CN108823293A - 一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种检测‘丰华21’西瓜种子真伪和纯度的方法，该方法包括如下步骤：(1)筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物；(2)制备‘丰华21’的SSR指纹图谱；(3)将待检测西瓜种子的SSR扩增带型与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对，如比对结果一致，则可以判定为真实的‘丰华21’西瓜杂交种。本发明的优点在于不受外界环境影响，在室内即可完成检测，对于亲缘关系较近的西瓜杂种也可区分出来，是一种准确、可靠、快速、方便、经济的检测‘丰华21’西瓜种子真伪和纯度的方法。

Description

一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体为一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法。
背景技术
西瓜是一年生蔓性草本植物，目前在全世界各地均有种植。西瓜富含葡萄糖、果糖、苹果酸、氨基酸、番茄红素、类胡萝卜素及多种维生素和矿物质，而脂肪酸和胆固醇含量极低，既营养又保健，深受消费者喜爱。根据农业部最新统计，2016年我国西瓜的栽培面积约为2836万亩，总产量为7940万吨，居世界第一位，初步估计其年种子流通量在280万公斤左右。种子真实性和纯度检验是种子生产工作中不可缺少的重要步骤，是保证良种遗传性充分发挥，促进农业生产持续稳定、高产的有效措施；是防止良种混杂退化，提高种子质量和产品品质的必要手段。
西瓜杂交种制种过程中，由于隔离条件不严格或人工去雄不及时、不彻底等原因导致杂交一代种子不纯，从而影响杂交种的纯度。目前，西瓜杂交种真实性和纯度鉴定的传统方法是根据品种的形态性状进行鉴定，但这一方法存在易受环境影响、周期较长、费工占地的缺陷。近年来，国内外学者利用同工酶和蛋白质电泳图谱鉴定技术对西瓜杂交种进行了研究，但由于同工酶位点及蛋白质种类有限，对于亲缘关系较近的西瓜杂交种难以区分。
发明内容
为了解决现有技术中西瓜种子纯度检测多依赖于田间表型观察，存在易受环境影响、周期较长、费工占地、以及对于亲缘关系较近的西瓜杂交种难以区分的缺陷，本发明提供了一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，实现的目的为，建立一种准确、可靠、快速、方便、经济的检测‘丰华21’西瓜种子真伪和纯度的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明提供的一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)根据已公布的西瓜基因组序列信息设计SSR引物，在所设计出的SSR引物中筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物；
(2)利用步骤(1)最终筛选出来的SSR引物制备‘丰华21’SSR指纹图谱；
(3)对待检测的西瓜种子进行播种，CTAB法提取子叶期叶片的基因组DNA，利用步骤(1)中最终筛选出的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得待检测种子的SSR扩增带型，通过与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对，如比对结果一致，则可以判定为真实的‘丰华21’西瓜杂交种。
进一步的，所述步骤(3)中还包括种子纯度的计算，将待测西瓜种子与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对后，采用如下公式计算得到种子纯度，
种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％……公式(一)。
本发明采用的分子标记方法来进行检测西瓜种子真实性和纯度的方法，DNA指纹图谱技术为品种真实性和纯度鉴定提供了准确、可靠、快速、方便的方法。DNA指纹图谱技术的优越性表现为：(1)分子标记数量大、多态性高，可鉴定表型难以鉴别的品种；(2)不受环境因素影响，可在生长发育的任何阶段鉴定；(3)样品DNA可长期保存，可用于追溯性鉴定；(4)利用DNA分子标记鉴定品种真伪，不仅准确可靠，而且便于实现自动化。分子标记是绘制品种指纹图谱的有力工具，相对于AFLP、RAPD和SRAP等分子标记，SSR分子标记具有数量丰富、多态性高、操作简便、重复性高和共显性等优点。
‘丰华21’是以‘S4336’为母本，‘S4331’为父本选育成的抗病优质杂交一代西瓜新品种，2015年5月通过浙江省农作物品种审定委员会审定。采用本发明方法检测‘丰华21’西瓜种子的真实性和纯度，为西瓜品种的良种生产和安全使用提供保障，为品种的规范管理和产权保护奠定基础。
进一步的，所述步骤(1)中筛选出在父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物的方法为：
a、‘丰华21’西瓜杂交种及父、母本叶片基因组DNA的提取：
①在2.0ml离心管中加入玻璃珠，取100mg子叶期的西瓜叶片置于离心管中，在打样机上磨碎；
②向离心管中加入800μL 65℃预热的2％CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；
③加入800μL的氯仿抽提液，所述氯仿抽提液由氯仿、异戊醇按照体积比为24：1混合组成，轻轻混匀5min，然后在12000r·min-1离心5min；
④吸取500μL上清液，转移至新的2.0mL离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，然后将离心管置于4℃冰箱中，至DNA沉淀析出；
⑤弃上清，用75％乙醇清洗DNA，弃上清后于室温晾干；
⑥向每个离心管中加入100μL ddH2O，100μL ddH2O中含1μLRNase，用涡旋仪振荡溶解DNA，然后37℃水浴1h，消化其中残存的RNA；
⑦用核酸仪测量DNA的浓度和质量，将DNA稀释至50ng·μL-1，置于-20℃冰箱保存备用；
b、‘丰华21’及亲本PCR扩增：
利用步骤(1)中设计出的SSR引物对‘丰华21’杂交种及其父母本的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH2010.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；
c、将PCR反应产物使用体积浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物：
①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；
②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；
③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400ml 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；
④点样：在15μLPCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；
⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；
⑥电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：
固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；
银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；
水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；
显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5g NaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；
再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析；
⑦对在‘丰华21’杂交种及父、母本中呈现多态性的SSR引物进行记录和再次筛选确认，最终获得在父母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物。
进一步的，所述步骤(2)中制备‘丰华21’SSR指纹图谱的方法为：采用CTAB法分别提取1株‘丰华21’杂交种，1株父本和1株母本的基因组DNA；利用步骤(1)中最终筛选出来的SSR引物分别扩增上述DNA，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taqbuffer 1.5μL，ddH2010.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；然后将PCR反应产物再采用聚丙烯酰胺凝胶电泳程序，在胶片观察灯下拍照，得到‘丰华21’SSR指纹图谱。
进一步的，所述步骤(2)制备‘丰华21’SSR指纹图谱的方法中凝胶电泳程序的方法为：
①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；
②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；
③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400mL 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；
④点样：在15μLPCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；
⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；
⑥银染显色：电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：
固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；
银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；
水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；
显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5g NaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；
再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析，即得到‘丰华21’SSR指纹图谱。
采用上述方法能够准确、快速地获得‘丰华21’SSR指纹图谱。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果，相较于现有技术根据品种的形态形状、利用同工酶和蛋白质电泳图谱检测西瓜种子真实性，本发明不受外界环境影响，在室内即可完成检测，是一种准确、可靠、快速、方便、经济的检测‘丰华21’西瓜种子真伪和纯度的方法。
附图说明
图1为根据BVWS01377引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱，其中，M为marker；P1为父本；P2为母本；F1为杂交种；
图2为根据BVWS01701引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱，其中，M为marker；P1为父本；P2为母本；F1为杂交种；
图3为实施例二中利用BVWS01377引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱检测种子真实性，其中，M为marker；P1为父本；P2为母本；F1为杂交种；1-10为待测种子；
图4为实施例二中利用BVWS01701引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱检测种子真实性，其中，M为marker；P1为父本；P2为母本；F1为杂交种；1-10为待测种子；
图5为实施例三中利用BVWS01377引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱检测种子纯度，其中，M为marker；P1为父本；P2为母本；F1为杂交种；1-40为待测种子；
图6为实施例三中利用BVWS01701引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱检测种子纯度，其中，M为marker；P1为父本；P2为母本；F1为杂交种；1-40为待测种子。
具体实施方式
实施例一：本发明提供的一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)根据已公布的西瓜基因组序列信息设计SSR引物，在所设计出的SSR引物中筛选出在‘丰华21’父母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物；
(2)利用步骤(1)最终筛选出来的SSR引物制备‘丰华21’SSR指纹图谱；
(3)对待检测的西瓜种子进行播种，CTAB法提取子叶期叶片的基因组DNA，利用步骤(1)中最终筛选出的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得待检测种子的SSR扩增带型，通过与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对，如比对结果一致，则可以判定为真实的‘丰华21’杂交种。
所述步骤(3)中还包括种子纯度的计算，将待测西瓜种子与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对后，采用如下公式计算得到种子纯度，
种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％……公式(一)。
所述西瓜品种为‘丰华21’，实际上设计出的引物有很多对，通过分析‘丰华21’杂交种及其父母本在聚丙烯凝胶上的位置，最终获得位于Chr7的2对具有多态性、稳定性好且极易识别的SSR引物，它们的正、反向引物基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4所示。在计算种子纯度时，例如检测40粒种子，根据上述方法将待测种子的SSR指纹图谱与步骤(2)制备出的西瓜SSR指纹图谱进行比对，比对结果一致的有32粒种子，则种子的纯度＝(32/40)×100％,即80％。
本发明采用的分子标记方法来进行检测西瓜种子真实性和纯度的方法，相较于现有技术根据品种的形态形状检测西瓜种子的真实性，更为准确和不受环境干扰；相较于现有技术中利用同工酶和蛋白质电泳图谱检测西瓜种子的真实性，更为准确、快速、可靠。
本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
实施例二：本发明提供的一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)根据已公布的西瓜基因组序列信息设计SSR引物，在所设计出的SSR引物中筛选出在‘丰华21’父母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物；
(2)利用步骤(1)最终筛选出来的SSR引物制备‘丰华21’SSR指纹图谱；
(3)对待检测的西瓜种子进行播种，CTAB法提取子叶期叶片的基因组DNA，利用步骤(1)中最终筛选出的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得待检测种子的SSR扩增带型，通过与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对，如比对结果一致，则可以判定为真实的‘丰华21’杂交种。
所述步骤(3)中还包括种子纯度的计算，将待测西瓜种子与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对后，采用如下公式计算得到种子纯度，
种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％……公式(一)。
实际上设计出的引物有很多对，所述步骤(1)中筛选出在父母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物的方法为：
a、‘丰华21’西瓜杂交种及父、母本叶片基因组DNA的提取：
①在2.0ml离心管中加入玻璃珠，取100mg子叶期的西瓜叶片置于离心管中，在打样机上磨碎；
②向离心管中加入800μL 65℃预热的2％CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；
③加入800μL的氯仿抽提液，所述氯仿抽提液由氯仿、异戊醇按照体积比为24：1混合组成，轻轻混匀5min，然后在12000r·min-1离心5min；
④吸取500μL上清液，转移至新的2.0mL离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，然后将离心管置于4℃冰箱中，至DNA沉淀析出；
⑤弃上清，用75％乙醇清洗DNA，弃上清后于室温晾干；
⑥向每个离心管中加入100μL ddH2O，100μL ddH2O中含1μLRNase，用涡旋仪振荡溶解DNA，然后37℃水浴1h，消化其中残存的RNA；
⑦用核酸仪测量DNA的浓度和质量，将DNA稀释至50ng·μL-1，置于-20℃冰箱保存备用；
b、‘丰华21’及亲本PCR扩增：
利用步骤(1)中设计出的SSR引物对‘丰华21’杂交种及其父母本的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH2010.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；
c、将PCR反应产物使用体积浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物：
①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；
②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；
③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400mL 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；
④点样：在15μLPCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；
⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；
⑥银染显色：电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：
固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；
银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；
水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；
显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5g NaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；
再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析。
⑦对在‘丰华21’杂交种及父、母本中呈现多态性的SSR引物进行记录和再次筛选确认，通过分析‘丰华21’杂交种及父、母本在聚丙烯凝胶上的位置，最终获得位于Chr7的2对具有多态性、稳定性好且极易识别的SSR引物，分别记为BVWS01377和BVWS01701，BVWS01377和BVWS01701正、反向引物的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示。
所述步骤(2)中制备‘丰华21’SSR指纹图谱的方法为：采用CTAB法分别提取1株‘丰华21’杂交种，1株父本和1株母本的基因组DNA；利用步骤(1)中最终筛选出来的SSR引物分别扩增上述DNA，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH20 10.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；然后将PCR反应产物再采用聚丙烯酰胺凝胶电泳程序，在胶片观察灯下拍照，得到‘丰华21’SSR指纹图谱。如图1所示为根据BVWS01377引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱，如图2所示为根据BVWS01701引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱。
采用上述方法对10粒待测种子进行真实性检测，如图3、图4所示，图3为待测种子与利用BVWS01377引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱比对结果，图4为待测种子与利用BVWS01701引物制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱比对结果，根据比对结果可知，1-5种子为‘丰华21’杂交种，6-10为其余品种。
由此可见，采用本发明方法检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度，在室内即可完成、准确、快速、结果可靠。本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
实施例三：本发明提供的一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，包括如下步骤：
(1)根据已公布的西瓜基因组序列信息设计SSR引物，在所设计出的SSR引物中筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物；
(2)利用步骤(1)最终筛选出来的SSR引物制备‘丰华21’SSR指纹图谱；
(3)对待检测的西瓜种子进行播种，CTAB法提取子叶期叶片的基因组DNA，利用步骤(1)中最终筛选出的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得待检测种子的SSR扩增带型，通过与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对，如比对结果一致，则可以判定为真实的西瓜杂交种。
所述步骤(3)中还包括种子纯度的计算，将待测西瓜种子与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对后，采用如下公式计算得到种子纯度，
种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％……公式(一)。
实际上设计出的引物有很多对，所述步骤(1)中筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物的方法为：
a、‘丰华21’西瓜杂交种及父、母本叶片基因组DNA的提取：
①在2.0ml离心管中加入玻璃珠，取100mg子叶期的西瓜叶片置于离心管中，在打样机上磨碎；
②向离心管中加入800μL 65℃预热的2％CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；
③加入800μL的氯仿抽提液，所述氯仿抽提液由氯仿、异戊醇按照体积比为24：1混合组成，轻轻混匀5min，然后在12000r·min-1离心5min；
④吸取500μL上清液，转移至新的2.0mL离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，然后将离心管置于4℃冰箱中，至DNA沉淀析出；
⑤弃上清，用75％乙醇清洗DNA，弃上清后于室温晾干；
⑥向每个离心管中加入100μL ddH2O，100μL ddH2O中含1μL RNase，用涡旋仪振荡溶解DNA，然后37℃水浴1h，消化其中残存的RNA；
⑦用核酸仪测量DNA的浓度和质量，将DNA稀释至50ng·μL-1，置于-20℃冰箱保存备用；
b、‘丰华21’及亲本PCR扩增：
利用步骤(1)中设计出的SSR引物对‘丰华21’杂交种及其父母本的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH2010.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；
c、将PCR反应产物使用体积浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物：
①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；
②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；
③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400mL 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；
④点样：在15μLPCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；
⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；
⑥银染显色:电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：
固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；
银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；
水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；
显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5g NaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；
再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析。
⑦对在‘丰华21’杂交种及父、母本中呈现多态性的SSR引物进行记录和再次筛选确认，通过分析‘丰华21’杂交种及父、母本在聚丙烯凝胶上的位置，最终获得位于Chr7的2对具有多态性、稳定性好且极易识别的SSR引物，分别记为BVWS01377和BVWS01701，BVWS01377和BVWS01701正、反向引物的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示。
所述步骤(2)中制备‘丰华21’SSR指纹图谱的方法为：采用CTAB法分别提取1株‘丰华21’杂交种，1株父本和1株母本的基因组DNA；利用步骤(1)中最终筛选出来的SSR引物分别扩增上述DNA，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH2010.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；然后将PCR反应产物再采用聚丙烯酰胺凝胶电泳程序，在胶片观察灯下拍照，得到‘丰华21’SSR指纹图谱。
所述步骤(2)制备‘丰华21’SSR指纹图谱的方法中凝胶电泳程序的方法为：
①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；
②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；
③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400mL 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；
④点样：在15μL PCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；
⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；
⑥银染显色：电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：
固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；
银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；
水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；
显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5g NaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；
再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析，即得到‘丰华21’SSR指纹图谱。
采用上述方法对40粒待测种子进行真实性检测，如图5、图6所示，图5为待测种子与利用BVWS01377引物制备出的西瓜SSR指纹图谱比对结果，图6为待测种子与利用BVWS01701引物制备出的西瓜SSR指纹图谱比对结果，根据比对结果可知，1-40种子为‘丰华21’杂交种种子的纯度＝(40/40)×100％,即100％。
由此可见，采用本发明方法检测西瓜种子真实性和纯度，在室内即可完成、准确、快速、结果可靠。本实施例中无特殊说明的操作手法均为现有技术，故不在此过多解释。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> SSR引物BVWS01377正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
gacaaaatgg atctacaata gaaacg 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR引物BVWS01377反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
gctttttagg cacgaaacca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR引物BVWS01701正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
gtctttgatt ggggcaagaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> SSR引物BVWS01701反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
cggaacaaga aagaatccca 20

Claims (5)

1.一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)根据已公布的西瓜基因组序列信息设计SSR引物，在所设计出的SSR引物中筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物；
(2)利用步骤(1)最终筛选出来的SSR引物制备‘丰华21’SSR指纹图谱；
(3)对待检测的西瓜种子进行播种，CTAB法提取子叶期叶片的基因组DNA，利用步骤(1)中最终筛选出的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得待检测种子的SSR扩增带型，通过与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对，如比对结果一致，则可以判定为真实的‘丰华21’西瓜杂交种。
2.根据权利要求1所述的检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中还包括种子纯度的计算，将待测西瓜种子与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对后，采用如下公式计算得到种子纯度，
种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％……公式(一)。
3.根据权利要求1所述的检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，其特征在于，所述步骤(1)中筛选出在父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物的方法为：
a、‘丰华21’西瓜杂交种及父、母本叶片基因组DNA提取：
①在2.0ml离心管中加入玻璃珠，取100mg子叶期的西瓜叶片置于离心管中，在打样机上磨碎；
②向离心管中加入800μL 65℃预热的2％CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；
③加入800μL的氯仿抽提液，所述氯仿抽提液由氯仿、异戊醇按照体积比为24：1混合组成，轻轻混匀5min，然后在12000r·min-1离心5min；
④吸取500μL上清液，转移至新的2.0mL离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，然后将离心管置于4℃冰箱中，至DNA沉淀析出；
⑤弃上清，用75％乙醇清洗DNA，弃上清后于室温晾干；
⑥向每个离心管中加入包含1μL RNase的100μL ddH2O，用涡旋仪振荡溶解DNA，37℃水浴1h，消化其中残存的RNA；
⑦用核酸仪测量DNA的浓度和质量，将DNA稀释至50ng·μL-1，置于-20℃冰箱保存备用；
b、‘丰华21’及父、母本PCR扩增：
利用步骤(1)中设计出的SSR引物对‘丰华21’杂交种及其父、母本的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1的Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH2O10.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；
c、将PCR反应产物使用体积浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物：
①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；
②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；
③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400ml 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；
④点样：在15μLPCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；
⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；
⑥银染显色：电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：
固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；
银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；
水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；
显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5gNaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；
再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析；
⑦对在‘丰华21’杂交种及其父、母本中呈现多态性的SSR引物进行记录和再次筛选确认，最终获得在父母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物。
4.根据权利要求1所述的检测‘丰华21’种子真实性和纯度的方法，其特征在于，所述步骤(2)中制备‘丰华21’SSR指纹图谱的方法为：采用CTAB法分别提取1株‘丰华21’杂交种，1株父本和1株母本的基因组DNA；利用步骤(1)中最终筛选出来的SSR引物分别扩增上述DNA，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH2O 10.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；然后将PCR反应产物再采用聚丙烯酰胺凝胶电泳程序，在胶片观察灯下拍照，得到‘丰华21’SSR指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的检测‘丰华21’种子真实性和纯度的方法，其特征在于，所述步骤(2)制备‘丰华21’SSR指纹图谱的方法中凝胶电泳程序的方法为：
①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；
②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；
③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400ml 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；
④点样：在15μLPCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；
⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；
⑥银染显色：电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：
固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；
银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；
水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；
显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5gNaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；
再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析，即得到‘丰华21’SSR指纹图谱。
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