CN108118098B - 快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的dna条形码引物、dna条形码、试剂盒、方法和应用 - Google Patents

快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的dna条形码引物、dna条形码、试剂盒、方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物组合物、DNA条形码组合物、试剂盒、方法及应用。本发明的DNA条形码组合物，包括如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码、如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码、以及如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码，其中所述第一、第二和第三DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组。该DNA条形码能够快速鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，可以快速准确地将该菌株从易混淆的菌株或同物种内其他菌株中鉴定出来。

Description

快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形 码、试剂盒、方法和应用
技术领域
本发明属于物种和菌株鉴定领域，具体涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物组合物、DNA条形码组合物、试剂盒、方法及应用。
背景技术
普洱茶是一种具有云南地理标识的后发酵茶，其采用大叶种晒青毛茶作为原料，经过一系列工艺制作而成。普洱茶因具有减肥、降血糖血脂、预防和改善心血管疾病、抗衰老、抗癌、消炎、助消化以及养胃等保健功效也备受人们关注。最近几年，普洱茶越来越受欢迎，逐渐增加的市场需求拉动了普洱茶产业的发展，促进了云南地区的经济增长。
普洱茶是云南大叶种发酵茶，其发酵生产需要普洱茶发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母(Blastobotrys adeninivorans)TMCC 70007(以下也简称为“TMCC 70007”)在内的多种微生物的作用，其中该TMCC 70007是发酵过程中的关键菌。目前普洱茶发酵仍然是半自然人工渥堆的经验式发酵，虽然渥堆过程中以少数优势微生物为主的群落相对稳定，但产品的稳定性还存在较大的提升空间。生产过程中也不可避免的存在着一定的安全隐患，为了进一步获得消费者的青睐和市场的认可、突破外贸壁垒、提升普洱茶企业的市场竞争力，必须实现普洱茶生产工艺的人工可控化、清洁化以及高效化，并不断开发新产品、延伸产业链。要做到这些，就必须革新技术，发明一系列安全、清洁、高效、人工可控自动化的普洱茶新工艺，才能确保普洱茶产业的健康发展，给国家和人民带来长远利益。
随着普洱茶科研的进一步深入，越来越多的人们开始了人工接种发酵普洱茶的探索，目前已经有许多菌株应用于普洱茶人工可控发酵。近年由于市场需求加大，许多规模较小的厂家对普洱茶缺乏系统深入的研究，大肆滥用许多他人专利进行牟利，比如，按照一些接种发酵普洱茶的专利方法，采用一些菌种进行普洱茶发酵等一系列方法，进行普洱茶加工生产等经营活动，大大损害了一些具有相关专利的普洱茶生产企业的经济利益。
为确保普洱茶发酵微生物种质资源得到有效保护，防止滥用普洱茶发酵微生物的侵权行为发生，解决在普洱茶人工可控发酵过程中菌种侵权时难以举证的难题，开发对普洱茶发酵用菌株进行快速精准鉴别的方法势在必行，亟需建立其分子鉴定方法，开发通过DNA条形码技术快速鉴别与区分与其相似菌株的方法，以达到通过形态特征与分子数据分析相结合的方法来解决工业生产菌株鉴别和鉴定问题，为普洱茶有控工业发酵工艺开发和资源保护提供理论依据，促进普洱茶产业健康繁荣发展。
发明内容
为了克服形态学鉴定用于普洱茶发酵生产的食腺嘌呤节孢酵母菌株所存在的不足，以及基于ITS序列和18S rRNA序列难以区分种内不同菌株的缺陷，本发明提供了一组食腺嘌呤节孢酵母的DNA条形码，所述DNA条形码能够快速鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，可以快速准确地将该菌株从易混淆的菌株或同物种内其他菌株中鉴定出来。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
根据本发明的第一方面，提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码组合物，包括如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码、如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码、以及如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码，其中所述第一、第二和第三DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组。
根据本发明的第二方面，提供了用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的 DNA条形码引物组合物，包括以下三对引物对：
第一引物对：
正向引物DnaJ-F：5'-CAAAGGCTGAGAGCCGAGAT-3'，
反向引物DnaJ-R：5'-CCTCGGGCATCCGAAATCTT-3'；
第二引物对：
正向引物WD40-F：5'-TCTCAAACCTGTCATGGGGC-3'，
反向引物WD40-R：5'-TTCTTGATCGGCTTGGGGAC-3'；以及
第三引物对：
正向引物ARPC4-F：5'-GGGAACGTACAGGTTGCTCA-3'，
反向引物ARPC4-R：5'-CGCTTGTCCCGCACTTCTAA-3'；
其中，所述第一引物对为如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码的引物；所述第二引物对为如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码的引物；所述第三引物对为如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码的引物。
根据本发明的第三方面，提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的试剂盒，包含根据本发明的DNA条形码引物组合物。在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括根据本发明的DNA条形码组合物。
根据本发明的第四方面，提供了一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的方法，包括以下步骤：
a)提供待测菌株的基因组DNA；
b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求2 所述的第一、第二和第三引物对进行PCR扩增，如果未得到由所述三对引物分别扩增得到的PCR产物，则确定所述待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007；如果得到由所述第一、第二和第三引物对分别扩增得到的第一、第二和第三PCR产物，则进行以下步骤；
c)对所得PCR产物进行测序，得到所述PCR产物各自的DNA 序列，所述第一PCR产物的DNA序列为第一DNA序列，所述第二 PCR产物的DNA序列为第二DNA序列，所述第三PCR产物的DNA 序列为第三DNA序列；
d)将步骤c)得到的第一、第二和第三DNA序列按顺序依次进行拼接，得到待测序列；将权利要求1所述的第一、第二和第三DNA 条形码按顺序依次进行拼接，得到标准序列；将所述待测序列与所述标准序列进行序列同源性比对，如果序列同源性小于99％，则确定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007；如果序列同源性大于或等于99％，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007。
在本发明的方法中，优选还包括e)将所述待测序列与所述标准序列进行聚类分析，如果所述待测序列与所述标准序列聚类在一起，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007。
在本发明的方法中，优选地，由所述第一引物对扩增得到的第一 PCR产物的长度为816bp；由所述第二引物对扩增得到的第二PCR产物的长度为581bp；由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度为863bp。
在本发明的方法中，优选地，所述PCR扩增的程序为：1)94℃ -96℃预变性8分钟；2)94℃-96℃变性45秒，55℃-57℃退火45秒，72℃延伸1分15秒，其中该程序2)进行30-35个循环；3)72℃延伸 10分钟。在进一步优选的实施方案中所述PCR扩增的程序为：1)94 ℃预变性8分钟；2)95℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸1分 15秒，其中该程序2)进行32-35个循环；3)72℃延伸10分钟。
在本发明的方法中，优选地，所述聚类分析为构建系统发育树。
根据本发明的第五方面涉及根据本发明的DNA条形码组合物在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。
根据本发明的第六方面涉及根据本发明的DNA条形码引物组合物在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
1、发现并选择了最适合鉴别普洱茶工业发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007的3个DNA条形码片段作为DNA条形码组合，相比于其他DNA序列，这3个DNA序列具有通用、易扩增、易比对的特点。
2、基于以上发现，建立了普洱茶工业发酵生产菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的样品鉴别方法，相比于传统的形态学鉴定方法以及ITS和18S rRNA等序列鉴定方法，大大提高了鉴定精确度，克服了难以区分种内不同菌株的缺陷。该方法对于菌株的要求低，鉴别指标能够量化，这对于及时判定食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007提供了准确有效的方法，增加了鉴定的特异性和准确性，提供了普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的快速鉴别方法，解决了普洱茶人工可控发酵工艺中菌种和工艺专利侵权案件中举证困难等问题，确保了普洱茶发酵工艺专利权人的利益，确保普洱茶产业健康繁荣发展。
附图说明
图1是食腺嘌呤节孢酵母种的TMCC 70007、CBS 8244T、CBS 8335、CBS 7350、CBS7370和Blastobotrys raffinosifermentans种的 CBS 6800T的组合序列基于Kimura-2-parameter模型的遗传距离构建的NJ树。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明的一个实施方案涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码组合物，包括如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码、如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码、以及如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码，其中所述第一、第二和第三DNA条形码来源于食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的基因组。
DNA条形码技术(DNA barcoding)是指用基因组内一段标准的、短的DNA片段来鉴定物种的一项分子鉴定新技术，其可以快速、准确的进行物种鉴定。
本发明的另一个实施方案涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物组合物，包括以下三对引物对：
第一引物对：
正向引物DnaJ-F：5'-CAAAGGCTGAGAGCCGAGAT-3'(SEQ ID No.4)，
反向引物DnaJ-R：5'-CCTCGGGCATCCGAAATCTT-3'(SEQ ID No.5)；
第二引物对：
正向引物WD40-F：5'-TCTCAAACCTGTCATGGGGC-3'(SEQ ID No.6)，
反向引物WD40-R：5'-TTCTTGATCGGCTTGGGGAC-3'(SEQ ID No.7)；以及
第三引物对：
正向引物ARPC4-F：5'-GGGAACGTACAGGTTGCTCA-3'(SEQ ID No.8)，
反向引物ARPC4-R：5'-CGCTTGTCCCGCACTTCTAA-3'(SEQ ID No.9)；
其中，所述第一引物对为如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码的引物；所述第二引物对为如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码的引物；所述第三引物对为如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码的引物。
本发明的引物能实现对所述DNA条形码的特异性扩增。
本发明的还一实施方案涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的试剂盒，包含根据本发明的DNA条形码引物组合物。
在根据本发明的试剂盒中，三对DNA条形码引物优选放置于三个独立的包装内。
在进一步优选的实施方案中，所述试剂盒还包含根据本发明的 DNA条形码组合物。所述DNA条形码组合物优选存在于记录介质上。该记录介质例如为光盘。
本发明的又一实施方案涉及一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的方法，包括以下步骤：
a)提供待测菌株的基因组DNA；
b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求2 所述的第一、第二和第三引物对进行PCR扩增，如果未得到由所述三对引物分别扩增得到的PCR产物，则确定所述待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007；如果得到由所述第一、第二和第三引物对分别扩增得到的第一、第二和第三PCR产物，则进行以下步骤；
c)对所得PCR产物进行测序，得到所述PCR产物各自的DNA 序列，所述第一PCR产物的DNA序列为第一DNA序列，所述第二 PCR产物的DNA序列为第二DNA序列，所述第三PCR产物的DNA 序列为第三DNA序列；
d)将步骤c)得到的第一、第二和第三DNA序列按顺序依次进行拼接，得到待测序列；将本发明所述的第一、第二和第三DNA条形码按顺序依次进行拼接，得到标准序列；将所述待测序列与所述标准序列进行序列同源性比对，如果序列同源性小于99％，则确定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007；如果序列同源性大于或等于99％，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007。
根据本发明的实施方案，在所述聚合酶链式反应中，扩增条件优选为94℃预变性8分钟，接下来94℃变性45秒，56℃退火45秒，72 ℃延伸1分15秒，一共进行32-35个循环，最后72℃延伸10分钟。
在进一步的优选的实施方案中，所述方法还包括e)将所述待测序列与所述标准序列进行聚类分析，如果所述待测序列与所述标准序列聚类在一起，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007。所述聚类分析可以为构建系统发育树。
在本发明一个具体的实施方案中，利用本发明的三对引物对提取自待鉴别的菌株的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测。基于检测是否存在PCR产物来鉴别菌株：如果待鉴定的菌株没有扩增出相应的目标条带，则说明该菌株不是TMCC 70007；如果扩增出相应的目标条带，则证明该菌株可能是TMCC 70007。然后，为了进一步进行鉴别，对PCR产物进行测序，将测序得到的3个DNA序列串联组合后与TMCC 70007菌株的3个DNA 条形码序列的组合序列(标准序列)进行同源比对，获得序列间的相似性(即同源性)，若同源性大于或等于99％，即可判定该待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007。
在更优选的实施方案中，还可以将待测序列与标准序列进行聚类分析，例如系统发育树，基于聚类分析的系统发育树法设立鉴定规则来鉴别物种。
具体而言，将食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007标准序列和各待鉴定菌株的待测序列一起应用MEGA 5.1或PAUP软件构建NJ系统发育树，如果待鉴定菌株的待测序列与食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007的标准序列聚类在一起，则鉴定为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007，在此所使用的术语“聚类”是指经系统发育树分析后，待测菌株与TMCC 70007菌株处于同一个分支，且进化距离相同。
在上述方案中，在步骤b)中，由所述第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度为816bp；由所述第二引物对扩增得到的第二 PCR产物的长度为581bp；由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度为863bp。
本发明的其他实施方案涉及根据本发明所述的DNA条形码引物组合物在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用，以及根据本发明所述的DNA条形码组合物在鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株中的应用。
实施例
下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。实施例中所用方法在为具体说明的情况下，均为常规方法。
实施例1：基于用第一、第二、第三引物对扩增所得序列的同源性比对来判定待测菌株是否为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007
1、菌株来源：选用的相关菌株信息见下表1：
表1
Figure BDA0001159938950000091
在上表1中，TMCC 70007菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)保藏编号CGMCCNo.8683；CBS系菌株均购自CBS-KNAW 真菌生物多样性中心，荷兰。
2、分别提取菌株DNA：采用OMEGA E.Z.N.A.TM Yeast DNA Kit D3370-01试剂盒(由OMEGA制造)提取酵母基因组DNA，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.5μg/μL。
3、扩增DNA片段，分别采用以下3对引物对，对提取的各菌株DNA分别进行聚合酶链式(PCR)反应：
第一引物对，
正向引物，DnaJ-F：5’-CAAAGGCTGAGAGCCGAGAT-3’ (SEQ ID No.4)，
反向引物，DnaJ-R：5’-CCTCGGGCATCCGAAATCTT-3’(SEQ ID No.5)；
第二引物对，
正向引物，WD40-F：5’-TCTCAAACCTGTCATGGGGC-3’ (SEQ ID No.6)，
反向引物，WD40-R：5’-TTCTTGATCGGCTTGGGGAC-3’ (SEQ ID No.7)；
第三引物对，
正向引物，ARPC4-F：5’-GGGAACGTACAGGTTGCTCA-3’ (SEQ ID No.8)，
反向引物，ARPC4-R：5’-CGCTTGTCCCGCACTTCTAA-3’ (SEQ ID No.9)，
用三个引物对分别进行PCR，PCR反应体系均为50μL：ddH2O 37.7μL、MgCl2 5μL，dNTPs 4μL，正向引物1μL，反向引物1μL， Taq DNA聚合酶0.3μL，DNA模板1μL，不含染料。扩增程序：94 ℃预变性8min，接下来94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸 1min 15s，一共进行32-35个循环，最后延伸10min。
4、扩增产物检测，用1.0％的琼脂糖凝胶、1×TBE电泳液进行电泳检测，使用DNAMarker检测PCR片段大小。若待测菌株没有扩增出相应的目的条带，则说明该菌株不是TMCC 70007；若出现明显清晰的条带，且无杂带，则对该DNA片段进行测序，测序选项采用测通，由测序公司(华大基因)提供拼接结果，也可自行拼接。
5、首先用软件Chromas中检查测序后得到的序列峰图质量，确定峰图质量达到数据分析的要求之后，用DNASTAR软件包中的 SeqMan进行正反向序列的拼接。经测序发现，由第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度为816bp；由第二引物对扩增得到的第二 PCR产物的长度为581bp；由第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度为863bp，将第一、第二和第三PCR 产物的第一、第二和第三DNA 序列进行手工校对、按该顺序依次拼接，得到待测序列；对TMCC 70007的第一、第二和第三DNA条码按该顺序依次拼接。具体而言，采用DNAStar软件中的SeqMan，参见软件说明进行拼接，得到标准序列。将待测序列与标准序列进行序列比对，如果待测序列与TMCC 70007的标准序列同源性低于99％，即可判断待测菌株不为TMCC 70007菌株；如果同源性为99％以上，则可初步确定待测菌株为TMCC 70007菌株。例如，从表2中可以看出，其他菌株组合序列相似度低于99％，说明这些菌株不是TMCC 70007菌株。
表2样品组合序列与标准组合序列Blastn后相似度对比见下表。
Figure BDA0001159938950000111
实施例2：运用系统发育树法设立鉴定规则来鉴别物种
采用实施例1中所述步骤得到待测菌株的待测序列，将食腺嘌呤节孢酵母种的TMCC 70007、CBS 8244T、CBS 8335、CBS 7350 菌株和CBS 7370和Blastobotrysraffinosifermentans种的CBS 6800T菌株的待测序列合并应用MEGA 5.10基于Kimura-2-parameter模型构建Neighbor-joining系统发育树，方法为Bootstrap法，Bootstrap重复No.为1000。如果待测菌株的待测序列与TMCC 70007的标准序列聚类在一起(即为同一个分支，且进化距离相同)，则说明待测菌株为普洱茶发酵菌株TMCC 70007。
如图1所示，食腺嘌呤节孢酵母种的TMCC 70007、CBS 8244T、 CBS 8335、CBS 7350菌株和CBS 7370和Blastobotrys raffinosifermentans种的CBS 6800T菌株呈现出不同的分支，由此，可一进步对待测菌株是否为普洱茶发酵菌株TMCC 70007进行验证。
工业实用性
与传统的形态学鉴定方法和基于ITS和18S rRNA等序列鉴定相比，利用本发明的方法能够在种内区分和鉴别待测菌株是否为食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株。
SEQUENCE LISTING
<110> 勐海茶业有限责任公司
<120> 快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形码、试剂盒、方法和应用
<130> FI-163427-59:52/C
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 816
<212> DNA
<213> 食腺嘌呤节孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）
<400> 1
tacccctgct cagatggcag cggtaaacag agtgcgaaag tgcagggtaa ctgattatta 60
tgctattcta gatattgaat cgccttcatc agaggcggaa attcgcaaag cctatcgtaa 120
gttggcactg attatgcatc ccgacaagaa cggggcccct ggagcagacg aagcttttaa 180
gatggtgtca aaggcattcc aggttctgtc tgatagcgac aagaagagga tattcgatca 240
aacaggagcg gatcccgact ctagaggagg tggtggaggt atgggatcgt ttgctcgtgg 300
agcaggagga ccaggcatgc agtttggagg gggaggagat atttctcctg aagacctgtt 360
caacatgttc tttggtggcg gtggtggaag cccgttccag gcccagtttg ggggctttgg 420
tgggccaggc attagagtac acacatttgg cgggggctct ccgttttctg cgtttggtaa 480
cactgctggc gcccagcgca gacgggctgc tgctgctcaa caagaagact tttcactgcg 540
aaacttagtg caaatgctac cgcttctatt actattcgga ctgccttggc tgttatccct 600
gttcggggac tcgcctggtg caggggccgt accaagcttt cgattcaacc aaagaccccc 660
cttcatggag gagaggctca catcccggta cagcattccg tattttgtca atccccagga 720
tgtgcagaat ttggccgacc gaaagctggc tcaattggac cgccaggcag aagtatccta 780
catccagtct atgagacgtc agtgcaacac tgaagt 816
<210> 2
<211> 581
<212> DNA
<213> 食腺嘌呤节孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）
<400> 2
catggggcgc cgacagcgtg cactctgttc gattcaacca gaccgaaacc tccattgtcg 60
catcttcagg agccgatcgc tctattgtca tttacgatct tcgtacctcg tcacctgtac 120
aaaagctggt ggctaccatg tccaccaacg ccattgcctg gaacccaatg gaagcattca 180
actttgctgc cgctagcgaa gatcacaatg tctatcttta cgatatgcgt aagttaagcc 240
ggtccctcaa cgtttacaag gaccacgttg ccgccgttat ggatgtggac ttttccccca 300
ccggacaaga gctggtcact ggttcttacg accgatccat ccgccttttc cgggtccgcg 360
agggccactc cagggagatc taccacacca agcgtatgca aagggtgttt tgcgttaaat 420
tctccatgga ttcaaagtac acagtgtccg ggtccgatga cggtaacgtg cgtctctggc 480
gagccaatgc ttccgaacgc gcaggtgtta agtcagccaa gcagcgtgca aagcttgagt 540
atgatgcagc gcttaaggaa cggttcaagc acatgcccga g 581
<210> 3
<211> 863
<212> DNA
<213> 食腺嘌呤节孢酵母（Blastobotrys adeninivorans）
<400> 3
ctcaactgcc aatggttcat ggagtttttt aggtcaatta tagaataacc attatggagt 60
tttatttaat tataaaaacc gccacttttt tattgttgtt tccccgagaa atgcttcatt 120
tttcaacatg ataccccatt ctatagccgt tgaaatggac agggtgacgc tcagccacgc 180
ttcaccactc acaacatggt aggtagagac aagaggcact aaaggatagc tggggaaatg 240
gtgatactaa ctagtctcaa tcgctacgcc cgtatcttat ggcggtgcgc cagtcgttga 300
cggcggcact ttgcctggag aactttgctt ctcaggtggt ggaacgacac aataaccctg 360
aggtggagtc cagaaagacc cccgaagcgc tgctcaaccc actgactatt gctcgaaatg 420
aaaacgaaaa ggtgcttatc gagccttcta tcaactccgt gcgagtttct atcaagatca 480
agcaggccga tgagattgag accattctgg tgcatcagtt cacgcggttc ttgaccggac 540
gagccgagag cttttacatt ctacgacgaa agcctattga tgtgagttgg attggacatt 600
gggtgaatat gtgttgagag tactaactgt ttagggctat gatatttcgt ttttgatcac 660
aaactttcac actgagcaga tgctcaagca taagctagtg gactttatta ttgagtttat 720
ggaggaggtt gacaaggaga tttcggaaat gaagttgttc cttaacgctc gagctcgatt 780
cgtggccgag tcatatttga caccggtaag ttgattggtc tttgacgatt tccataccta 840
ggatgctaac ggatagtttg att 863
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caaaggctga gagccgagat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cctcgggcat ccgaaatctt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctcaaacct gtcatggggc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttcttgatcg gcttggggac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gggaacgtac aggttgctca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgcttgtccc gcacttctaa 20

Claims (7)

1.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的DNA条形码引物组合物，包括以下三对引物对：
第一引物对：
正向引物DnaJ-F：5'-CAAAGGCTGAGAGCCGAGAT-3'，
反向引物DnaJ-R：5'-CCTCGGGCATCCGAAATCTT-3'；
第二引物对：
正向引物WD40-F：5'-TCTCAAACCTGTCATGGGGC-3'，
反向引物WD40-R：5'-TTCTTGATCGGCTTGGGGAC-3'；以及
第三引物对：
正向引物ARPC4-F：5'-GGGAACGTACAGGTTGCTCA-3'，
反向引物ARPC4-R：5'-CGCTTGTCCCGCACTTCTAA-3'；
其中，所述第一引物对为如SEQ ID No.1所示的第一DNA条形码的引物；所述第二引物对为如SEQ ID No.2所示的第二DNA条形码的引物；所述第三引物对为如SEQ ID No.3所示的第三DNA条形码的引物。
2.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的试剂盒，包含根据权利要求1所述的DNA条形码引物组合物。
3.一种用于鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株的方法，包括以下步骤：
a)提供待测菌株的基因组DNA；
b)以步骤a)所述的基因组DNA为模板，利用根据权利要求1所述的第一、第二和第三引物对进行PCR扩增，如果未得到由所述三对引物分别扩增得到的PCR产物，则确定所述待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007；如果得到由所述第一、第二和第三引物对分别扩增得到的第一、第二和第三PCR产物，则进行以下步骤；
c)对所得PCR产物进行测序，得到所述PCR产物各自的DNA序列，所述第一PCR产物的DNA序列为第一DNA序列，所述第二PCR产物的DNA序列为第二DNA序列，所述第三PCR产物的DNA序列为第三DNA序列；
d)将步骤c)得到的第一、第二和第三DNA序列按顺序依次进行拼接，得到待测序列；将分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的第一、第二和第三DNA条形码按顺序依次进行拼接，得到标准序列；将所述待测序列与所述标准序列进行序列同源性比对，如果序列同源性小于99％，则确定待测菌株不是食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC70007；如果序列同源性大于或等于99％，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC70007。
4.根据权利要求3所述的方法，还包括e)将所述待测序列与所述标准序列进行聚类分析，所述聚类分析为构建系统发育树，如果所述待测序列与所述标准序列经系统发育树分析后，待测菌株与TMCC70007菌株处于同一个分支，且进化距离相同，则确定待测菌株为食腺嘌呤节孢酵母菌株TMCC 70007。
5.根据权利要求3所述的方法，其中由所述第一引物对扩增得到的第一PCR产物的长度为816bp；由所述第二引物对扩增得到的第二PCR产物的长度为581bp；由所述第三引物对扩增得到的第三PCR产物的长度为863bp。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述PCR扩增的程序为：1)94℃-96℃预变性8分钟；2)94℃-96℃变性45秒，55℃-57℃退火45秒，72℃延伸1分15秒，其中该程序2)进行30-35个循环；3)72℃延伸10分钟。
7.根据权利要求1所述的DNA条形码引物组合物在鉴别食腺嘌呤节孢酵母TMCC 70007菌株中的应用。
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The complete genome of Blastobotrys(Arxula) adeninivorans LS3 - a yeast of biotechnological interest;Gotthard Kunze et al.;《Biotechnology for biofuels》;20140424;第7卷(第66期);全文 *

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