CN101824484A - 一种用于棉花品种真实性鉴定的dna指纹检测方法 - Google Patents
一种用于棉花品种真实性鉴定的dna指纹检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种棉花品种真实性鉴定的DNA指纹检测方法,该方法中采用单粒棉种提取待检样品的基因组DNA,省时省力且简单快速的获得高质量DNA。使用26对SSR核心引物组合进行棉种真实性DNA指纹检测,这些核心引物具有多态性高、稳定性与重复性好的特点,且均匀分布于棉花基因组26条染色体。本发明方法操作简单,准确稳定,适用于棉花品种真实性快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,特别是,涉及一种棉花品种真实性DNA指纹检测方法。
背景技术
随着棉花品种数量的日益增加和遗传基础的日益狭窄,使得完全根据形态性状进行棉花品种的辨别越来越困难,给种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难,造成诸如品种多、乱、杂的现象。近年来,分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平,与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比,DNA标记技术能揭示更多的多态性,具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点,是品种鉴定技术的发展趋势。与其它分子标记相比,以微卫星序列为基础的简单重复序列(SSR)标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优越性:SSR标记数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高,以孟德尔方式遗传,呈共显性。SSR标记已成为品种鉴定首选技术之一,并已在玉米,水稻等作物上初步应用。
目前,我国棉种的真实性与品种纯度鉴定仍依靠田间小区种植鉴定方法,需投入大量的人力、物力,成本高、耗时长,时效性差。武耀廷,张天真,郭旺珍等进行了陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究;马轩,杜雄明,孙君灵等进行了18个彩色棉品系的SSR指纹分析;殷剑美,陈旭升,狄佳春等进行了杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建研究。广大科研工作者普遍认为,利用分子标记进行棉花品种鉴定是可行的。但利用现有的分子标记技术进行品种鉴定缺乏系统性研究,存在鉴别能力不够高、操作步骤较多、耗费时间较长、实验成本较高等问题,不能完全适应实践检测的需要。
发明内容
本发明目的是提供一种棉花品种真实性DNA指纹检测方法,以克服现有技术存在的上述不足。
本发明通过对DNA快速提取法、分子检测标准试验体系(包括PCR扩增体系、电泳及银染检测)、核心引物筛选等环节进行全面系统的研究,从实践上解决限制DNA指纹技术商业化的关键技术问题,建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花品种DNA指纹鉴定标准实验体系,并在此基础上开发一种适用于棉花品种真实性检测的方法,采用该方法不仅检测结果稳定可靠,而且操作简单方便,成本低廉,有利于技术的标准化。
本发明提供一种棉花品种真实性DNA指纹检测方法,其使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套核心引物对待测品种进行检测,所述核心引物的核苷酸序列如下所示:
引物名称 | 引物序列(5′→3′) |
NAU3254 | 上游:GCTTTGCTTTGGAATGAGAT;下游:TTGGTGCAGATAGCAAGAAA |
NAU2277 | 上游:GAACTAGCCACATGATGCAC;下游:TTGTTGAGGCATTAGTTTGC |
NAU1190 | 上游:CCATGTCCGTATCCATGTTA;下游:TAAGGCAAGATAGGGTCAGG |
MUCS101 | 上游:AGCCTCTCTCTCCTTCAGGC;下游:GAGTCATATCGCTTGGGAGC |
NAU934 | 上游:TGCTTTCGTATCCTTTTTCC;下游:ATTAGAGAAGCCAGGGAGGT |
NAU874 | 上游:AAATGGCGTGCTTGAAATAC;下游:TGTGATGAAGAACCCTCTCA |
NAU1362 | 上游:TCTGATTTGCTGATTGGAAA;下游:CTTATTCGGACTTGGTTGCT |
BNL3257 | 上游:CAATCTGGGATCAAAAAAACC;下游:GGTGAAACATAGCGTGTTGC |
BNL1317 | 上游:AAAAATCAGCCAAATTGGGA;下游:CGTCAACAATTGTCCCAAGA |
BNL2960 | 上游:TAAGCTCTGGAGGCCAAAAA;下游:CCATTTCAATTTCAAGCATACG |
引物名称 | 引物序列(5′→3′) |
BNL1231 | 上游:TAATAAAAGGGAAAGGAAAGAGTT;下游:TATGGCTCTAGAATATTCCCTCG |
BNL3261 | 上游:AAACGGAAACGAAGAAGGGT;下游:CCCAAACCTGTCTCACCAAC |
BNL1421 | 上游:TGAAGATTTGGAGGCAATTG;下游:GAAATCAAGCCTCAATTCGG |
CIR246 | 上游:TTAGGGTTTAGTTGAATGG;下游:ATGAACACACGCACG |
NAU2437 | 上游:CTTGGAAAAAGGAAGAGCAG;下游:TTAAAAGACCAAAGGCAAGG |
JESPR292 | 上游:GCTTGCAATCTCCTACACC;下游:GAATATGTTTCATAGAATGGC |
NAU1167 | 上游:CTGACTTGGACCGAGAACTT;下游:AAGAGCCCTGGACAATGATA |
CIR216 | 上游:ATCTGAACCATCATCCTC;下游:TTCTGATTGGCACTTTC |
NAU3110 | 上游:CCAAGGATATGAACCAAAGG;下游:CGTGAACACCATGTCAGTCT |
BNL3646 | 上游:CCCAATACGAGGAGAGCACA;下游:TCGAAAATGGGGGAGAGAG |
引物名称 | 引物序列(5′→3′) |
BNL3171 | 上游:GAAAAATTGAGGAAGGACATACG;下游:GGCCACAACCGAATTTACTG |
BNL4030 | 上游:CCTCCCTCACTTAAGGTGCA;下游:ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC |
BNL3140 | 上游:CACCATTGTGGCAACTGAGT;下游:GGAAAAGGGAAAGCCATTGT |
NAU1125 | 上游:AAGAAGCCACTGAAGCAGAG;下游:GTAGAACAGCTCCATTGCTG |
BNL827 | 上游:AAGCTCCACGTGCTCAAGTT;下游:CTCATGTTGTCGGTGGTGTT |
CIR170 | 上游:TCGGTAAAGATGGGTG;下游:ATTGGTGCTGGTTGAG |
本发明中核心引物的筛选确定:以来源于我国三大棉区的32份棉花主栽品种为筛选材料,对现有引物进行大量的筛选,从棉花基因组每条染色体上挑选一对多态性高、稳定性与重复性好的引物,合计26对,作为品种真实性检测的一套核心引物。
根据本发明的DNA指纹检测方法,其包括提取待测品种的DNA、使用权利要求1所述26对核心引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。
其中,所述DNA提取包括以下步骤:将去壳棉种粉碎后,加入SDS提取液,漩涡充分后,65℃水浴;加入体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀,离心;取上清,加入浓度为10mg/mlRNase,水浴;抽提后离心取上清,加入异丙醇,待DNA成团析出后,用乙醇洗涤DNA沉淀,加入TE或ddH2O充分溶解DNA,备用。
根据权利要求2或3所述的DNA指纹检测方法,其特征在于,所述DNA提取包括以下步骤:将去壳棉种充分粉碎后,加入800μl SDS提取液,漩涡充分后,65℃水浴30min,间隔10min轻摇一次;加入等体积800μl体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀至不分层,10000rpm离心10min;取上清,加入浓度为10mg/ml的1μlRNase,37℃水浴30min;重复抽提一次后离心取上清,加入0.7倍体积异丙醇,待DNA成团析出后,70%乙醇洗涤DNA沉淀2次,加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA,备用。
所述SSR-PCR扩增反应体系,其中20μl反应液中包括:1.5mmol/LMgCl2,0.1mmol/L dNTP,1×Buffer,0.3μmol/L SSR引物,1U TaqDNA聚合酶,2μl DNA模板;反应程序为:95℃预变性2min,一个循环;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸2min,共30个循环;72℃延伸7min,一个循环;4℃保存待用。
所述电泳步骤中,PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒功率80W电泳1h。
所述银染检测包括以下步骤:用10%乙醇和0.5%冰醋酸组成的固定液固定10min;用双蒸水快速漂洗1次;用0.2%AgNO3溶液染色5min;用双蒸水快速漂洗1次;用3%NaOH和0.5%甲醛组成的显影液显影;用10%无水乙醇和0.5%冰醋酸组成的固定液定影。
具体而言,利用上述核心引物进行棉花品种真实性检测,包括以下步骤:
1)单粒棉种DNA快速提取
随机选取供检样品棉种与对照样品棉种各5粒,采用电动种子粉碎器将去壳棉种充分粉碎后,加入800μl SDS提取液,漩涡充分后,65℃水浴30min,间隔10min左右轻摇一次。加入等体积800μl酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为25∶24∶1),混匀至不分层,10000rpm离心10min。取上清,加入1μlRNase(10mg/ml),37℃水浴30min。重复抽提一次后离心取上清,加入0.7倍体积异丙醇,待DNA成团析出后,70%乙醇洗涤DNA沉淀2次,加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA,备用。该方法相比常规的以叶片为材料的CTAB提取法不仅能获得高质量的DNA,而且简单快速,省去了育苗时间和液氮研磨等环节,降低实验成本的同时大大提高了工作效率。
2)SSR-PCR扩增体系
20μl反应液中包括:1.5mmol/L MgCl2,0.1mmol/L dNTP,1×Buffer,0.3μmol/L SSR引物(26对核心引物),1U Taq DNA聚合酶,2μl DNA模板。
反应程序:95℃预变性2min,一个循环;94℃变性45s,55℃退火45s(退火温度可根据引物TM值进行适当调整),72℃延伸2min,共30个循环;72℃延伸7min,一个循环;4℃保存待用。该SSR-PCR扩增体系稳定可靠,确保了实验结果的可重复性。
3)电泳
PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒功率80W电泳1h。相比非变性胶和琼脂糖凝胶电泳,6%变性胶更适于高分辨率的棉种DNA指纹鉴定,不仅有效提高品种指纹鉴别能力,而且缩短了电泳时间。
4)银染检测
采用快速银染法,流程如下:
固定液(10%乙醇,0.5%冰醋酸)固定10min;→双蒸水快速漂洗1次;→0.2%AgNO3溶液染色5min;→双蒸水快速漂洗1次;→显影液(3%NaOH,0.5%甲醛)显影;→固定液(10%无水乙醇,0.5%冰醋酸)定影。该银染法操作简单,背景容易掌握,灵敏度高,且减少了冰醋酸的使用量,30分钟内即可获得背景清晰的染色效果。
5)结果分析:对供检样品与对照样品的26个位点的DNA指纹谱带进行比较:
引物位点差异≥2,判定两个品种为不同品种;
引物位点差异=1,判定两个品种为近似品种;
引物位点差异=0,判定两个品种为相同品种;
本发明棉花品种真实性DNA指纹检测方法具有以下有益效果:
本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的棉花DNA指纹鉴定标准实验体系,并在此基础上开发了一种适用于棉花品种真实性DNA指纹检测的方法,利用该方法对棉花品种真实性进行检测,一份样品从送样到出结果仅需2d,且检测结果稳定可靠,容易统计。该方法适用于我国主栽棉花品种真实性快速检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
如非特别指明,实施例中所涉及的百分比浓度,固体药剂均为质量浓度,液体药剂均为体积浓度。
实施例1
鉴定市面上正在热销的杂交棉品种X是否为主推棉花杂交种中棉所48
检测流程如下:
1、DNA提取
随机挑取待测品种X与中棉所48干种子各5粒进行DNA制备
(1)将单粒棉花种子去壳,充分粉碎后转入2ml的离心管中。
(2)加入800ul DNA提取液(1%SDS,0.01mol/L EDTA 8.0,0.7mol/L NaCl,0.05mol/L Tris-HCl,0.5%山梨醇,1%PVP,1%β-巯基乙醇),漩涡至充分混匀后,65℃水浴30min,间隔10min左右轻摇一下。
(3)水浴结束后,加入等体积800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(其体积比依次为25∶24∶1),上下颠倒混匀至不分层,10000rpm离心10min。
(4)吸取上清液转移到另一2ml离心管中,加入1uL RNase酶(10mg/ml),混匀后37℃水浴30min。
(5)加入等体积800ul的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),上下颠倒混匀至不分层,10000rpm离心10min。
(6)将上清液转移到另一2ml离心管中,加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次,静置30min,絮状DNA成团析出。
(7)用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70%乙醇的离心管中,浸泡两次,第一次约2小时,第二次浸泡过夜。
(8)倒掉乙醇,自然通风干燥DNA,加入200ul TE(pH 8.0)或ddH2O,充分溶解备用。
(9)紫外检测DNA浓度,用ddH2O将DNA原液稀释至使用浓度20ng/μl,4℃保存备用。
2、SSR-PCR扩增
采用26对核心引物进行PCR扩增(引物信息见表1),PCR反应体系如下:
反应程序:95℃预变性2min,一个循环;94℃变性45s,55℃退火45s(退火温度可根据引物TM值进行适当调整),72℃延伸2min,共30个循环;72℃延伸7min,一个循环;4℃保存待用。
3、电泳检测
(1)清洗玻璃板:用自来水沾上洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净,用纯水擦洗一遍,再用95%酒精擦洗一遍。在方板上涂上1ml Binding Silane(0.5%),凹板上涂上1ml Repelsilane(2%)。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。
(2)6%胶的制备:
注:40%PA胶:190g acrylamide+10g bisacrylamide用水稀释至500ml。
TEMED和10%APS在灌胶前加入。
(3)灌胶:灌胶过程中防止出现气泡,轻轻插入梳子,使其聚合2小时以上。
(4)变性:20μl PCR样品加上5μl 6×Loaling buffer,混匀后,在PCR仪上运行变性程序:95℃变性5分钟,4℃冷却10分钟(或置于冰上冷却)。
(5)电泳:用移液器吹吸加样槽,清除气泡,擦入样品梳子,每一个加样孔点入3μl样品。80W(1600V/50mA)恒功率电泳至上部的Loading buffer带(二甲苯青)至胶板的另一前沿(约1小时)。电泳结束后,小心分开两块玻璃板,胶会紧贴在涂Binding silane的玻璃板上。
4、银染
固定:10%无水乙醇+0.5%冰醋酸固定液,轻轻晃动10分钟;
漂洗:双蒸水快速漂洗,不超过10秒;
染色:0.2%AgNO3溶液中染色5分钟;
漂洗:双蒸水快速漂洗,时间不超过10秒;
显影:3%NaOH+0.5%甲醛显影液,轻轻晃动至带纹出现;
定影;固定液中定影5分钟;
5、结果分析
通过以上检测,获得两个品种在26个位点上的DNA指纹图谱,进行比较后发现,两个品种在三个引物位点上指纹不同,根据判定标准,说明市场上热销杂交品种X不是主推杂交品种中棉所48。下述表1为棉花品种真实性检测核26对核心引物名单,其引物序列号按顺序依次为1-52。
表1 棉花品种真实性检测核心引物名单
编号 | 引物名称 | 所在染色体 | 引物序列(5′→3′) |
M01 | NAU3254 | 1 | 上游:GCTTTGCTTTGGAATGAGAT;(1)下游:TTGGTGCAGATAGCAAGAAA(2) |
M02 | NAU2277 | 2 | 上游:GAACTAGCCACATGATGCAC;(3)下游:TTGTTGAGGCATTAGTTTGC(4) |
M03 | NAU1190 | 3 | 上游:CCATGTCCGTATCCATGTTA;(5)下游:TAAGGCAAGATAGGGTCAGG(6) |
M04 | MUCS101 | 4 | 上游:AGCCTCTCTCTCCTTCAGGC;(7)下游:GAGTCATATCGCTTGGGAGC(8) |
M05 | NAU934 | 5 | 上游:TGCTTTCGTATCCTTTTTCC;(9)下游:ATTAGAGAAGCCAGGGAGGT(10) |
M06 | NAU874 | 6 | 上游:AAATGGCGTGCTTGAAATAC;(11)下游:TGTGATGAAGAACCCTCTCA(12) |
M07 | NAU1362 | 7 | 上游:TCTGATTTGCTGATTGGAAA;(13)下游:CTTATTCGGACTTGGTTGCT(14) |
编号 | 引物名称 | 所在染色体 | 引物序列(5′→3′) |
M08 | BNL3257 | 8 | 上游:CAATCTGGGATCAAAAAAACC;(15)下游:GGTGAAACATAGCGTGTTGC(16) |
M09 | BNL1317 | 9 | 上游:AAAAATCAGCCAAATTGGGA;(17)下游:CGTCAACAATTGTCCCAAGA(18) |
M10 | BNL2960 | 10 | 上游:TAAGCTCTGGAGGCCAAAAA;(19)下游:CCATTTCAATTTCAAGCATACG(20) |
M11 | BNL1231 | 11 | 上游:TAATAAAAGGGAAAGGAAAGAGTT;(21)下游:TATGGCTCTAGAATATTCCCTCG(22) |
M12 | BNL3261 | 12 | 上游:AAACGGAAACGAAGAAGGGT;(23)下游:CCCAAACCTGTCTCACCAAC(24) |
M13 | BNL1421 | 13 | 上游:TGAAGATTTGGAGGCAATTG;(25)下游:GAAATCAAGCCTCAATTCGG(26) |
M14 | CIR246 | 14 | 上游:TTAGGGTTTAGTTGAATGG;(27)下游:ATGAACACACGCACG(28) |
M15 | NAU2437 | 15 | 上游:CTTGGAAAAAGGAAGAGCAG;(29)下游:TTAAAAGACCAAAGGCAAGG(30) |
M16 | JESPR292 | 16 | 上游:GCTTGCAATCTCCTACACC;(31)下游:GAATATGTTTCATAGAATGGC(32) |
M17 | NAU1167 | 17 | 上游:CTGACTTGGACCGAGAACTT;(33)下游:AAGAGCCCTGGACAATGATA(34) |
编号 | 引物名称 | 所在染色体 | 引物序列(5′→3′) |
M18 | CIR216 | 18 | 上游:ATCTGAACCATCATCCTC;(35)下游:TTCTGATTGGCACTTTC(36) |
M19 | NAU3110 | 19 | 上游:CCAAGGATATGAACCAAAGG;(37)下游:CGTGAACACCATGTCAGTCT(38) |
M20 | BNL3646 | 20 | 上游:CCCAATACGAGGAGAGCACA;(39)下游:TCGAAAATGGGGGAGAGAG(40) |
M21 | BNL3171 | 21 | 上游:GAAAAATTGAGGAAGGACATACG;(41)下游:GGCCACAACCGAATTTACTG(42) |
M22 | BNL4030 | 22 | 上游:CCTCCCTCACTTAAGGTGCA;(43)下游:ATGTTGTAAGGGTGCAAGGC(44) |
M23 | BNL3140 | 23 | 上游:CACCATTGTGGCAACTGAGT;(45)下游:GGAAAAGGGAAAGCCATTGT(46) |
M24 | NAU1125 | 24 | 上游:AAGAAGCCACTGAAGCAGAG;(47)下游:GTAGAACAGCTCCATTGCTG(48) |
M25 | BNL827 | 25 | 上游:AAGCTCCACGTGCTCAAGTT;(49)下游:CTCATGTTGTCGGTGGTGTT(50) |
M26 | CIR170 | 26 | 上游:TCGGTAAAGATGGGTG;(51)下游:ATTGGTGCTGGTTGAG(52) |
实施例2
鉴定某单位正在使用的亲本材料A是否为已申请保护的常规棉品种中棉所41,鉴定操作流程如下:
按照实施例1的步骤,随机挑取待测品种A与对照品种中棉所41干种子各5粒进行DNA制备,PCR扩增、电泳检测及银染。
结果分析:通过以上检测,获得两个品种在26个位点上的DNA指纹图谱,进行比较后发现,两个品种在26个引物位点上指纹完全相同,根据判定标准,说明亲本材料A是已申请保护的常规棉品种中棉所41。
序列表
<110>中国农业科学院棉花研究所
<120>一种用于棉花品种真实性鉴定的DNA指纹检测方法
<130>KHP10112482.9
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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ttagggttta gttgaatgg 19
<210>28
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
atgaacacac gcacg 15
<210>29
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>29
cttggaaaaa ggaagagcag 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
ttaaaagacc aaaggcaagg 20
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<211>19
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gcttgcaatc tcctacacc 19
<210>32
<211>21
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gaatatgttt catagaatgg c 21
<210>33
<211>20
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<400>33
ctgacttgga ccgagaactt 20
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<400>34
aagagccctg gacaatgata 20
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atctgaacca tcatcctc 18
<210>36
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ttctgattgg cactttc 17
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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ccaaggatat gaaccaaagg 20
<210>38
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<212>DNA
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cgtgaacacc atgtcagtct 20
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
cccaatacga ggagagcaca 20
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
tcgaaaatgg gggagagag 19
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<212>DNA
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gaaaaattga ggaaggacat acg 23
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<212>DNA
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<400>42
ggccacaacc gaatttactg 20
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cctccctcac ttaaggtgca 20
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<400>44
atgttgtaag ggtgcaaggc 20
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<212>DNA
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caccattgtg gcaactgagt 20
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<400>46
ggaaaaggga aagccattgt 20
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aagaagccac tgaagcagag 20
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<400>48
gtagaacagc tccattgctg 20
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<213>人工序列
<400>49
aagctccacg tgctcaagtt 20
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tcggtaaaga tgggtg 16
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
attggtgctg gttgag 16
Claims (7)
1.一种用于棉花品种真实性鉴定的DNA指纹检测方法,其特征在于,使用分布于棉花全基因组26条染色体上的一套核心引物对待测品种进行检测,所述核心引物的核苷酸序列如下所示:
2.根据权利要求1所述的DNA指纹检测方法,其特征在于,包括提取待测品种的DNA、使用权利要求1所述26对核心引物进行SSR-PCR扩增、电泳和银染检测步骤。
3.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法,其特征在于,所述DNA提取包括以下步骤:将去壳棉种粉碎后,加入SDS提取液,漩涡充分后,65℃水浴;加入体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀,离心;取上清,加入浓度为10mg/mlRNase,水浴;抽提后离心取上清,加入异丙醇,待DNA成团析出后,用乙醇洗涤DNA沉淀,加入TE或ddH2O充分溶解DNA,备用。
4.根据权利要求2或3所述的DNA指纹检测方法,其特征在于,所述DNA提取包括以下步骤:将去壳棉种充分粉碎后,加入800μl SDS提取液,漩涡充分后,65℃水浴30min,间隔10min轻摇一次;加入等体积800μl体积比依次为25∶24∶1的酚、氯仿和异戊醇的混合液,混匀至不分层,10000rpm离心10min;取上清,加入浓度为10mg/ml的1μlRNase,37℃水浴30min;重复抽提一次后离心取上清,加入0.7倍体积异丙醇,待DNA成团析出后,70%乙醇洗涤DNA沉淀2次,加入200μlTE或ddH2O充分溶解DNA,备用。
5.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法,其特征在于,所述SSR-PCR扩增反应体系,其中20μl反应液中包括:1.5mmol/L MgCl2,0.1mmol/L dNTP,1×Buffer,0.3μmol/L SSR引物,1U Taq DNA聚合酶,2μl DNA模板;反应程序为:95℃预变性2min,一个循环;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸2min,共30个循环;72℃延伸7min,一个循环;4℃保存待用。
6.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法,其特征在于,所述电泳步骤中,PCR扩增产物采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒功率80W电泳1h。
7.根据权利要求2所述的DNA指纹检测方法,其特征在于,所述银染检测包括以下步骤:用10%乙醇和0.5%冰醋酸组成的固定液固定10min;用双蒸水快速漂洗1次;用0.2%AgNO3溶液染色5min;用双蒸水快速漂洗1次;用3%NaOH和0.5%甲醛组成的显影液显影;用10%无水乙醇和0.5%冰醋酸组成的固定液定影。
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