CN107190099B

CN107190099B - 用于正毛化橘红种苗鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法

Info

Publication number: CN107190099B
Application number: CN201710630706.XA
Authority: CN
Inventors: 胡珊; 王永辉; 曾仑; 连林生; 周劲松; 邬龙怡
Original assignee: Guangzhou Baiyun Medical Adhesive Co ltd; Guangzhou City Xiangxue Yazhou Beverage Co ltd; GUANGZHOU XIANGXUE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Guangzhou Baiyun Medical Adhesive Co ltd; Guangzhou City Xiangxue Yazhou Beverage Co ltd; GUANGZHOU XIANGXUE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2017-07-28
Filing date: 2017-07-28
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2037-07-28
Also published as: CN107190099A

Abstract

本发明公开了一种用于正毛化橘红种苗鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法，包括：(1)得到待测种苗的基因组DNA为模板的步骤；(2)加入第一引物进行PCR反应，并分离所得PCR反应产物得到第一结果的步骤；(3)加入第二引物进行PCR反应，并分离所得PCR反应产物得到第二结果的步骤；(4)分析所述第一结果、所述第二结果得出鉴定结果的步骤。与现有技术相比，本发明方法快速、简便且准确性高，只需要少量样本即可实现，可以保障从基因水平选择种植品种，从源头上保证药材的质量。

Description

用于正毛化橘红种苗鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法

技术领域

本发明涉及属于生物技术领域，涉及药材种苗的品种鉴定，特别涉及用于正毛化橘红种苗鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法。

背景技术

ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。根据现代分子生物学研究，中药材(不含矿物药)的生物种质资源多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性可在DNA分子标记技术水平检测，比在形态、组织和细胞水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记。ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便。

化橘红为芸香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomentosa’或柚Citrus grandis(L)的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，气芳香，味苦、微辛，归肺、脾经，具有散寒、燥湿、利气、消痰等功效，用于风寒咳嗽，喉痒痰多，积食伤酒。化橘红为广东化州道地药材，根据其果实表面绒毛的有无、多少分为正毛化橘红、副毛化橘红和光果，品质以正毛化橘红最优、副毛化橘红次之、光果最差，随着需求增加、经济利益的驱使，农户在种植的时候，不分正毛、副毛和光果，凡是橘红都进行圈枝种植，鱼龙混杂，影响了化橘红的品质，影响了药品的疗效。正毛化橘红和非正毛化橘红的种苗在外观形态非常相似，运用传统方法很难准确区分。

常用的药用植物种源遗传分析、品种科学鉴定和以生物分子的多态性为基础的遗传标记，即DNA水平的分子标记，相对于传统形态标记具有巨大优势，在化橘红药材的研究和应用中，为解决品种混乱和品种优劣问题提供了一种新的手段，也为化橘红的引种和培育工作提供了技术支持。分子生物学的快速发展为正毛化橘红和非正毛化橘红的种苗区分提供了有效可靠的鉴定手段。

但是，现有正毛化橘红种苗的分子生物学方法主要有SNP、RAPD分子标记技术和DNA条形码技术。SNP虽然是新一代的分子标记技术，但其需要进行测序和比对，操作繁琐且目前在化橘红种质资源研究应用中处于初级研究阶段；RAPD分子标记技术需要采用多条引物进行扩增并且采用聚类分析的数据处理方式，耗时长且准确度欠佳；DNA条形码技术能鉴别不同物种(如化州柚和橙子)但无法鉴别物种内的品种。

发明内容

基于此，有必要针对现有鉴定方法耗时长、操作繁琐、准确度欠佳等问题，提供一种快速、简便且准确性高，只需要少量样本即可实现的正毛化橘红种苗鉴定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及用于正毛化橘红种苗鉴定的PCR引物，包括第一引物、第二引物；其中：所述第一引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二引物的碱基序列如SEQID No.2所示。

第二方面，本发明涉及用于正毛化橘红种苗鉴定的PCR试剂盒，包括所述的第一引物、第二引物。

在其中一些实施例中，所述第一引物、所述第二引物的使用浓度为0.2-0.5μM。

在其中一些实施例中，所述PCR试剂盒还包括DNA聚合酶、镁离子、dNTPs。

在其中一些实施例中，所述DNA聚合酶的使用浓度为1.0-2.0U/25μL。

在其中一些实施例中，所述镁离子的使用浓度为1.5-2.5mM。

在其中一些实施例中，所述dNTPs的使用浓度为180-270μM。

第三方面，本发明提供一种正毛化橘红种苗鉴定方法，包括：

(1)得到待测种苗的基因组DNA为模板的步骤；

(2)加入权利要求1所述的第一引物进行PCR反应，并分离所得PCR反应产物得到第一结果的步骤；

(3)加入权利要求1所述的第二引物进行PCR反应，并分离所得PCR反应产物得到第二结果的步骤；

(4)分析所述第一结果、所述第二结果得出鉴定结果的步骤。

在其中一些实施例中，所述分析所述第一结果、所述第二结果得出鉴定结果的步骤包括：

对比所述第一结果、所述第二结果，如果第一结果不存在300-500bp的条带而第二结果存在300-500bp的条带，则待测种苗种即为正毛化橘红种苗，否则待测种苗种为非正毛化橘红种苗。

在其中一些实施例中，所述PCR反应时所用模板的浓度为30-80ng/25μL；所述PCR反应的程序为：95℃、5min；95℃、45s，51-58℃、45s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明在ISSR分子标记技术的基础上，针对正毛化橘红种苗，筛选得到两条引物，用其对不同品种的化橘红种苗样本进行PCR扩增，建立了用特征条带组合的方法来鉴定正毛化橘红的技术体系，该技术方法快速、简便且准确性高，只需要少量样本即可实现，可以保障从基因水平选择种植品种，从源头上保证药材的质量。

进一步地，本发明经过大量实验对PCR反应物质浓度、反应条件进行优选，使得本方法稳定、重复性好。

附图说明

图1为实施例3以待测种苗的基因组DNA为模板、以第一引物进行PCR反应并分离所得反应产物得到的第一结果示意图；

图2为实施例3以待测种苗的基因组DNA为模板、以第二引物进行PCR反应并分离所得反应产物得到的第二结果示意图；

图3为对比例1以待测种苗的基因组DNA为模板、以第二引物(引物浓度为0.1μmol/L)进行PCR反应并分离所得反应产物得到的对比结果示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明用于正毛化橘红品种鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法作进一步详细的说明。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1、用于正毛化橘红种苗鉴定的PCR引物

本实施例基于在ISSR分子标记技术的基础上，针对正毛化橘红种苗，筛选得到第一引物、第二引物，所述第一引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2、用于正毛化橘红种苗鉴定的PCR试剂盒

本实施例首先提供一种试剂盒，该试剂盒包括实施例1所述的碱基序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2所示的PCR引物。

在其它实施例中，所述PCR试剂盒还包括DNA聚合酶、镁离子、dNTPs。

在其它实施例中，所述DNA聚合酶的使用浓度为1.0-2.0U/25μL。

在其它实施例中，所述镁离子的使用浓度为1.5-2.5mM。

在其它实施例中，所述dNTPs的使用浓度为180-270μM。

实施例3、一种正毛化橘红种苗鉴定方法

本实施例提供一种正毛化橘红种苗鉴定方法，包括如下步骤：

1.实验仪器、试剂和材料

仪器：核酸蛋白测定仪(Implen Nanophotometer)、PCR扩增仪(BIO-RAD)、高速离心机(Eppendorf 5418)、超低温冰箱(Thermo 902-ULTS)、电泳仪、电泳槽(BIO-RAD)、凝胶成像系统(Bio-Rad)；

试剂：Taq DNA聚合酶(Promega，5U/μL)、dNTP(Promega，10mM)、DNA marker(广州东盛生物科技有限公司)、10×Loading Buffer(Takara)、琼脂糖(Biowest)、Golden View(北京博凌科为生物科技有限公司)；

实验材料：在化州橘红种植基地天鹅岭、卜儿岭、平定镇随机选择化橘红种苗共24株。采集其叶片并做好其编号信息记录，具体情况见下表。

表1化橘红种苗采样情况表

2.实验方法及结果判读

(1)得到待测种苗的基因组DNA为模板的步骤；

称取0.2g化橘红种苗嫩叶置于预冷的研钵中，加入液氮研磨成细粉，迅速转移至2mL离心管中；加入65℃预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液800μL，65℃水浴30min；冷却至室温，加入800μL的氯仿：异戊醇(体积比24:1)混合溶液并充分混匀，12000rpm离心15min；取上清至一个1.5mL离心管中，加入50μL NaAc(醋酸钠，浓度3mol/L)，1mL无水乙醇，充分混匀，12000rpm离心5min，弃上清；加入1mL 70％乙醇溶液洗涤DNA沉淀，并将DNA沉淀于室温晾干，晾干后加入100μL TE缓冲液充分溶解，于-20℃保存备用，用1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测基因组DNA的质量和浓度。

(2)加入第一引物进行PCR反应，并分离所得PCR反应产物得到第一结果的步骤；包括：

以待测种苗的基因组DNA为模板、以如SEQ ID No.1所示的碱基序列为引物进行PCR反应，所得反应产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，得第一结果；

聚合酶链式反应体积为25μL：

反应程序：95℃、5min；95℃、45s，51-58℃、45s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min；

用琼脂糖凝胶电泳分别对聚合酶链式反应产物进行电泳分离：用1×TAE缓冲液配置1％琼脂糖200mL，摇匀溶化，用微波炉煮沸至澄清透明。在热胶中加入Golden View 8.3μL摇匀，待自然冷却至50℃左右，灌胶于插好样品梳的电泳槽中制板。凝胶完全凝固后，小心取出梳子。将凝胶放入电泳槽内，加样孔一侧靠负极，加入适量的TAE工作缓冲液，使其液面恰好没过胶面约1mm深。用移液器将10×loading buffer混合的样品DNA和分子量标准(Marker)从点样孔分别垂直加入点样孔中。加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，电泳电压180V，电泳0.5h后至指示剂溴酚蓝距底端约2cm时取出凝胶板，在凝胶分析系统上进行分析，照相存盘。所得第一结果见图1。

(3)加入所述的第二引物进行PCR反应，并分离所得PCR反应产物得到第二结果的步骤，包括：

以待测种苗的基因组DNA为模板、以SEQ ID No.2所示的碱基序列为引物进行PCR反应，所得反应产物采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，得第二结果；

聚合酶链式反应体积为25μL：

反应程序：95℃、5min；95℃、45s，51-58℃、45s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。

用琼脂糖凝胶电泳分别对聚合酶链式反应产物进行电泳分离：用1×TAE缓冲液配置1％琼脂糖200mL，摇匀溶化，用微波炉煮沸至澄清透明。在热胶中加入Golden View 8.3μL摇匀，待自然冷却至50℃左右，灌胶于插好样品梳的电泳槽中制板。凝胶完全凝固后，小心取出梳子。将凝胶放入电泳槽内，加样孔一侧靠负极，加入适量的TAE工作缓冲液，使其液面恰好没过胶面约1mm深。用移液器将10×loading buffer混合的样品DNA和分子量标准(Marker)从点样孔分别垂直加入点样孔中。加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，电泳电压180V，电泳0.5h后至指示剂溴酚蓝距底端约2cm时取出凝胶板，在凝胶分析系统上进行分析，照相存盘。所得第二结果见图2。

经过反复实验证明，上述PCR步骤在DNA模板浓度为30-80ng/25μL的范围内均可实现技术效果。

(4)分析所述第一结果、所述第二结果得出鉴定结果的步骤，包括：

图1所示的第一结果没有分子量在300-500bp的条带，图2所示的第二结果存在分子量在300-500bp的条带，则判断待测种苗为正毛化橘红。

由图1和图2可知，待测种苗样品SN2-SN4、SN13、SN18、S19、SN22基因组DNA用碱基序列如SEQ ID No.1所示的第一引物扩增，扩增产物没有分子量在300-500bp的条带，用碱基序列如SEQ ID No.2所示的第二引物扩增，有分子量在300-500bp的条带，因此可鉴别出样品SN2-SN4、SN13、SN18、S19、SN22为正毛化橘红，其他样品为非正毛化橘红。

从上述结果来看，采用本发明的方法可以简单、快捷、准确的鉴定正毛化橘红，解决化橘红种苗从外观难以鉴别品种的难题，为化橘红优质品种的种植提供重要的品种选育技术支持。

发明人在进行实施例3的过程中发现，当PCR反应条件满足如下要求时，测试结果的重复性更佳：DNA聚合酶的浓度为1.0-2.0U/25μL；镁离子的浓度为1.5-2.5mM；dNTPs的浓度为180-270μM；反应程序为：95℃、5min；95℃、45s，51-58℃、45s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。

本发明实施例采用的引物是针对正毛化橘红、从众多ISSR随机引物中挑选出来的，经大量试验验证，本发明的技术方案对正毛化橘红种苗的鉴定是有效的、稳定的，而不适用于其他的化橘红(如副毛化橘红、光青化橘红)。

对比例1

本对比例是实施例3的对比例，对比之处仅在于：

步骤(2)中，第一引物的使用浓度为0.1μmol/L；

步骤(3)中，第二引物的使用浓度为0.1μmol/L。

电泳结果是均无条带，如图3所示。

发明人经过大量试验对第一引物、第二引物的使用浓度进行了筛选，结果发现，在引物浓度低于0.2μM或者高于0.5μM的条件下，所获第一结果、第二结果均为无条带，无法进行比对分析从而得出种苗鉴定结果。因此，最终确定其使用浓度为0.2-0.5μM。

对比例2

本对比例是实施例3的对比例，对比之处仅在于采用的引物包括：碱基序列如SEQID No.3所述的第三引物、碱基序列如SEQ ID No.4所示的第四引物、碱基序列如SEQ IDNo.5所示的第五引物。

具体为：以待测种苗的基因组DNA为模板、分别以所述第三引物、第四引物、第五引物进行PCR反应并分离所得反应产物，结果是三个结果条带无多态性，即所有样品的电泳条带无区别。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市香雪制药股份有限公司，广州白云医用胶有限公司，广州市香雪亚洲饮料有限公司

<120> 用于正毛化橘红种苗鉴定的引物、试剂盒及鉴定方法

<130> AGP17114202GZ

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 1

cacacacaca cacacag 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 2

acacacacac acacacg 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 3

tatatatata tatatac 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 4

ctctctctct ctctctg 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Artificial sequence

<400> 5

gtgtgtgtgt gtgtgtc 17

Claims

1.用于正毛化橘红种苗鉴定的PCR引物，其特征在于，包括第一引物、第二引物；其中：所述第一引物的碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述第二引物的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

2.用于正毛化橘红种苗鉴定的PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的第一引物、第二引物。

3.根据权利要求2所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述第一引物、所述第二引物的使用浓度为0.2-0.5μM。

4.根据权利要求2或3所述的PCR试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、镁离子、dNTPs。

5.根据权利要求4所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶的使用浓度为1.0-2.0U/25μL。

6.根据权利要求4所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述镁离子的使用浓度为1.5-2.5mM。

7.根据权利要求4所述的PCR试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的使用浓度为180-270μM。

8.一种正毛化橘红种苗鉴定方法，其特征在于，包括：

(1)得到待测种苗的基因组DNA为模板的步骤；

(4)分析所述第一结果、所述第二结果得出鉴定结果的步骤。

9.根据权利要求8所述的正毛化橘红种苗鉴定方法，其特征在于，所述分析所述第一结果、所述第二结果得出鉴定结果的步骤包括：

10.根据权利要求8或9所述的鉴定方法，其特征在于，所述PCR反应时所用模板的浓度为30-80ng/25μL；所述PCR反应的程序为：95℃、5min；95℃、45s，51-58℃、45s，72℃、90s，35个循环；72℃、10min。