CN107058485A - 一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段及其ssr标记引物和应用 - Google Patents
一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段及其ssr标记引物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段及其SSR标记引物和应用。一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段A1‑6，此陆地棉染色体片段A1‑6来自于陆地棉品种TM‑1，通过4个SSR标记：BNL2440185，NAU2437235，NAU3901245，dPL0526260标记；使用所述的4个SSR标记引物扩增陆地棉品种TM‑1基因组DNA，同时含有4个分子标记目的片段的染色体片段即为陆地棉染色体片段A1‑6。本发明所述IL‑A1‑6的陆地棉染色体片段及其分子标记应用于棉花分子育种，能极大地增加棉花铃重，提高棉花的产量和育种效率。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种领域，涉及一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段及其SSR标记引物和应用。
技术背景
棉花是世界性的重要经济作物，是纺织业的重要材料。我国也是产棉大国，产棉区覆盖16个省、市(自治区)，每年总产量500万吨以上。棉花产量性状中比较重要的一个指标是籽棉产量，其构成的重要因素之一是单铃重。
棉花单铃重性状是典型的数量性状，易受环境条件影响，国内外研究人员对棉花单铃重进行了大量的QTL定位研究。于雯雯(2006)利用海陆杂交F2群体在3个染色体上检测到3个铃重QTL，可以解释12-15％的表型变异；张先亮(2007)利用陆地棉品种间RIL群体，定位3个铃重QTL；王沛政(2007)利用3个陆地棉品种间杂交F2群体，检测到5个铃重的QTL，可以解释14.2-39.2％的表型变异；尤春英(2007)利用海陆杂交F2群体，检测到5个铃重QTL，可以解释10.3-18.3％的表型变异；秦鸿德(2007)利用一个陆地棉品种间三交群体，检测到1个铃重QTL；张保才(2006)利用海陆杂交BC1S1、BC1F1和BC2F13个世代群体，检测到2个铃重QTL，可以解释8.5-11.2％的表型变异；张培通等(2006)利用泗棉3号和西班牙陆地棉栽培品种Carmen的RIL群体，检测到1个铃重QTL；Saranga等(2004)利用海陆杂交组合的F2、F3群体，检测到13个铃重QTL，可以解释4.4-23.1％的表型变异；Wang等(2007)利用中棉所12×8891重组自交系群体在三个环境下的平均值资料，检测到3个铃重QTL，解释4.79-6.39％的表型变异；钱能(2009)利用陆地棉品种间杂交得到的四交群体检测到一个解释14.1％表型变异的铃重QTL；Yu等(2013)利用陆地棉和埃及棉的包含146个株系的BIL群体检测到8个铃重QTL；Gore等(2014)利用TM-1和NM24016(来源于海岛棉片段的导入系)创建RIL群体定位了5个铃重的QTLs。
海岛棉生育期长，成熟晚，铃小，产量低于陆地棉，但纤维细强，是纺高支纱原料，因此，改良海岛棉的产量性状，在育种上具有重要意义。传统的杂交育种因海陆F2代分离严重而很难进行，因此，利用导入系进行海岛棉产量性状改良成为海岛棉育种的重要手段。
染色体片段导入系(Chromosome segment introgression lines，CSIL)是利用杂交，回交和分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)构建的覆盖作物整个基因组的一系列近等基因系。它的基因组内只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段，而基因组的其余部分与轮回亲本相同。它是进行基因组研究，特别是QTL定位和分子设计育种的理想材料。Eshed和Zamir(1995)利用覆盖番茄全基因组的50个染色体片段导入系定位了个番茄品质性状的QTL。他们发现利用染色体片段导入系对番茄果实总固形物含量和果实重量进行QTL定位时比利用常规分离群体定位的QTL数要多出1倍；Rae et al.(1999)在研究十字花科植物开花期QTL时发现，利用导入系鉴定的QTL数比利用常规分离群体鉴定的QTL数多。Arbelaez等(2015)利用两个野生种稻和一个共同的轮回亲本构建了导入系。此外在大豆(Wang等2013；Lee等2014)，玉米(Burton等2015)，苎麻(Liu等2014)中都有相关报道。
Wang等(2012)利用陆地棉和海岛棉构建了105个渐渗系，用278个多态性标记鉴定，导入片段长度333.5cM，覆盖染色体片段的6.7％。对渐渗系材料各个性状和多态性标记间进行关联分析，有40对SSR标记关联到5个纤维品质相关性状，平均贡献率：6.31％。Wang等(2012)构建了以陆地棉(TM-1)为背景，海岛棉(H7124)为供体亲本的渐渗系，共有169个家系，单片段导入系有51个，占30.18％，在BC5群体中检测到23个显著性标记，其中纤维品质的17个，产量组分(单铃重和衣分)6个。在BC5S1群体中检测到27显著性标记，其中纤维品质的22个，产量组分(单铃重和衣分)5个。在CSIL群体中检测到14个显著性标记，其中纤维品质的12个，产量组分(单铃重和衣分)2个。
Cao等(2014)已利用由陆地棉TM-1(轮回亲本)和海7124(非轮回亲本)构建的染色体片段置换系进行了分子育种的实践，利用4个含海岛棉优异纤维品质QTLs的导入系(IL019-D6-1，IL019-A2-6，IL088-A7-3和IL040-A4-1)改良了四个新疆早熟棉品种(系)(新陆早26、新陆早41、新陆早42和0768)的纤维品质。
发明内容
本发明的目的在于提供一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段。
本发明的另一目的是提供该陆地棉染色体片段A1-6的SSR分子标记引物。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段A1-6，此陆地棉染色体片段A1-6来自于陆地棉品种TM-1，通过4个SSR标记：BNL2440185，NAU2437235，NAU3901245，dPL0526260标记；使用所述的4个SSR标记引物扩增陆地棉品种TM-1基因组DNA，同时含有4个分子标记目的片段的染色体片段即为陆地棉染色体片段A1-6；所述的4个SSR标记引物及扩增的目的片段长度如下：
BNL2440185的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增的目的片段长度为185bp的DNA片段；
NAU2437235的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增的目的片段长度为235bp的DNA片段；
NAU3901245的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增的目的片段长度为245bp的DNA片段；
dPL0526260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增的目的片段长度为260bp的DNA片段。
本发明所述的陆地棉染色体片段A1-6在提高棉花铃重育种中的应用。
利用本发明染色体片段A1-6获得铃重显著提高的陆地棉导入系IL-A1-6的方法，包含以下步骤：
(1)海岛棉品种新海25(♂)和陆地棉遗传标准系TM-1(♀)杂交产生F1代，然后以新海25为轮回亲本，回交3次，自交4次产生BC3S4种子。
(2)种植BC3S4种子产生植株，应用CTAB法提取DNA，采用分子标记引物对BNL2440185，NAU2437235，NAU3901245，dPL0526260进行PCR扩增，各分子标记的引物及扩增的目的片段长度如下：
BNL2440185的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在陆地棉品种TM-1中可扩增出长度为185bp的DNA片段；
NAU2437235的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在陆地棉品种TM-1中可扩增出长度为235bp的DNA片段；
NAU3901245的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在陆地棉品种TM-1中可扩增出长度为245bp的DNA片段；
dPL0526260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，在陆地棉品种TM-1中可扩增出长度为260bp的DNA片段。
选择同时含有4个分子标记位点(分子量分别是185bp；235bp；245bp；260bp)的染色体片段即为海岛棉染色体片段A1-6；
(3)将含有该染色体片段的导入系IL-A1-6，分别于2013年和2014年种植在新疆阿克苏地区和巴音郭楞蒙古自治州库尔勒市试验基地，种植两行，行长2米，膜宽0.75米，三次重复，同时种植TM-1和新海25，待棉花收取每行材料的25个棉铃，称重，计算单铃重。经过实际测量后得出的数据是：含有陆地棉染色体片段A1-6的导入系IL-A1-6的铃重为4.00-4.51g，轮回亲本新海25的铃重3.48-3.90g。
本发明所述的分子标记引物在筛选陆地棉染色体片段A1-6以提高棉花铃重中的应用。
所述的应用优选使用所述的4个SSR标记引物扩增陆地棉品种TM-1基因组DNA，同时含有4个分子标记扩增的目的片段的即为陆地棉染色体片段A1-6，选择含有陆地棉染色体片段A1-6的材料留种。
一种筛选陆地棉染色体片段A1-6的方法，包括使用所述的4个SSR标记引物扩增陆地棉品种TM-1基因组DNA，同时含有4个分子标记扩增的目的片段的染色体片段即为陆地棉染色体片段A1-6。
有益效果
1、本发明所提供了一个显著提高棉花铃重的陆地棉染色体片段A1-6，利用该染色体片段能够培育得到一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段导入系IL-A1-6，经过2年2点的3次重复试验后，发现该染色体片段能显著提高海岛棉铃重，两年两点分别比对照新海25增加12.64％和12.86％(表2)。因此IL-A1-6染色体片段导入系中的海岛棉染色体片段能显著提高海岛棉铃重，在海岛棉育种中有重要意义。
2、本发明所提供的海岛棉染色体片段A1-6的4个SSR分子标记及其引物能提高海岛棉铃重的选择效率(图1)。分子标记辅助目标片段选择，可加快新品种培育进程。
附图说明
图1 4个SSR引物在新海25和TM-1中的扩增位点
具体实施方式
实施例1
南京农业大学棉花研究所以海岛棉新海25为轮回亲本，陆地棉遗传标准系TM-1品种为供体亲本(非轮回亲本)，回交3次，自交4次产生BC3S4种子。BC3S4植株，每株采集3-4片未展开的叶片放入1.5ml的离心管中，并加入预冷的新鲜配制的提取缓冲液600μl，用研磨仪研磨，应用CTAB法(Paterson A H,Brubaker C L,Wendel J F.A rapid method forextraction of cotton (Gossypium spp.)genomic DNA suitable for RFLP or PCRanalysis[J].Plant Molecular Biology Reporter,1993,11(2):122-127.)提取DNA，用SSR引物BNL2440，NAU2437，NAU3901，dPL0526(表1)进行PCR扩增，扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，57℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃再延伸10min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为8％，电泳缓冲液为0.5倍TBE，220V恒压电泳1小时。选择同时含有4个分子标记条带(在TM-1中分子量分别是185bp；235bp；245bp；260bp)的染色体片段即为陆地棉染色体片段A1-6。
表1 A1-6染色体片段上的SSR分子标记
注:BNL编号的引物来自美国Research Genetics公司(http://www.resgen.com)；NAU编号的引物由本实验室从EST-SSR序列中开发(Zhao L,Yuanda L,Caiping C,etal.Toward allotetraploid cotton genome assembly:integration of a high-densitymolecular genetic linkage map with DNA sequence information[J].BMC genomics,2012,13(1):539.).dPL编号的引物来自美国Monsanto公司(http://www.monsanto.com)。所有的引物信息可以从网站www.cottonmarker.org上下载。
将含有该染色体片段的导入系IL-A1-6，分别于2013年和2014年种植在新疆阿克苏地区和库尔勒市试验基地，种植两行，行长2米，膜宽0.75米，三次重复，同时种植TM-1和新海25，待棉花吐絮，收取每行材料的25个棉铃，称重，计算单铃重。经过实际测量后得出的数据是：含有陆地棉染色体片段A1-6的导入系IL-A1-6的铃重为4.00-4.51g，轮回亲本新海25的铃重3.48-3.90g，含有陆地棉染色体片段A1-6的导入系IL-A1-6的铃重比对照新海25分别增加12.64％和12.86％。因此A1-6的陆地棉染色体片段应用于棉花分子育种，能显著地提高海岛棉铃重。
表2 导入系A1-6在不同年份、不同环境中铃重表现
SEQUENCE LISTING
<110> 南京农业大学
<120> 一个能显著提高海岛棉铃重的陆地棉染色体片段及其SSR标记引物和应用
<160> 8
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记BNL2440正向引物
<400> 1
tgttaagcat acattagttt cactcg 26
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记BNL2440反向引物
<400> 2
ccggcaccac aaaagtaaat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记NAU2437正向引物
<400> 3
cttggaaaaa ggaagagcag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记NAU2437反向引物
<400> 4
ttaaaagacc aaaggcaagg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记NAU3901正向引物
<400> 5
aagacaaaag gcaaggacac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记NAU3901反向引物
<400> 6
cttggaaaaa ggaagagcag 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记dPL0526正向引物
<400> 7
gttcttggtc atgctggtaa gaaa 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 分子标记dPL0526反向引物
<400> 8
tagccatatc caccttagca gatt 24
Claims (6)
1.一个显著提高棉花铃重的陆地棉染色体片段A1-6，其特征在于：自于陆地棉品种TM-1,位于棉花染色体组的A1号染色体，包括以下4个SSR分子标记；
BNL2440185的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增的目的片段长度为185bp的DNA片段；
NAU2437235的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增的目的片段长度为235bp的DNA片段；
NAU3901245的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增的目的片段长度为245bp的DNA片段；
dPL0526260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增的目的片段长度为260bp的DNA片段；
使用所述的4个SSR标记引物扩增陆地棉品种TM-1基因组DNA，同时含有4个分子标记扩增的目的片段的即为陆地棉染色体片段A1-6。
2.权利要求1所述的陆地棉染色体片段A1-6的4个SSR分子标记引物，其特征在于：4个SSR标记分别为BNL2440185，NAU2437235，NAU3901245，dPL0526260；各分子标记的引物及扩增的目的片段长度如下：
BNL2440185的正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增的目的片段长度为185bp的DNA片段；
NAU2437235的正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增的目的片段长度为235bp的DNA片段；
NAU3901245的正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增的目的片段长度为245bp的DNA片段；
dPL0526260的正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增的目的片段长度为260bp的DNA片段。
3.权利要求1所述的陆地棉染色体片段A1-6在提高棉花铃重育种中的应用。
4.权利要求2所述的分子标记引物在筛选陆地棉染色体片段A1-6以提高棉花铃重育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于使用权利要求2所述的4个SSR标记引物扩增陆地棉品种TM-1基因组DNA，同时含有4个分子标记扩增的目的片段的即为陆地棉染色体片段A1-6，选择含有陆地棉染色体片段A1-6的材料留种。
6.一种筛选陆地棉染色体片段A1-6的方法，其特征在于包括使用权利要求2所述的4个SSR标记引物扩增陆地棉品种TM-1基因组DNA，同时含有4个分子标记扩增的目的片段的染色体片段即为陆地棉染色体片段A1-6。
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