施例1 制作psy-e2功能标记引物

根据小麦基因组数据库中psy基因参考序列保守区段设计引物，提取优异抗性材料小麦样本的基因组DNA，经过PCR扩增和测序分析，获得的psy-e2基因序列来自亲本7el₂。以来源于第七同源群的psy基因分别有7A、7B、7D与psy-e2进行序列（SEQ ID NO.3-6）比对，设计出鉴定psy-e2基因的特异性引物（图1）。

实施例2 本发明小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记。

本发明所述的小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记，其中引物包括：

引物序列PSY-F：TGGCTTCAATAGGATCAAAGTA（SEQ ID NO.1）；

引物序列PSY-R：CCAGCTCGTCTGTCCTCCTG（SEQ ID NO.2）。

本发明所述的一种基于psy-e2基因的鉴定小麦黄色素基因型的方法，包括以下步骤：

（1）采用Buffer S法提取样品基因组DNA；

所述的采用Buffer S法提取小麦样品的DNA，具体步骤如下：

称取0.05-0.10g小麦叶片，将叶片经液氮冷冻处理后迅速研磨成粉末，放入1.5mL离心管中，加入500μL预热60℃的Buffer S提取缓冲液，其中Buffer S提取缓冲液每升含有100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，100mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA(pH8.0)，2% SDS。置于60℃-65℃孵育30min。然后，加入等体积的氯仿，混匀后静置3min，于12000rpm离心10min后抽提500μL上清液，加入500μL异丙醇混匀后，室温放置15min。随后，12000rpm离心10min，倒掉上清液沉淀为基因组DNA。用500μL 70%乙醇洗涤两次后，使用水溶解沉淀，低温保存备用。

（2）以提取DNA为模板进行PCR扩增；

所述的PCR反应体系包括：DNA模板1μL，10×Buffer反应缓冲液2.5μL，浓度为1U/μL rTaq DNA聚合酶0.2μL，浓度都为10μmol/L的引物PSY-F和PSY-R各为0.5μL，浓度为2.5μmol/L的dNTP为1.0μL，加水至25μL。

所述的PCR反应程序是95℃ 5min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 50s，32循环；72℃10min。

（3）非变性8%PAGE凝胶检测PCR产物，银染后显色。

电泳结果分析，引物PSY-F和PSY-R扩增出157bp、183bp和186bp三个条带，代表小麦样品7el₂和SDAU2003样品含有psy-e2基因；扩增出183bp和186bp两个条带，代表小麦样品7el₁和JM22来自7A、7B，不含有psy-e2基因（图2）。

实施例3本发明小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记的应用

按照实例2中所述的小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2功能标记的方法进行操作。

样本群体为亲本SDAU2003和中国春ph1b构建的F₄后代样品。

为小麦本发明所述的一种基于psy-e2基因的鉴定小麦黄色素基因型的方法，包括以下步骤：

（1）采集样本；

（2）采用Buffer S法提取样品基因组DNA；

（3）以提取DNA为模板进行PCR扩增；

（4）非变性8%PAGE凝胶检测PCR产物，银染后显色。

电泳结果分析，引物PSY-F和PSY-R扩增出157bp、183bp和186bp三个条带，说明小麦样品含有psy-e2基因；扩增出183bp和186bp两个条带，说明小麦样品不含有psy-e2基因（图3）。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种小麦八氢番茄红素合成酶基因psy-e2的功能标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggcttcaat aggatcaaag ta 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagctcgtc tgtcctcctg 20

<210> 3

<211> 190

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum timopheevi x Triticum aestivum)

<400> 3

ccagggagct ggacgcgccg cgcggcgggc tcggggaggc ctacgcccgc tgcggcgaga 60

tctgcgagga gtacgccaag accttctacc tcggtacgcc actccttcgt ggatactctg 120

tttttcttga gccatggtgg caggctgcgt gccaagccgg tgttccggtg atcatggagc 180

tcactcgttc 190

<210> 4

<211> 189

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum timopheevi x Triticum aestivum)

<400> 4

ccttctacct cggtacggtg ctccttcatg catgcttact ctgtttttct tgagccatgg 60

tggcagtctg ccgcatgcca agcccatgtt ctgatgatca tggagctcac ccgttcatgt 120

ctggtcgtgc atggcaggga ccttgctgat gacagaggag cggcgacgcg ccatatgggc 180

catctacgg 189

<210> 5

<211> 192

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum timopheevi x Triticum aestivum)

<400> 5

gcgaggagta cgccaagacc ttctacctcg gtacaccact ccttcatgga tactctgttt 60

ttcttgaacc atggtggcat tctgctgcgt gccaagccgg tgttgtgctg atcatggagc 120

tcactcgttc atgtctggtc gtgcatggca gggaccttgc tgatgacgga ggagcggcgg 180

cgcgccatat gg 192

<210> 6

<211> 165

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum timopheevi x Triticum aestivum)

<400> 6

tggcttcaat aggatcaaag tacatgagaa aaggttgcgg acatgaatct gagggttctg 60

tcagttctaa atgagatata ctctaggcat tgatcacttt cagaatctga tgtgtagcat 120

catttgtgca gtgtggtgca ggaggacaga cgagctggtg gacgg 165

Claims

1.一种小麦八氢番茄红素合成酶基因 psy-e2功能标记，其特征在于：所述功能标记是用引物PSY-F和PSY-R进行扩增得到下述特征条带的功能标记，PCR引物序列 PSY-F为SEQID NO.1所示序列，引物序列PSY-R为SEQ ID NO.2所示序列；

SEQ ID NO.1：tggcttcaataggatcaaagta；

SEQ ID NO.2：ccagctcgtctgtcctcctg ；

利用引物PSY-F和PSY-R进行扩增，小麦样品含有 psy-e2基因则扩增出 157bp、183bp和186bp三个条带；小麦样品不含有 psy-e2基因则扩增出183bp和186bp两个条带。

2.根据权利要求1所述的一种小麦八氢番茄红素合成酶基因 psy-e2功能标记的应用，其特征在于：在鉴定小麦黄色素基因型中的应用。

3.根据权利要求2所述的一种小麦八氢番茄红素合成酶基因 psy-e2功能标记的应用，其特征在于：利用PCR扩增和条带检测包括以下步骤：

（1）采用Buffer S法提取样品基因组DNA；

（2）以提取DNA为模板进行PCR扩增；

（3）非变性8% PAGE凝胶检测PCR产物，银染后显色。

4.根据权利要求3所述的一种小麦八氢番茄红素合成酶基因 psy-e2功能标记的应用，其特征在于：所述PCR其反应体系包括：DNA模板1μL，10×Buffer反应缓冲液2.5μL，浓度为1U/μL rTaq DNA聚合酶0.2μL，浓度都为10μmol/L的引物PSY-F和PSY-R各为0.5μL，浓度为2.5μmol/L的dNTP为1.0μL，加水至25μL。

5.根据权利要求3所述的一种小麦八氢番茄红素合成酶基因 psy-e2功能标记的应用，其特征在于：所述PCR其反应程序是95℃ 5min；95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 50s，32循环；72℃ 10min。

6.根据权利要求1所述的一种小麦八氢番茄红素合成酶基因 psy-e2功能标记的应用，其特征在于：在小麦分子育种中的应用。