CN108795932B - Dna条形码、引物、试剂盒、方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种DNA序列、一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用。该DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组，并且包含根据本发明所述的DNA序列，并且该DNA条形码的长度为500bp‑2200bp，优选为500bp‑1500bp，更优选为500bp‑1000bp。该DNA条形码能够准确鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，可以快速准确地将该菌株从易混淆的菌株或同物种内其他菌株中鉴定出来。

Description

DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用

技术领域

本发明属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用。

背景技术

普洱茶是一种具有云南地理标识的后发酵茶，其采用大叶种晒青毛茶作为原料，经过一系列工艺制作而成。传统的普洱茶制作过程为：采摘的新鲜茶叶经揉捻、晒青、除杂、潮水、渥堆、晾干、筛分、压制成型、包装出厂。在普洱茶的生产中，渥堆发酵过程是普洱茶品质形成的主要因素，在此过程中，茶叶中诸如茶多酚、咖啡因以及一些多糖物质等内含成分发生了巨大变化，成就了普洱茶的特殊风味、口感、品质以及各种保健功效。

传统的普洱生产中，湿热的环境激活茶叶本身所含的酶，把茶叶中所含的一部分内含成分转化成微生物能利用的物质，微生物大量滋生，产生丰富的胞内酶和胞外酶，催化茶叶中包含的成分发生一系列转变，再加上湿热等其他因素，逐渐形成不同品质的普洱茶。不同的产地，因为其微生物群落结构的不同，风味及品质也各具特色。

普洱茶除了其独特的风味和文化外，其诸如减肥、降血糖血脂、预防和改善心血管疾病、抗衰老、抗癌、消炎、助消化以及养胃等保健功效也备受人们关注。近年来，普洱茶越来越受欢迎，逐渐增加的市场需求拉动了普洱茶产业的发展，促进了云南地区经济增长。

然而，普洱茶也面临着一些困境，例如产品质量不稳定、存在一定安全隐患、生产周期长、劳动力投入过高、微生物数量超标和螨虫滋生等。随着人们生活水平的提高，消费者对食品的卫生、安全等问题日益重视。近几年食品质量安全事件频发，茶叶质量的安全问题也日益突出，除了农药的残留问题之外，渥堆发酵过程中微生物也有可能成为影响茶叶质量的重要因素。

目前多数厂家的普洱茶生产仍然是半自然人工渥堆的经验式发酵，虽然渥堆过程中以食腺嘌呤节孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)等优势共性微生物为主的群落相对稳定，但产品的稳定性还存在较大的提升空间。生产过程中也不可避免的存在着一定的安全隐患，为了进一步获得消费者的青睐和市场的认可、突破外贸壁垒、提升普洱茶企业的市场竞争力，必须实现普洱茶生产工艺的人工可控化、清洁化以及高效化，并不断开发新产品、延伸产业链。要做到这些，就必须革新技术，发明一系列安全、清洁、高效、人工可控自动化的普洱茶新工艺，才能确保普洱茶产业的健康发展，给国家和人民带来长远利益。

随着普洱茶科研的进一步深入，越来越多的人们开始了人工接种发酵普洱茶的探索，目前已经有许多菌株应用于普洱茶人工可控发酵。近年由于市场需求加大，许多规模较小的厂家对普洱茶缺乏系统深入的研究，大肆滥用许多他人专利进行牟利，比如，按照一些接种发酵普洱茶的专利方法，采用一些菌种进行普洱茶发酵等一系列方法，进行普洱茶加工生产等经营活动，大大损害了一些具有相关专利的普洱茶生产企业的经济利益。

为确保普洱茶发酵微生物种质资源得到有效保护，防止滥用普洱茶发酵微生物的侵权行为发生，解决在普洱茶人工可控发酵过程中菌种侵权时难以举证的难题，开发对普洱茶发酵用菌株进行快速精准鉴别的方法势在必行，亟需建立其分子鉴定方法，开发通过DNA条形码技术准确鉴别与区分与其相似菌株的方法，以达到通过形态特征与分子数据分析相结合的方法来解决工业生产菌株鉴别和鉴定问题，为普洱茶有控工业发酵工艺开发和资源保护提供理论依据，促进普洱茶产业健康繁荣发展。

发明内容

为了克服形态学鉴定用于普洱茶发酵生产的食腺嘌呤节孢酵母菌株所存在的不足，本发明提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用，从而对食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株进行快速鉴别和区分，可为普洱茶新发酵工艺提供快速评估，防止发酵过程中其他杂菌的干扰，以及为普洱茶人工可控发酵工艺及菌种非法滥用提供举证方法和依据。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据本发明的一个实施方案涉及一种DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

根据本发明的另一个实施方案涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组，并且包含SEQ IDNo.2所示的DNA序列，并且该DNA条形码的长度为500bp-2200bp，优选为500bp-1500bp，更优选为500bp-1000bp。

在根据本发明优选的实施方案中，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。在本发明进一步优选的实施方案中，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

根据本发明的另一个实施方案涉及一种用于扩增本发明DNA条形码的引物对。

在本发明引物对优选的实施方案中，其正向引物的核苷酸序列与食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC 70007菌株基因组中如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的第1位的上游1000bp到如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的第1位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为20-30bp；其反向引物与所述TMCC70007菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC 70007菌株基因组中如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的最后一位到如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的最后一位的下游1000bp的区域中的序列，并且该反向引物的长度为20-30bp。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物：5’-TTCGTCGGGGAGATAGGGTT-3’；

反向引物：5’-TACAACAATGGCGGGACCTC-3’。

根据本发明的一个实施方案涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的试剂盒，包含本发明所述的引物对。

据本发明的另一个实施方案涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供待测菌株的基因组DNA；

b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求4所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

c)通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株，如果有目标条带，则进行步骤d)；

d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测序列与权利要求2所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性在97％以上，则判定待测菌株是食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株。

本发明的实施方案还涉及所述DNA条形码在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。

根据本发明的一还个实施方案涉及本发明的引物对在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1、本发明采用蛋白质基因组学技术从食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组中发现了漏注释的蛋白编码基因BS3F1522347，并且发现该基因的蛋白编码框(SEQ IDNo.2)为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组所特有。本发明进一步通过仔细的研究和比较分析，将该特有的DNA序列开发为了DNA条形码，作为鉴别普洱茶工业发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的有效工具。该条形码为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株基因组中包含上述特有的蛋白编码框的一段500-2200bp的序列，该条形码序列能实现食腺嘌呤节孢酵母种内菌株的快速准确鉴别与区分。

2、本发明进一步发现，相比于其他基因，BS3F 1522347基因中的序列(即SEQ IDNo.1)具有通用、易扩增、易比对的特点，其在食腺嘌呤节孢酵母种内不同菌株之间差异明显。

3、本发明建立了普洱茶工业发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的标准基因序列和样品鉴别方法，相比于传统的形态学鉴定方法，显著提高了鉴定效率。该方法对于样品的完整程度要求低，鉴别指标能够量化，这对于及时判定普洱茶及其种质资源提供了有效的依据。此外，进一步加入了形态学混淆种并运用基于聚类分析的系统发育树法设立鉴定规则进行了鉴定，其鉴定的可靠性和准确性也大大优于常规的分子鉴定方法，弥补了该类普洱发酵茶生产菌株基于DNA条形码技术的菌株鉴定的空白。

附图说明

图1示出了支持BS3F1522347编码基因编码LSASIAR的肽谱匹配(PeptideSpectrum Matches，PSMs)证据；

图2合成肽段LSASIAR质谱图与原鉴定肽段质谱图对比，该原鉴定肽段为本发明经过质谱分析并鉴定得到的肽段，在该图中上方为原鉴定LSASIAR肽段质谱图，下方为合成肽段LSASIAR质谱图；

图3肽段所在区域蛋白质编码框的mRNA序列及其编码的蛋白质序列对应图，图中灰色部分标出了肽段LSASIAR；

图4示出了BS3F1522347的部分蛋白编码区的扩增产物核苷酸序列，其中前后两端加粗的区域即为引物所在区域，灰色背景序列为本发明用蛋白质基因组学技术发现的新肽段对应的蛋白编码框，前后两个终止子分别为TAG和TGA；

图5A：条形码序列SEQ ID NO.1通过NCBI-BLASTN得到的与之具有同源性的序列比对图，在图5A下方的三个短的灰色段显示出3条同源性序列，图5A上方的值表示比对得分；5B：SEQ ID NO.1与其具有同源性的序列对比图；5C：SEQ ID NO.1与其具有同源性的序列对比图；5D：SEQ ID NO.1与其具有同源性的序列对比图；在图5B-D中，sbjct分别为(副球孢子菌(Paracoccidioides)lutzii Pb01假定蛋白部分mRNA(XM_015847037.1)；Paracoccidioides brasiliensis Pb18假定蛋白部分mRNA(XM_010758080.1)；团藻(Volvox carteri)f.nagariensis假定蛋白mRNA(XM_002953284.1))；

图6示出了食腺嘌呤节孢酵母的TMCC 70007条形码序列SEQ ID NO.1与食腺嘌呤节孢酵母LS3菌株同源序列的对比图；

图7示出了对利用本发明的引物得到的待测菌株PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果；

图8示出了SEQ ID NO.1序列与待测菌株PCR扩增序列的对比图；

图9示出了SEQ ID NO.4与同源性序列的对比图，在图9下方的示出了9条同源性序列。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明采用蛋白质基因组学技术从食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组中发现了漏注释的蛋白编码基因BS3F 1522347，并且发现该基因的蛋白编码框(SEQ IDNo.2)为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组所特有。因此，该特有的DNA序列可以用于开发鉴别普洱茶工业发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的DNA条形码。

因此，本发明的一个方面提供了一种DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

考虑到DNA条形码应当具有合适的长度和足够的菌株间特异性，本发明进一步通过仔细的研究和比较分析，基于上述特有的DNA序列获得了可准确、有效地鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的DNA条形码。该条形码为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株基因组中包含上述特有的蛋白编码框的一段500-2200bp的序列，该条形码序列能实现食腺嘌呤节孢酵母种内菌株的快速准确鉴别与区分。

具体而言，本发明另一方面提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码，该DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株的基因组，并且包含本发明所述的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的DNA序列，并且该DNA条形码的长度为500bp-2200bp，优选为500bp-1500bp，更优选为500bp-1000bp。

由于SEQ ID No.2为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株基因组所特有，因此包含其的、长度如上所述的DNA条码的特异性更加得到保证。另一方面，通常，DNA条形码的长度大于500bp时，也能够满足易扩增、易比对的操作要求。当DNA条形码的长度过长时(例如大于2500bp)，对于扩增操作而言较不理想。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述DNA条形码序列如SEQ ID No.4所示，更优选如SEQ ID No.1所示。

在本文中，术语“漏注释基因”是指物种完成基因组测序以后，采用基因预测软件(例如GeneMark、Augustus、Glimmer等)未能将该基因预测出来，这些基因一般表达量不高、在特定的条件下才表达，所以在研究中难以被发现。

术语“DNA条形码技术(DNA barcoding)”是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，其可以快速、准确的进行物种鉴定。

术语“六框翻译”是蛋白质组学和基因组学中的已知术语，简述其原理为，DNA编码蛋白质时，采用三联体密码子编码蛋白质，给定一条DNA序列，有3种编码可能性，加上其互补链上的3种编码可能，共有6种编码可能性(+1，+2，+3，-3，-2，-1)。

本发明的另一个实施方案提供了一种用于扩增本发明所述的DNA条形码的引物对。

优选地，其正向引物的核苷酸序列与食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株基因组中的这样的序列相同：该序列为从所述TMCC 70007菌株基因组中如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的第1位的上游1000bp到如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的第1位的区域中的序列，并且该正向引物的长度为20-30bp；其反向引物与所述TMCC 70007菌株基因组中的这样的序列反向互补：该序列为从所述TMCC 70007菌株基因组中如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的最后一位到如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的最后一位的下游1000bp的区域中的序列，并且该反向引物的长度为20-30bp。

在更优选的实施方案中，所述正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

BS3F1522347-F：5‘-TTCGTCGGGGAGATAGGGTT-3’(SEQ ID No.5)；

BS3F1522347-R：5’-TACAACAATGGCGGGACCTC-3’(SEQ ID No.6)。

本发明的引物能实现对所述DNA条形码序列的特异性扩增。

本发明还提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的试剂盒，包含根据本发明所述的引物对。

在另一实施方案中，所述试剂盒还包含根据本发明所述的DNA条形码。所述DNA条形码可存在于记录介质上。该记录介质例如为光盘。

本发明的又一方面提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供待测菌株的基因组DNA；

b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据本发明所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

c)电泳(例如琼脂糖凝胶电泳)检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007，如果有目标条带，则进行步骤d)；

d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测序列与权利要求2所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性在97％以上，则判定待测菌株是食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株。

在本发明的具体实施方案中，所述PCR扩增的程序为：1)94℃-96℃预变性8分钟；2)94℃-96℃变性45秒，55℃-57℃退火45秒，72℃延伸1分15秒，其中该程序2)进行30-35个循环；3)72℃延伸10分钟。

在本发明的又一实施方案中，所述方法还包括将测序结果得到的待测序列与本发明的DNA条形码进行聚类分析(例如系统发育树)，如果待测序列与DNA条形码聚类在一起，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007。

在本发明一个具体的实施方案中，利用本发明的引物对对提取自待鉴别的菌株的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。基于检测是否存在PCR产物来鉴别菌株：如果待鉴定的菌株没有扩增出相应的目标条带，则说明该菌株不是TMCC 70007；如果扩增出相应的目标条带，则证明该菌株可能是TMCC 70007。为了进一步进行鉴别，对PCR产物进行测序，将DNA测序结果与DNA条形码序列进行同源性比对，获得序列间的相似性(即同源性)，如果序列同源性小于97％，则判定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC70007。如果序列同源性大于或等于97％，则判定待测菌株是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC70007。

如果进行聚类分析，例如系统发育树，则将所述DNA条形码和各待鉴定菌株的DNA测序结果(即待测序列)一起应用MEGA 5.1或PAUP软件构建NJ系统发育树。如果待鉴定菌株的待测序列与食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的DNA条形码聚类在一起，则鉴定为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007。

在此所使用的术语“聚类”是指经系统发育树分析后，处于同一个分支，且进化距离相同。

本发明还提供了本发明所述的DNA条形码在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。

本发明还提供了本发明所述的引物对在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。

实施例

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。实施例中所用方法在未具体说明的情况下，均采用常规方法和已知工具。

实施例1：BS3F1522347基因和DNA条形码的获得

1、利用高覆盖蛋白质组技术，采用pFind和pAnno软件对普洱茶工业发酵菌食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007进行了蛋白质组的深度覆盖研究，并对其基因组进行了注释编码基因的验证，发现了漏注释的基因BS3F1522347。为了发现新的蛋白编码区，利用系统蛋白质基因组学中的六框翻译(Six Frame Translation)策略，获得了食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007基因组数据的六框翻译数据库，穷举了基因组的6种编码可能(+1，+2，+3，-1，-2，-3)，并且将该核酸序列称为“六框翻译核酸序列”，蛋白序列称为“六框翻译蛋白序列”。通常而言，六框翻译核酸序列是从一个终止子到下一个终止子的序列，在本文中，也将其称为“蛋白编码框”。利用这个数据库，采用pFind和pAnno软件对质谱数据进行了新肽段和新蛋白质的鉴定。

经鉴定，发现了一条现有技术中食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007注释基因组中未发现的肽段LSASIAR，质谱谱图如图1所示。

手工检查质谱谱图结果显示，检测到了肽段LSASIAR二级质谱谱图(MS2)的几乎所有y离子序列，匹配好，信号强，结果较为可信。为进一步确证这个鉴定结果，按照新鉴定肽段LSASIAR的氨基酸序列化学合成了该肽段，并利用上述LSASIAR的质谱分析条件产生了该合成肽段的二级谱图，参见图2。新合成肽段的二级质谱谱图和原先大规模蛋白质基因组学研究鉴定的新肽段LSASIAR的二级质谱谱图一致。

接下来，对合成肽段产生的高能量碰撞MS2进行了核实，一级母离子和二级子离子均符合理论值，表明合成的肽段序列正确(图2)。在此基础上，人工检查了根据大规模蛋白质组数据鉴定到的新肽段序列合成肽段的MS2和大规模鉴定新肽段谱图，两者几乎完全一致，以子离子相似性获得的cosin值高达0.96，由此证明从普洱茶工业发酵菌食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007鉴定到的新肽段是可信的。

2、根据新肽段所在的位置，以前一个终止密码子和后一个终止密码子包括的区域为界，得到六框翻译核酸序列(蛋白编码框)SEQ ID NO.2。SEQ ID NO.2序列对应的mRNA及其所编码的氨基酸序列如图3所示，并且该氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

3、为了进一步确定该编码基因(BS3F1522347基因)的编码起始位点和终止位点，将上述蛋白编码框向上游和下游分别扩展1000bp，采用GeneMark.hmm和Augustus进行基因预测，参考物种选用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，在LSASIAR肽段所处的蛋白编码框区域均没有预测到该蛋白编码基因的存在，这说明这个蛋白编码区不容易被当前的基因预测软件注释到。然而采用蛋白质基因组学手段，直接鉴定基因表达产物蛋白质的肽段，来系统揭示漏注释基因是一个切实可行的技术手段。

4、将BS3F1522347基因的蛋白编码框表达的蛋白序列(即SEQ ID NO.3)进行NCBI-BLASTP和KEGG-BLASTP分析，均未发现与该蛋白序列有明显相似的序列。

5、将该BS3F1522347基因的蛋白编码框序列(即SEQ ID NO.2)进行NCBI-BLASTN和KEGG-BLASTN分析，未发现同源序列。这进一步佐证了该基因的蛋白编码框序列可以用于开发普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的潜在的DNA条形码序列。

6、对食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007进行了基因组测序，SEQ ID NO.2位于其基因组序列中第3个Scaffold序列(5’-3’)的1522347-1522476的位置。为了得到长度更加合适并且具有足够特异性的DNA条形码，选择了SEQ ID NO.2上游1000bp到下游1000bp之间的区域(即1521347-1523476的位置，这个序列大于2000bp，如SEQ ID NO.4所示)。将SEQ IDNO.4序列进行NCBI-BLASTN分析，检索Nucleotide collection(nr/nt)数据库，作为结果，发现SEQ ID NO.4仅有约200bp与副球孢子菌(Paracoccidioides)lutzii Pb01假定蛋白部分mRNA(XM_015847037.1)有同源性(如图9所示)，将与SEQ ID NO.4序列具有同源性的序列比较结果汇总于下表1中。根据上述结果，可以认为SEQ ID NO.4可作为鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007的DNA条形码序列。此外，我们进一步对SEQ ID NO.4序列进行NCBI-BLASTN分析，检索Whole-genome shotgun contigs(wgs)数据库中食腺嘌呤节孢酵母(分类学ID：taxid:409370)的全基因组序列。结果发现，SEQ ID NO.4与食腺嘌呤节孢酵母LS3全基因序列Arad1A_contig_1(CBZY010000006.1)同一性为87％(见下表2)，序列覆盖度为99％，食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007SEQ ID NO.4与食腺嘌呤节孢酵母LS3基因组中的同源序列具有足够的区分度，可以作为DNA条形码序列。综上所述，SEQ ID NO.2上游1000bp到下游1000bp之间的序列(SEQ ID NO.4)可以作为鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码。

7、进一步地，基于SEQ ID NO.4，采用NCBI引物设计工具设计PCR引物，扩增产物须包括蛋白编码框(SEQ ID NO.2)序列。由此得到一系列适合鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码。其中一对正反引物序列分别为：

BS3F1522347-F：5‘-TTCGTCGGGGAGATAGGGTT-3’；

BS3F1522347-R：5’-TACAACAATGGCGGGACCTC-3’。

该对引物理论扩增长度为938bp，引物位置及扩增序列见图4所示，所扩增的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。从长度和特异性方面考虑，并且经过下面的验证，其为用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的最佳DNA条形码序列。

8、对SEQ ID NO.1序列进行NCBI-BLASTN分析发现，该DNA序列仅有一小部分序列具有3条同源性序列，如图5A所示。其中，同源性最高的巴西芽生菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)Pb18，该菌株的假定蛋白部分mRNA的100bp左右的序列同源性较高，但序列较短，不足条形码序列SEQ ID NO.1长度的12％，这表明在食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株中检测到的这个DNA条形码序列具有特异性。

表3DNA条形码序列SEQ ID NO.1的NCBI-BLASTN结果

9、目前，食腺嘌呤节孢酵母物种中，仅有食腺嘌呤节孢酵母LS3菌株的基因组已经被报道(Kunze et al.Biotechnology for Biofuels 2014,7:66)。经Local-BLASTN分析后，发现该基因序列SEQ ID NO.1在LS3菌株基因组中存在同源序列。经DNAMAN分析后，两条序列的一致性为87.65％，尽管TMCC 70007与LS3菌株为同一个物种(即食腺嘌呤节孢酵母，Blastobotrys adeninivorans)，但在该DNA条形码序列的938个碱基中，约有110个位点是不一样的，结果如图6所示。这进一步证明了利用该DNA条形码序列可以有效地区别TMCC70007菌株与种内的其他菌株。

实施例2.利用DNA条形码鉴别菌株

依据待测样品的扩增结果和与食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株SEQ ID NO.1的序列同源性，来判定待测样品是否为普洱茶工业应用菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007。

(1)菌株来源

表4选用的相关菌株信息

(2)分别提取菌株DNA：采用OMEGA E.Z.N.A.^TM的Yeast DNA试剂盒提取酵母基因组DNA，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.5μg/μL。

(3)扩增DNA片段，进行聚合酶链式(PCR)反应，所用引物序列分别为：

BS3F1522347-F：5‘-TTCGTCGGGGAGATAGGGTT-3’；

BS3F1522347-R：5’-TACAACAATGGCGGGACCTC-3’。

PCR反应体系为50μL，PCR试剂为Thermo Scientific^TM的Taq DNA Polymerase(重组)：ddH₂O 37.7μL、MgCl₂ 5μL，dNTPs 4μL，正向引物1μL，反向引物1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL、DNA模板1μL，不含染料。扩增程序为：94℃预变性8分钟；接下来94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分15秒，一共进行32-35个循环；最后72℃延伸10分钟。

(4)扩增产物检测：用1.0％的琼脂糖凝胶、1×TBE电泳液电泳检测，使用DNAmarker检测PCR片段大小。若待测菌株没有扩增条带，说明该菌株不是食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007；若出现明显清晰的条带，且无杂带，送生物测序公司进行DNA片段测序。

(5)该引物仅能在食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007中实现扩增，在同物种的食腺嘌呤节孢酵母、CBS 8244^T、CBS 7350、CBS 7370、CBS 8335和Blastobotrysraffinosifermentans CBS 6800^T中则不能实现扩增。结果如图7所示。该PCR引物的理论扩增序列为938bp，和预期相符。为了进一步验证扩增的DNA的序列，进行了测序和同源序列比较。

(6)对于有条带的序列的测序结果，首先用软件Chromas检查测序后得到的序列峰图质量，确定峰图质量达到数据分析的要求之后，用DNASTAR软件包中的SeqMan进行正反向序列的拼接。将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果待测菌株DNA片段与食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007标准基因序列的同源性在97％以上，即可判断所述的待测菌株可能为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株。例如，经过DNAMAN，将菌株TMCC 70007测序得到序列与DNA条形码序列SEQ ID NO.1比对后完全一致，进一步证明了这种方法的可靠性。结果如图8所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 勐海茶业有限责任公司

<120> DNA条形码、引物、试剂盒、方法和应用

<130> FI-164054-59:52/C

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 938

<212> DNA

<213> 食腺嘌呤节孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）

<400> 1

ttcgtcgggg agatagggtt agtgaagata gagaaactac agagttagct cgggagtggt 60

ccttggaagg cgaaggcatc atcggagtca aggacgacga gtttgtgttg gcatccaggt 120

ccaaagagtc gtcgtcgacc agaggcaccg ccgaagagat gagctctgcg tctgcgtttg 180

ccaacgactc tggcactggt agctggctgt tgcgagccag cgttcgatat tcggccactg 240

tctggagagc tctggacaac gccctctcga gatctcgaat gtgttttata gagctcatcc 300

tacggttggt gtcctttgtg aattggcact ttaggttgcg accaatgcac tcagagcacg 360

ccgacgactc agtggcatcg cactttacct ttcgctctct gcaagcatcg cacgaggggt 420

cttttcggcg ctggcggaac gttcgtcggt gaggagcttg caatgaagca tggcccatgt 480

tgggcgaagc atgaaactga gcctgagctt gtgcctgtgc ctgtgcctgg gcagcctgag 540

cttgcgcttg tgcctgagca tgtgcctgag cgtgagcttg agcgtgagct tgcgcttgtg 600

cctgtgcctg aaggtgtgct gcttgaacat tggccggtgc ctggctctgc ggaggagggg 660

tgacatgaat tggaggacct acaggcattc cattggctat accgggatga agtccgccat 720

tactaggctg ctgatacgac ccatggcctg ggtaatagta cgggtgctgg taagccaccg 780

cgggctgggg aacctgaacg gtcaaatggg acgcaccagc accaactggg ccagactcgg 840

gatgacccaa cgcaggcccg ctatgagggc taggtgctcc gtccgtcatt acatgaatag 900

gcgggagttc gctggccgga ggtcccgcca ttgttgta 938

<210> 2

<211> 135

<212> DNA

<213> 食腺嘌呤节孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）

<400> 2

taggttgcga ccaatgcact cagagcacgc cgacgactca gtggcatcgc actttacctt 60

tcgctctctg caagcatcgc acgaggggtc ttttcggcgc tggcggaacg ttcgtcggtg 120

aggagcttgc aatga 135

<210> 3

<211> 43

<212> PRT

<213> 食腺嘌呤节孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）

<400> 3

Val Ala Thr Asn Ala Leu Arg Ala Arg Arg Arg Leu Ser Gly Ile Ala

1 5 10 15

Leu Tyr Leu Ser Leu Ser Ala Ser Ile Ala Arg Gly Val Phe Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Glu Arg Ser Ser Val Arg Ser Leu Gln

35 40

<210> 4

<211> 2130

<212> DNA

<213> 食腺嘌呤节孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）

<400> 4

caaactcctg ggggatgttg tcgtccgagt cactgtcagt ccacagcaag agtgacgggg 60

tggaggatgc ctcaattgaa atcagtcggt caaacagatg catagcagtc cacagatggt 120

ggtattcggg aagaattgac agggcaaact ggtaggccca ttggagccac attgccgctg 180

ttgaagaacg agaggtctca aaatagtatg cggatatata gaggcagatg gtaacatggt 240

cgacagtcaa gtcgactccg tcggattcca gcacgttttt gatataccgc tgagcatggt 300

cacagaacac cttgccgtcg ccgaaactta catcagcaat gatattgttt cttgtggcca 360

gagaaatgat tgaaaacagc agagccctgt ctaaaggact atcgtgctgt gcagtggatt 420

tggcgcgaga tacaattgat gcccagtcgg tcaagggcca aagggactgg tatgtgattc 480

gaaagctttc gagcagtggc tccaagaggg accattctgg gagctccggg gggacgttgt 540

catcaacgtg aaaggctaca attgagtcaa tcttgtgttt tgagctttgc gcagcttcca 600

gtcgtttggt ggccgctcga cgtaggtcgg caaggtcaat gctgccattt gaggtcatgg 660

aaccgcttcg tcggggagat agggttagtg aagatagaga aactacagag ttagctcggg 720

agtggtcctt ggaaggcgaa ggcatcatcg gagtcaagga cgacgagttt gtgttggcat 780

ccaggtccaa agagtcgtcg tcgaccagag gcaccgccga agagatgagc tctgcgtctg 840

cgtttgccaa cgactctggc actggtagct ggctgttgcg agccagcgtt cgatattcgg 900

ccactgtctg gagagctctg gacaacgccc tctcgagatc tcgaatgtgt tttatagagc 960

tcatcctacg gttggtgtcc tttgtgaatt ggcactttag gttgcgacca atgcactcag 1020

agcacgccga cgactcagtg gcatcgcact ttacctttcg ctctctgcaa gcatcgcacg 1080

aggggtcttt tcggcgctgg cggaacgttc gtcggtgagg agcttgcaat gaagcatggc 1140

ccatgttggg cgaagcatga aactgagcct gagcttgtgc ctgtgcctgt gcctgggcag 1200

cctgagcttg cgcttgtgcc tgagcatgtg cctgagcgtg agcttgagcg tgagcttgcg 1260

cttgtgcctg tgcctgaagg tgtgctgctt gaacattggc cggtgcctgg ctctgcggag 1320

gaggggtgac atgaattgga ggacctacag gcattccatt ggctataccg ggatgaagtc 1380

cgccattact aggctgctga tacgacccat ggcctgggta atagtacggg tgctggtaag 1440

ccaccgcggg ctggggaacc tgaacggtca aatgggacgc accagcacca actgggccag 1500

actcgggatg acccaacgca ggcccgctat gagggctagg tgctccgtcc gtcattacat 1560

gaataggcgg gagttcgctg gccggaggtc ccgccattgt tgtagctaga gtgaaagtac 1620

taaaagtaca ggagacaaaa cccacaacct tgtttgtcga agaagaagaa aaaaaaacac 1680

actatgatta cttttttaca aagggttatg aatccggcat ttgaacgagg gctgtgtcgc 1740

aaacgtaccc gatattaggt aggacaagtg ccaatctggc aacctaagga ccaaatgcta 1800

aacaattggg gcaggaatta ggcaggaatt aggcaagacc aggtcaatat acgaaaagtg 1860

gacgccagtg gatgccagtg gatgcgtgct atgcctggta gtggccagct tgcaattgca 1920

gttgcttgcc ctggccagtt gccctctcgc cggcaagcat tatctgcgca cgcaaggggc 1980

acatcggagc ggcccgagct aagccactac tcctcggaac ctgccgcgta tcgttgcgta 2040

tgcgttgttc ctagaaagtg catattacgc ggacataaaa ccagacccca aacacccggt 2100

gcgcaagagc gcaggctcca ggcgtgtgtg 2130

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttcgtcgggg agatagggtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacaacaatg gcgggacctc 20

Claims (4)

1.一种用于扩增用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的DNA条形码的引物对，其正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物：5’-TTCGTCGGGGAGATAGGGTT-3’；

反向引物：5’-TACAACAATGGCGGGACCTC-3’；

其中，所述DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组，并且核苷酸序列选自如SEQ ID No.4所示的序列并且包含如SEQ ID No.1所示的序列。

2.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的试剂盒，包含根据权利要求1所述的引物对。

3.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的方法，包括以下步骤：

a)提供待测菌株的基因组DNA；

b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

c)电泳检测PCR产物，如果没有目标条带，则判定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007菌株，如果有目标条带，则进行步骤d)；

d)对所得PCR产物进行测序，得到待测核苷酸序列；将所述待测核苷酸序列与所述的DNA条形码的核苷酸序列进行同源性比对，若同源性在97％以上，则判定待测菌株是食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株。

4.根据权利要求1所述的引物对在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。

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