CN102517396A

CN102517396A - 一种培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法

Info

Publication number: CN102517396A
Application number: CN2011104509623A
Authority: CN
Inventors: 张天真; 王鹏; 郭旺珍
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2031-12-29
Also published as: CN102517396B

Abstract

本发明属于分子育种领域，涉及一种培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法。该方法是以保藏号为CGMCC No.5574的海岛棉染色体片段导入系IL095为母本，保藏号为CGMCC No.5575的海岛棉染色体片段导入系IL154为父本，杂交1代，再自交1代获得F2，每代都是单株收获；再以分子标记辅助选择获得抗多菌种的棉花新品系。利用这一方法，已经培育出抗多菌种的棉花新品系“南农海导5号”。通过分子标记辅助选择目标性状，可在2-3年内快速高效培育出抗多菌种的棉花新品系。“南农海导5号”抗棉花黄萎病的相对病指为15.51％-20.97％。

Description

一种培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法

技术领域

本发明属于分子育种领域，涉及一种培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法，具体涉及一种利用海岛棉染色体片段导入系培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法。

背景技术

棉花是世界性的重要经济作物。中国是棉花的生产大国，消费大国和纺织大国。作为棉花生产大国，我国主产棉区覆盖16个省、市(自治区)，常年植棉面积7000-8000万亩，总产约600万吨，占世界总产的四分之一。然而在棉花的生长期内受到各种不同病害的威胁，如被称为棉花“癌症”的黄萎病，它在全球都有分布且造成严重的经济损失(Cai YF，He XH，Mo JC，et al.Molecular research and genetic engineering of resistance to Verticillium wilt in cotton：A review[J].Afr J Biotech，2009，8：7363-7372.)。棉花黄萎病是黄萎病菌经土壤传播、侵染到棉花植株最终引发维管束疾病的一种真菌性病害，具有危害严重、分布范围大、寄主种类多及存活时间长等特点，可造成棉花大量减产甚至绝收(Yang C，Guo WZ，Li GY，et al.QTLsmapping for Verticillium wilt resistance at seedling and maturity stages for in G.barbadense L[J].Plant Sci，2008，174：290-298)。黄萎病菌属于真菌的半知菌亚门(Deutermycotina)淡色孢科(Monilaceae)轮枝菌属(Verticillium)，属内有若干种；其中危害棉花的有黑白轮枝菌(Verticillium alboatrum Reinke & Berthier)和大丽轮枝菌(Verticillium dahlia Klebahn)，它们在形态、特征、寄主范围以及生长特征方面都有所差异。

应用传统育种方法和转基因技术培育抗病品种是目前最有效和可行的控制棉花黄萎病危害的方法。陆地棉是4个栽培种中种植最广泛的棉种，它的产量占到当年棉花产量的95％，所以是遗传研究和育种的主要对象，但是大部分的陆地棉品种均感或耐黄萎病(Chen ZJ，Scheffler BE，Dennis，E et al.Toward sequencing cotton(Gossypium)genomes[J].Plant Physiol，2007，145：1303-1310.)。海岛棉是另一个四倍体栽培种，它的纤维比陆地棉“长、强、细”，同时它高抗或抗黄萎病，因此海岛棉是重要的棉优质纤维和抗黄萎病基因的重要来源。育种家们一直想通过海陆种间杂交的方式把海岛棉中抗黄萎病的基因导入到陆地棉中去，但是由于连锁累赘和杂交后代不容易稳定等原因限制了抗病品种的培育。分子标记技术在提高棉花抗黄萎病育种中的应用大大减少了育种过程中选择的盲目性，快速实现外源优良种质向栽培品种渗透，拓宽了品种的遗传基础。国内外研究人员对黄萎病抗性进行了大量的QTL定位研究，有的已经用于标记辅助选择育种实践。

染色体片段导入系(Chromosome segment introgression lines，CSIL)是利用杂交，回交和分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)构建的覆盖作物整个基因组的一系列近等基因系。它的基因组内只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段，而基因组的其余部分与轮回亲本相同。它是进行基因组研究，特别是QTL定位和分子设计育种的理想材料。万建民(万建民.作物分子设计育种.作物学报，2006，32(3)：455-462.)已利用由粳稻Asominori(轮回亲本)和籼稻IR24(非轮回亲本)构建的染色体片段置换系进行了分子育种的实践。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种利用海岛棉染色体片段导入系培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法，包含如下步骤：

(1)以保藏号为CGMCC NO.5574的海岛棉染色体片段导入系IL095为母本，保藏号为CGMCC NO.5575的海岛棉染色体片段导入系IL154为父本，杂交1代，再自交1代获得F₂，每代都是单株收获；

(2)分子标记辅助第一次选择：F₂种植，应用CTAB法提取DNA，采用所述的海岛棉染色体片段导入系IL095对应的分子标记引物对NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海岛棉染色体片段导入系IL154对应的分子标记引物对BNL1034、NAU1366、BNL3171进行PCR扩增，选择同时含有上述7个来源于海岛棉的分子标记条带，分子量分别是215bp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的单株自交获得F₃，种子按单株收获；其中分子标记引物对NAU2626正/反向序列为SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，NAU5061正/反向序列为SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，NAU5024正/反向序列为SEQ ID NO.5/SEQ IDNO.6，BNL1026正/反向序列为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，BNL1034正/反向序列为SEQID NO.9/SEQ ID NO.10，NAU1366正/反向序列为SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14，BNL3171正/反向序列为SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12；

(3)分子标记辅助第二次选择：种植F₃，每株提取DNA后，再利用所述的分子标记引物对NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU1366、BNL3171确定F₃单株的基因型，同时具有7个来源于上述海岛棉的分子标记条带，分子量分别是215bp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的单株即为抗多个黄萎病菌种的育成品系。

所述的分子育种方法还包括步骤(4)：将步骤(3)筛选到的抗多个黄萎病菌种的F₃种植在温室，利用致病力不同的黄萎病菌株进行抗病性筛选获得抗多个黄萎病菌种的育成品系。

有益效果：

本发明所提供的一种利用海岛棉染色体片段导入系培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法，与传统的回交聚合育种技术相比具有如下优点：传统的回交聚合育种技术存在杂交工作量大、选择可靠性差、育种周期长的缺陷。通过分子标记辅助选择目标性状，可在2-3年内快速高效培育出多抗的棉花新品系。本发明以海岛棉染色体片段导入系——IL095和IL154为材料，通过分子标记辅助选择获得了抗多个黄萎病菌种的棉花新品系“南农海导5号”，“南农海导5号”抗棉花黄萎病的相对病指为15.51％-20.97％。

附图说明

图1分子标记辅助选择抗多个黄萎病菌种的棉花新品系。

图2IL095、IL154和南农海导5号接种3个落叶型的黄萎病菌株后的相对病指。

A为IL095、IL154和南农海导5号接种黄萎病菌株V991后的相对病指，

B为IL095、IL154和南农海导5号接种黄萎病菌株V07DF2后的相对病指，

C为IL095、IL154和南农海导5号接种黄萎病菌株D8092后的相对病指。

生物材料保藏证明

IL095为陆地棉(Gossypium hirsutum.)，2011年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.5574；

IL154为陆地棉(Gossypium hirsutum.)，2011年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.5575。

具体实施方式

实施例1选择亲本

南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室棉花研究所以陆地棉遗传标准系TM-1为轮回亲本，抗病、优质的海岛棉海7124品系为供体亲本(非轮回亲本)，在回交高世代结合覆盖全基因组的SSR分子标记辅助选择，培育了国内首套陆地棉遗传标准系TM-1背景的海岛棉染色体片段导入系174个，其基因组的覆盖率达83.5％。黄萎病菌株V991和V07DF2是长江棉区致病力不同的2个落叶型菌株(菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所保存)，黄萎病菌株D8092是黄河棉区的中等致病力的落叶型菌株(菌株由中国农业科学院棉花研究所保存)。利用V991、V07DF2和D80923个不同致病力的菌株在温室接菌海岛棉染色体片段导入系，筛选出抗V991、V07DF2和D80923个菌种的导入系IL095和抗V07DF2和D80922个菌株的导入系IL154。导入系IL095抗3个菌种的相对病指分别是24.55％(V991)、27.45％(V07DF2)和25.16％(D8092)。导入系IL154抗3个菌种的相对病指分别是35.60％(V991)、19.56％(V07DF2)和14.05％(D8092)。导入系IL095为陆地棉(Gossypium hirsutum.)，2011年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.5574；导入系IL154为陆地棉(Gossypium hirsutum.)，2011年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.5575。

实施例2

(1)2008年夏季在南京农业大学江浦试验站分别种植IL095和IL154各一行，IL095(CGMCCNO.5574)为母本，IL154(CGMCC NO.5575)为父本配制杂交组合产生F₁，成熟后全部混收。2008年冬季在海南三亚种植3行F₁，自交获得F₂，成熟后全部混收。田间管理按常规方法进行。

(2)分子标记辅助选择：2009年夏季在南京农业大学江浦试验站种植50行F₂，每行10-12株，每株采集3-4片未展开的叶片放入1.5ml的eppendorf管中，并加入预冷的新鲜配制的提取缓冲液600μl，电钻研磨，应用CTAB法(Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF.Arapid method for extraction of cotton(Gossypium spp.)genomic DNA suitable forRFLP or PCR analysis[J].Plant Mol Biol Rep，1993，11，2：122-127)提取DNA，采用IL095(CGMCC NO.5574)和IL154(CGMCC NO.5575)导入片段上的分子标记(表1)进行PCR扩增，扩增体系10μl，DNA模板1μl，94℃预变性5min，94℃变性0.5min，57℃复性0.5min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃再延伸10min，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度为8％，电泳缓冲液为0.5倍TBE，170V恒压电泳1.5小时。选择含有7个分子标记的50个单株自交获得F₃，种子按单株收获。

(3)2009年冬季在南京农业大学温室将每一F₃种植1行，每行15-25株，每株采集叶片，提取DNA后，利用表1提供的分子标记确定F₃株行的基因型，选择7个标记都是纯合的株行(同时具有表1中来源于上述海岛棉的7个分子标记条带)。

表1 IL095和IL154导入片段的SSR分子标记

(4)田间鉴定：2009-2011年，在南京农业大学温室将中选F₃株行种植在7.3×5.1×8.3cm的纸杯中，每行15-25株，两次重复。待F₃的棉株长到一叶一心时，通过撕底蘸根的方式接菌V991、V07DF2和D8092，每个纸杯接菌15ml。于接菌后的25天，30天和35天对棉株的发病情况进行调查。调查的标准：0级-健株，没有叶片发病；1级-1-2片子叶表现黄萎病症状；2级-1片真叶表现黄萎病症状；3级-2片真叶表现黄萎病症状；4级-全部叶片发病或全病死或脱落成光杆。根据种植的棉株数和发病的病级，通过以下公式计算病情指数(disease index，DI)和相对病情指数(relative disease index，RDI)。

DI＝[(一级病株数×1+二级病株数×2+三级病株数×3+四级病株数×4)÷(调查总株数×4)]×100

RDI＝校正系数K×鉴定材料病指

K＝50/感病对照的实际病指，50为规定感病对照的标准病指

根据相对病值可以把棉株的发病情况分为以下5个等级：免疫(immunity to Verticilliumwilt，I)，RDI＝0；高抗黄萎病(high resistance to Verticillium wilt，HR)，RDI＜10.0；抗黄萎病(high resistance to Verticillium wilt，R)，10.1＜RDI＜20.0；耐黄萎病(toleranceto Verticillium wilt，T)，20.1＜RDI＜35.0；感黄萎病(susceptibility to Verticillium wilt，S)，RDI＞35.0。从以上鉴定的纯系中选择接种多个黄萎病菌种其相对病指在15.51％-20.97％的家系，即为育成品系“南农海导5号”。该品系显著特点是抗多个黄萎病菌种。

由于本发明选择的3株黄萎病菌株V991、V07DF2和D8092，分别代表了中等致病力和强致病力的落叶型菌株，因此通过该分子育种方法选育的“南农海导5号”品系显著特点是抗多个黄萎病菌种，具有广谱抗性的特点。

注：BNL编号的引物来自美国Research Genetics公司(http://www.resgen.com)；NAU编号的引物由本实验室从EST-SSR序列中开发(Han Z G，Guo W Z，Song XL，et al.Genetic mapping ofEST-derived microsatellites from the diploid Gossypium arboreum in allotetraploid cotton.MolGen Genomics，2004，272：308-327；Han Z G，Wang C B，Song XL，et al.Characteristics，development and mapping of Gossypium hirsutum derived EST-SSRs in allotetraploid cotton.Theor Appl Genet，2006，112：430-439；Wangzhen Guo，Caiping Cai，Changbiao Wang，et al.Apreliminary analysis of genome structure and composition in Gossypium hirsutum.BMCGenomics，2008，9：314-331.).所有的引物信息可以从网站www.cottonmarkers.org上下载。

Claims

1.一种利用海岛棉染色体片段导入系培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法，其特征在于包含如下步骤：

(2)分子标记辅助第一次选择：F₂种植，应用CTAB法提取DNA，采用所述的海岛棉染色体片段导入系IL095对应的分子标记引物对NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海岛棉染色体片段导入系IL154对应的分子标记引物对BNL1034、NAU 1366、BNL3171进行PCR扩增，选择同时含有上述7个来源于海岛棉的分子标记条带，分子量分别是215bp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的单株自交获得F₃，种子按单株收获；其中分子标记引物对NAU2626正/反向序列为SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，NAU5061正/反向序列为SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，NAU5024正/反向序列为SEQ ID NO.5/SEQ IDNO.6，BNL1026正/反向序列为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，BNL1034正/反向序列为SEQID NO.9/SEQ ID NO.10，NAU1366正/反向序列为SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14，BNL3171正/反向序列为SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12；

(3)分子标记辅助第二次选择：种植F₃，每株提取DNA后，再利用所述的分子标记引物对NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU 1366、BNL3171确定F₃单株的基因型，同时具有7个来源于上述海岛棉的分子标记条带，分子量分别是215bp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的单株即为抗多个黄萎病菌种的育成品系。

2.根据权利要求1所述的一种利用海岛棉染色体片段导入系培育抗黄萎病棉花新品种的分子育种方法，其特征在于所述的分子育种方法还包括步骤(4)：将步骤(3)筛选到的抗多个黄萎病菌种的F₃种植在温室，利用致病力不同的黄萎病菌株进行抗病性筛选获得抗多个黄萎病菌种的育成品系。