CN105713976A - 能提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段及分子标记 - Google Patents
能提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段及分子标记 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一个能显著提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段及其分子标记，所述的海岛棉染色体片段D4?1来自于海岛棉H7124，位于棉花染色体组的D4号染色体，通过11对SSR标记(NAU3392，NAU6992，NAU6993，NAU3791，cgr6409，JESPR220，NAU5294，NAU7290，ZHX1，ZHX6，ZHX29)进行鉴定。以海岛棉品种H7124的DNA为模板，使用所述的11对SSR标记同时扩增，能够同时获得11个SSR标记特异条带的染色体片段即为海岛棉H7124的染色体片段D4?1。含有该染色体片段的陆地棉导入系显著低于陆地棉受体对照品种苏棉8号的病指。本发明海岛棉染色体片段及其分子标记应用于棉花抗黄萎病分子育种，能极大地提高棉花对黄萎病的抗性，提高棉花的育种效率。
Description
技术领域
本发明属于作物遗传育种技术领域，涉及一种能显著提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段及分子标记。
背景技术
棉花是我国主要的经济作物，棉花生产在我国国民经济中始终占有举足轻重的地位。棉花的病害比较多，特别是黄萎病，给棉花生产造成巨大损失。棉花黄萎病是Carpenter于1914年在美国弗吉尼亚州发现并报道的，它是由大丽轮枝菌引起的一种真菌性病害。
我国棉花黄萎病是由于1935年引进美国斯字棉4B棉种传入我国的，以后随着棉种的繁殖和调运，棉花黄萎病在我国各主要产棉区逐渐传播开来。1973年普查结果显示，全国枯、黄萎病面积36.98万hm2，占统计棉田的10％，1979年增至71.17万hm2，占统计棉田的18.2％(全国棉花枯、黄萎病综合防治研究协作组，1976)。1982年农牧渔业部对全国棉花枯、黄萎病发生状况进行普查，其发生面积达148.2万hm2，占当年植棉面积的31.26％，其中纯黄萎病田面积13万hm2，占病田面积的8.7％(马存，2007)。20世纪90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，其中1993年棉花黄萎病爆发成灾，发病面积达266.67万hm2，损失皮棉1亿公斤以上。1995年、1996年棉花黄萎病在全国范围内连续大发生，给棉花生产造成极大的损失。2000年棉花黄萎病在新疆危害严重，其中农五师2.67万hm2棉田中有0.67万hm2重病田。2002和2003年棉花黄萎病在北方棉区再次连续大发生，给棉花生产造成重大损失。到目前为止，由于缺少棉花抗黄萎病的栽培材料，通过常规的育种手段来解决棉花对黄萎病的抗性进展缓慢(Cai et al.，2009)。
许多学者对陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、海岛棉(G. barbadense L.)进行黄萎病抗性鉴定，结论一致认为，多数海岛棉品种对黄萎病的抗性较强，对某些生理小种可以达到免疫水平；陆地棉抗性较弱。近20年来通过回交育种已将海岛棉抗黄萎病基因转育到陆地棉中，育成一些抗病性获得显著提高的棉花新品种。因此引入海岛棉的优良抗病基因对陆地棉的遗传改良具有极为重要的现实意义。但是，海陆种间杂交分离群体中基因渐渗的进程主要受到遗传累赘的限制。回交是打破连锁累赘的有效手段，但是传统的回交手段需要较长的时间，且效果不是很理想，借助分子标记可以加速这个过程，并提高选择地准确性。染色体片段替换系，它仅在置换片段上发生分离，有效地减少了遗传背景的干扰，是QTL定位和优异基因聚合的优良材料。自从番茄上建立第一个染色体片段替换系后，植物导入系的构建进入了高速发展期。到目前为止，番茄、水稻、玉米、小麦、油菜等作物培育了各自的染色体片段导入系。棉花的基因组大，遗传基础复杂，培育棉花导入系的难度比较大。培育棉花的片段导入系将有利于把不同有利基因导入到目标改良亲本中去，借助于分子标记辅助选择，实现有利外源基因转移和聚合，同时消除与目标基因连锁的遗传累赘。同时，建立染色体片段导入系的过程就是轮回亲本得到改良的过程。通常轮回亲本都是生产上应用的优良品种，有目的的将包含优良基因的特定染色体片段导入系转育到需要改良的品种，可以弥补原品种的缺点，培育新品种直接参加品比试验或在生产上试种。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种海岛棉染色体片段D4-1，所述片段能显著提高陆地棉黄萎病抗性。
本发明的另一目的是提供一种海岛棉染色体片段D4-1的分子标记及引物序列，利用其能够大大提高棉花抗病育种的选择效率及育种速度。
本发明的另一目的还在于海岛棉染色体片段D4-1的应用。
本发明还提供了一种利用海岛棉染色体片段D4-1培育能显著提高黄萎病抗性的陆地棉导入系的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种能提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段D4-1，所述海岛棉染色体片段D4-1来自于海岛棉H7124，位于棉花染色体组的D4号染色体，通过11对SSR标记：NAU3392，NAU3791，cgr6409，JESPR220，NAU5294，NAU7290，ZHX5，ZHX6，ZHX29，ZHX31，ZHX45标记；以海岛棉品种H7124的DNA为模板，使用所述11对SSR标记同时对海岛棉品种H7124的DNA扩增，同时含有11个SSR标记目的条带的染色体片段即为海岛棉H7124的染色体片段D4-1；所述11个SSR标记引物序列及其扩增片段长度如下：
NAU3392：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增目的片段长度为370bp；
NAU3791：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增目的片段长度为230bp；
cgr6409：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增目的片段长度为620bp；
JESPR220：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增目的片段长度为230bp；
NAU5294：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，扩增目的片段长度为460bp；
NAU7290：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12，扩增目的片段长度为230bp；
ZHX5：正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14，扩增目的片段长度为350bp；
ZHX6：正向引物序列为SEQ ID NO.15，反向引物序列为SEQ ID NO.16，扩增目的片段长度为250bp；
ZHX29：正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18，扩增目的片段长度为310bp；
ZHX31：正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20，扩增目的片段长度为200bp；
ZHX45：正向引物序列为SEQ ID NO.21，反向引物序列为SEQ ID NO.22，扩增目的片段长度为440bp。
本发明还公开了海岛棉染色体片段D4-1的分子标记，所述分子标记分别为NAU3392，NAU3791，cgr6409，JESPR220，NAU5294，NAU7290，ZHX5，ZHX6，ZHX29，ZHX31，ZHX45，各分子标记的引物序列及其扩增目的条带的长度如下：
NAU3392正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为370bp；
NAU3791正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为230bp；
cgr6409正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为620bp；
JESPR220正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为230bp；
NAU5294正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为460bp；
NAU7290正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为230bp；
ZHX5正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为350bp；
ZHX6正向引物序列为SEQ ID NO.15，反向引物序列为SEQ ID NO.16，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为250bp；
ZHX29正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为310bp；
ZHX31正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为200bp；
ZHX45正向引物序列为SEQ ID NO.21，反向引物序列为SEQ ID NO.22，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为440bp；
另一方面，还公开了海岛棉染色体片段D4-1上的SSR标记引物，所述标记引物的序列为：
SSR标记NAU3392正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
SSR标记NAU3791正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4；
SSR标记cgr6409正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6；
SSR标记JESPR220正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8；
SSR标记NAU5294正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10；
SSR标记NAU7290正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12；
SSR标记ZHX5正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14；
SSR标记ZHX6正向引物序列为SEQ ID NO.15，反向引物序列为SEQ ID NO.16；
SSR标记ZHX29正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18；
SSR标记ZHX31正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20；
SSR标记ZHX45正向引物序列为SEQ ID NO.21，反向引物序列为SEQ ID NO.22。
一种利用海岛棉染色体片段D4-1培育能显著提高黄萎病抗性的陆地棉导入系的方法，包括如下步骤：
(1)以陆地棉苏棉8号为母本，海岛棉H7124为父本杂交，杂交后代用苏棉8号回交产生BC1，次年将BC1播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择BC1的抗病单株，与苏棉8号回交产生BC2，次年将BC2播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择BC2的抗病单株，与苏棉8号回交产生BC3，连续回交，鉴定产生BC6，BC6再自交2代，产生BC6F2；
(2)种植BC6F2产生植株，取幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA作为模板，用所述的11对SSR标记为引物，进行PCR扩增，所述11对SSR标记在海岛棉H7124基因组中扩增的特异条带分子量分别是：370bp，230bp，620bp，230bp，460bp，230bp，350bp，250bp，310bp，200bp，440bp，选择同时包含11个分子标记特异条带的染色体片段即为海岛棉染色体片段D4-1，包含该片段的BC6F2单株为苏研VR025；
(3)对导入系苏研VR025的黄萎病性抗性进行鉴定，通过与苏棉8号和海岛棉H7124的黄萎病性抗性进行对比，导入系苏研VR025抗黄萎病性远高于苏棉8号并且接近于海岛棉H7124，说明海岛棉H7124的染色体片段D4-1赋予导入苏研VR025较高的黄萎病抗性。具体鉴定方法为：将含有海岛棉染色体片段D4-1的导入系苏研VR025分别于2012年和2013年种植于江苏省农业科学院黄萎病病圃，每年种植3行，每行15棵，同时种植苏棉8号和海岛棉H7124，于幼苗期和花铃期调查导入系苏研VR025、苏棉8号和H7124的抗病性。调查结果为2012年幼苗期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为17.2，60.2和4.3；花铃期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为12.5，54.9和3.3。2013年幼苗期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为21.6，64.9和6.8；花铃期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为18.6，51.8和5.3。同时于2012年和2013年在温室接种黄萎病菌，导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124各种植20株于纸杯中，待植株两叶一心时撕掉纸杯底达到伤根目的，同时接种黄萎病菌，四周后调查导入系对黄萎病的抗性，最终得出海岛棉染色体片段D4-1能够提高棉花对黄萎病的抗性。
所述的海岛棉片段D4-1在提高棉花对抗黄萎病抗性过程中的作用。
所述的分子标记在筛选海岛棉片段以提高棉花抗黄萎病育种过程中的作用。
所述的分子标记引物在筛选海岛棉片段以提高棉花抗黄萎病育种过程中的作用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将海岛棉H7124染色体片段导入陆地棉品种苏棉8号，培育的新品系在保持苏棉8号的品质和产量水平上，抗病性显著提高。因此，本研究开发的染色体片段D4-1在今后棉花抗黄萎病育种过程中具有重要应用价值。
(2)本发明所提供的了一个能显著提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段D4-1，含有该片段的陆地棉导入系苏研VR025经过2年在病圃及温室抗病鉴定，显著提高其对黄萎病的抗性。因此陆地棉导入系苏研VR025中包含的海岛棉染色体片段D4-1能够应用于棉花分子育种，极大的提高陆地棉对黄萎病的抗性，提高棉花抗病育种的效率。
(3)本发明所提供的一个能显著提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段D4-1的11个标记及其引物序列，利用其能够大大提高棉花抗病育种的选择效率及育种速度。分子标记辅助目标片段选择，具有早期鉴定，快速鉴定以及准确性和稳定性高的特点，能够加快棉花新品种培育的进程。
附图说明
图1是本发明11对海岛棉染色体片段D4-1上分子标记在海岛棉H7124、苏研VR025和苏棉8号基因组中扩增的目的条带；
图中，泳道1、2、3分别代表海岛棉H7124、苏研VR025和苏棉8号，箭头所示为海岛棉H7124中扩增的目的条带。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
1.试验材料
本实验所用的陆地棉苏棉8号(轮回亲本)以及海岛棉品种H7124(受体亲本)有江苏省农业科学院引进，多年严格自交繁殖保纯。
2.试验方法
2.1提取基因组DNA的方法
种植抗病BC6F2、苏棉8号和海岛棉品种H7124种子长成植株，在各供试材料中随机选择5株，取未展开叶片混合，用于基因组DNA的提取。提取基因组DNA的方法为：
(1)将5g冻叶(或鲜叶)放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。分2次加入10ml新鲜配制的提取缓冲液(表1)，转入50ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min。4000rpm离心20min(4℃)，弃上清；
(2)于沉淀中加入15ml 65℃预热的裂解缓冲液(表2)，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65℃水浴30min；
(3)加入15ml氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)混合液，翻转50次以上，4000rpm离心20min(15℃)，将上清转入50ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，4000rpm，离心10min(室温)，弃上清，于沉淀中加入2ml 70％的乙醇洗涤，并转入10ml的离心管中，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；
(4)加3ml TE缓冲液(PH＝8.0，1.0M Tris-HCl溶液2.5ml和0.5M EDTA溶液0.5ml混匀，蒸馏水定容至250ml灭菌)溶解，65℃培养10～30min，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；
(5)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，10000rpm离心5min。弃上清液，加2ml 70％乙醇洗DNA小团，10000rpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min；
(6)加3ml TE缓冲液溶解，65℃培养10～30min；
(7)加5μl RNAase A(10mg/ml)，37℃温育30～60min。加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，体积比)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，10000rpm离心10min；
(8)上清液转入10ml离心管中，加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次；
(9)将絮状沉淀挑入加有800μl 70％乙醇的1.5ml的离心管中，10000rpm离心5min。弃上清液，自然通风干燥DNA小团；
(10)加200μl TE缓冲液[10mM Tris/HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)]溶解DNA(4℃，1～2天)，-20℃保存。
(11)以5μl北京天根100bp DNA Ladder作为对照，将DNA依次稀释5倍，10倍和20倍，通过1％琼脂糖凝胶电泳，确定DNA的浓度、纯度以及完整性。
(12)根据提取DNA的浓度，用TE将DNA稀释至20ng/μl工作液，混匀备用。
表1 DNA提取缓冲液配方
表2裂解缓冲液配方
2.2 PCR方法
(1)所用试剂及主要仪器
PCR反应所用Taq酶和dNTPs均购自北京天为时代公司，PAGE胶所用试剂包括丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，Tris-碱，硼酸，硝酸银，氢氧化钠，TEMED等试剂从剑纯生物科技公司采购。主要仪器包括东胜牌PCR仪，Eppendor高速冷冻离心机，水浴锅，摇床和北京六一仪器厂生产的电泳槽和电泳仪。
(2)PCR反应体系及扩增程序
PCR反应体系见表3。
表3 PCR反应体系
PCR反应在东胜牌PCR仪上进行，反应程序为：
电泳溶液配制：
扩增产物采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶浓度9％，电泳缓冲液为0.5×TBE，180V恒压电泳1.5～2小时。
9％PAGE胶：43.5g丙烯酰胺，1.5g甲叉丙烯酰胺，100ml 5×TBE，加蒸馏水定容至500ml，4℃保存。
10％过硫酸铵：10g过硫酸铵溶解在100ml蒸馏水中，4℃保存。
上样缓冲液：0.25g溴酚蓝+0.25g二甲苯氰+40g蔗糖，蒸馏水定容至100ml。
5×TBE：54g Tris-碱，27.5g硼酸，0.5M EDTA(PH＝8.0)20ml，蒸馏水定容至1L，室温保存。
染色液：1g硝酸银+500ml蒸馏水。
显色液：7.5g氢氧化钠+750μL甲醛+500ml蒸馏水。
凝胶制备及电泳过程：
(1)用清水将玻璃板、胶条和梳子洗净，晾干备用。
(2)将玻璃板、胶条和梳子按要求安装好，并用1％的琼脂糖凝胶封底，待凝胶凝固，将其固定在电泳槽上。
(3)在锥形瓶中倒入已经配制好的9％的PAGE胶，加入10％AP和TEMED，迅速灌胶，灌满后插入梳子，15-20分钟后，拔出梳子，准备电泳。
(4)电泳前在PCR扩增产物中加入2μL上样缓冲液，拔掉梳子，将电泳缓冲液(1X TBE)加入正负极电泳槽中，缓冲液高度要超过短玻璃板，每个点样孔上样2μL，180V恒压电泳1.5～2小时。到蓝色指示标记距胶下面2cm即可停止，小心拆开玻璃板去除凝胶，并对凝胶进行标记。
染色及显色过程：
(1)固定：将拆下来的凝胶放入固定液中(10％乙醇+0.5％冰乙酸)12min，
(2)染色：固定结束后，将固定液到出去，将染色液倒入(0.2％硝酸银水溶液)，12min后，蒸馏水漂洗3次。
(3)显色：1.5％氢氧化钠+0.4％甲醛加入，摇晃，到胶片上条带显示清楚即可结束，适倒掉显色液，用自来水冲洗4次，将胶片放置在灯箱上拍照。
2.3黄萎病抗性鉴定
(1)病菌培养
本研究所用黄萎病菌为BP2，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。
25℃下，将大丽轮枝菌BP2涂布于固体土豆培养基(马铃薯200g、琼脂17g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)表面，两周后转移到液体土豆培养基(马铃薯200g、蔗糖20g、蒸馏水1000ml)中，室温下振荡培养5天，测孢子浓度，将浓度稀释至5×107个孢子/ml。
(2)接种方法
将处理好的棉花种子播于温室中的营养钵中，一钵两粒，待棉株长到两叶一心时，进行营养钵撕底，以达到伤根的目的。对各材料分别用黄萎病病菌的分生孢子悬浮液进行接种，每营养钵10ml。接种后，关闭温室门窗，每天定期喷水两次，保持室内的温度和湿度以利于发病。一周将营养钵中死苗全部拔除，定期观察棉苗发病情况。
(3)鉴定方法
11个分子标记(NAU3392，NAU3791，cgr6409，JESPR220，NAU5294，NAU7290，ZHX5，ZHX6，ZHX29，ZHX31，ZHX45)在海岛棉H7124基因组中扩增的特异条带分子量分别是：370bp，230bp，620bp，230bp，460bp，230bp，350bp，250bp，310bp，200bp，440bp(图1)。选择同时包含该片段的单株(见表4)。通过标记鉴定，我们确定BC6F2单株苏研VR025可扩增出11个分子标记的目的片段，即苏研VR025包含了海岛棉染色体片段D4-1。
表4 D4-1染色体片段上的SSR分子标记及其序列
苏研VR025自交产生F2：3，分别于2012年和2013年种植于江苏省农业科学院黄萎病病圃，每年种植3行，每行15棵，同时种植苏棉8号和海岛棉H7124，于幼苗期和花铃期调查导入系苏研VR025、苏棉8号和H7124的抗病性。同时于2012年和2013年在温室接种黄萎病菌，导入系VR025、苏棉8号和海岛棉H7124各种植20株于纸杯中，待植株两叶一心时撕掉纸杯底达到伤根目的，同时接种黄萎病菌，四周后调查导入系对黄萎病的抗性。具体鉴定方法参考Ning(Ning et al，.2013)的方法。其中五级分类的标准如表5所示。分级标准为，0级：健株，无病叶，生长正常；1级：棉株四分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；2级：棉株四分之一以上，二分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；3级：棉株二分之一以上，四分之三以下叶片发病，变黄萎蔫；4级：棉株四分之三以上叶片发病，或棉株枯死。根据鉴定结果，计算病指。
表5棉花苗期抗黄萎病鉴定分级标准
病指＝[∑(Ni×i)/(N×4)]×100；i＝0～4，Ni＝每级植株个数。
调查结果为2012年幼苗期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为17.2，60.2和4.3；花铃期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为12.5，54.9和3.3。2013年幼苗期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为21.6，64.9和6.8；花铃期导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为18.6，51.8和5.3。同时于2012年和2013年在温室接种黄萎病菌，导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124各种植20株于纸杯中，待植株两叶一心时撕掉纸杯底达到伤根目的，同时接种黄萎病菌，四周后调查导入系对黄萎病的抗性。调查结果为2012年导入系苏研VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为18.5，63.8和9.3；2013年导入系VR025、苏棉8号和海岛棉H7124的病指分别为24.5，70.1和11.6(见表6)。具体地，含有该染色体片段的陆地棉导入系在病圃中鉴定结果为：幼苗期黄萎病病指为17.2-21.6，花铃期黄萎病病指为12.5-18.6；在温室接种黄萎病BP2后鉴定结果为：18.5-24.5，显著低于陆地棉受体对照品种苏棉8号的病指。本发明海岛棉染色体片段及其分子标记应用于棉花抗黄萎病分子育种，能极大地提高棉花对黄萎病的抗性，提高棉花的育种效率。
表6导入系苏研VR025在不同环境中抗病表现
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.能提高陆地棉黄萎病抗性的海岛棉染色体片段D4-1，其特征在于，所述海岛棉染色体片段D4-1来自于海岛棉H7124，位于棉花染色体组的D4号染色体，通过11对SSR标记：NAU3392，NAU3791，cgr6409，JESPR220，NAU5294，NAU7290，ZHX5，ZHX6，ZHX29，ZHX31，ZHX45标记；以海岛棉品种H7124的DNA为模板，使用所述11对SSR标记同时对海岛棉品种H7124的DNA扩增，同时含有11个SSR标记的目的条带的染色体片段即为海岛棉H7124的染色体片段D4-1；所述11个SSR标记引物序列及其扩增片段长度如下：
NAU3392：正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，扩增目的片段长度为370bp；
NAU3791：正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，扩增目的片段长度为230bp；
cgr6409：正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，扩增目的片段长度为620bp；
JESPR220：正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，扩增目的片段长度为230bp；
NAU5294：正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，扩增目的片段长度为460bp；
NAU7290：正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12，扩增目的片段长度为230bp；
ZHX5：正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14，扩增目的片段长度为350bp；
ZHX6：正向引物序列为SEQ ID NO.15，反向引物序列为SEQ ID NO.16，扩增目的片段长度为250bp；
ZHX29：正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18，扩增目的片段长度为310bp；
ZHX31：正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20，扩增目的片段长度为200bp；
ZHX45：正向引物序列为SEQ ID NO.21，反向引物序列为SEQ ID NO.22，扩增目的片段长度为440bp。
2.海岛棉染色体片段D4-1的分子标记，其特征在于，所述分子标记分别为NAU3392，NAU3791，cgr6409，JESPR220，NAU5294，NAU7290，ZHX5，ZHX6，ZHX29，ZHX31，ZHX45，各分子标记的引物序列及其扩增目的目标条带的长度如下：
NAU3392正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为370bp；
NAU3791正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为230bp；
cgr6409正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为620bp；
JESPR220正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为230bp；
NAU5294正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为460bp；
NAU7290正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为230bp；
ZHX5正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为350bp；
ZHX6正向引物序列为SEQ ID NO.15，反向引物序列为SEQ ID NO.16，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为250bp；
ZHX29正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为310bp；
ZHX31正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为200bp；
ZHX45正向引物序列为SEQ ID NO.21，反向引物序列为SEQ ID NO.22，在海岛棉H7124基因组中扩增目的片段长度为440bp；
3.海岛棉染色体片段D4-1上的SSR标记引物，其特征在于：所述标记引物的序列为：
SSR标记NAU3392正向引物序列为SEQ ID NO.1，反向引物序列为SEQ ID NO.2；
SSR标记NAU3791正向引物序列为SEQ ID NO.3，反向引物序列为SEQ ID NO.4；
SSR标记cgr6409正向引物序列为SEQ ID NO.5，反向引物序列为SEQ ID NO.6；
SSR标记JESPR220正向引物序列为SEQ ID NO.7，反向引物序列为SEQ ID NO.8；
SSR标记NAU5294正向引物序列为SEQ ID NO.9，反向引物序列为SEQ ID NO.10；
SSR标记NAU7290正向引物序列为SEQ ID NO.11，反向引物序列为SEQ ID NO.12；
SSR标记ZHX5正向引物序列为SEQ ID NO.13，反向引物序列为SEQ ID NO.14；
SSR标记ZHX6正向引物序列为SEQ ID NO.15，反向引物序列为SEQ ID NO.16；
SSR标记ZHX29正向引物序列为SEQ ID NO.17，反向引物序列为SEQ ID NO.18；
SSR标记ZHX31正向引物序列为SEQ ID NO.19，反向引物序列为SEQ ID NO.20；
SSR标记ZHX45正向引物序列为SEQ ID NO.21，反向引物序列为SEQ ID NO.22。
4.权利要求1所述的海岛棉片段D4-1在提高棉花对黄萎病抗性过程中的作用。
5.权利要求2所述的分子标记在筛选海岛棉片段以提高棉花抗黄萎病育种过程中的作用。
6.权利要求3所述的分子标记引物在筛选海岛棉片段以提高棉花抗黄萎病育种过程中的作用。
7.利用权利1所述的海岛棉染色体片段D4-1培育能显著提高黄萎病抗性的陆地棉导入系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以陆地棉苏棉8号为母本，海岛棉H7124为父本杂交，杂交后代用苏棉8号回交产生BC1，次年将BC1播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择BC1的抗病单株，与苏棉8号回交产生BC2，次年将BC2播于病圃，每个病圃同时播种苏棉8号，在花铃期前选择BC2的抗病单株，与苏棉8号回交产生BC3，连续回交，鉴定产生BC6，BC6再自交2代，产生BC6F2；
(2)种植BC6F2产生植株，取幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA作为模板，用所述的11对SSR标记为引物，进行PCR扩增，所述11对SSR标记在海岛棉H7124基因组中扩增的特异条带分子量分别是：370bp，230bp，620bp，230bp，460bp，230bp，350bp，250bp，310bp，200bp，440bp，选择同时包含11个分子标记特异条带的染色体片段即为海岛棉染色体片段D4-1，包含该片段的BC6F2单株为苏研VR025；
(3)对导入系苏研VR025的黄萎病性抗性进行鉴定，通过与苏棉8号和海岛棉H7124的黄萎病性抗性进行对比，导入系苏研VR025抗黄萎病性能远高于苏棉8号并且接近于海岛棉H7124，说明海岛棉H7124的染色体片段D4-1赋予导入系苏研VR025较高的黄萎病抗性。
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