CN112997796A

CN112997796A - 茶树自交育种的方法

Info

Publication number: CN112997796A
Application number: CN202110253218.8A
Authority: CN
Inventors: 韦朝领; 郭锐; 刘升锐; 朱俊彦; 夏小波; 密孝增; 谢汇; 张友泽; 王朝霞
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2021-06-22

Abstract

本发明提供一种茶树自交育种的方法，包括：在茶树开花前期，在茶园搭建防虫网大棚，大棚内只保留一个茶树品种；在茶树开花时期，在大棚内配置蜜蜂，利用蜜蜂进行自花授粉，并利用SSR和InDel分子标记进行自交后代的鉴定。本发明提供的基于隔离网室的蜂传授粉方法，即利用隔离网室将用于自交的亲本茶树与外界昆虫和花粉隔离条件下，借助蜜蜂传粉进行自交而不需要人工授粉和套袋。通过这种方法不仅节约了人工成本，而且极大地提高了授粉效率和自交率。此外，利用实验室前期筛选的高多态性且稳定的分子标记进行子代鉴定，保证了自交后代的真实性，此后可以通过多代自交获得纯合系和自交系，为茶树新品种选育提供新的种质资源。

Description

茶树自交育种的方法

技术领域

本发明涉及植物遗传育种和分子生物学领域，具体地说，涉及一种茶树自交育种的方法。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是一种具有很高经济价值的多年生木本植物，虽然其雌雄同体、花期较长，但由于茶树在有性生殖过程中存在自交不亲和性(Self-incompatibility，SI)，从而导致了其高度的杂合性。这种许多显花植物中普遍存在的现象是植物在长期进化过程中形成的一种促进异交，保持遗传变异，避免自交，防止近亲繁殖，从而能保证物种连续性的一种重要机制。虽然自交不亲和性对保持遗传多样性至关重要，但也导致了茶树高度杂合的基因组，严重阻碍了茶树自交系的发展。前期研究发现，不同的茶树品种以及雌蕊的不同发育阶段自交亲和性有较大差异，利用自交授粉可以增加后代的纯合性，自交系的创制将有助于加速茶树遗传研究与育种。

传统自交育种采用的均为人工授粉，需要准备花粉、授粉、套袋以及后期摘袋等工序，过程中会对茶树的花朵形成多重损伤，可能会导致授粉花朵脱落，影响结实率。此外，由于茶树自交结实率较低，利用人工授粉需要花费大量的人力物力，从而导致育种成本增加。

现有的种质鉴定技术主要包括形态学鉴定和分子标记鉴定。形态学标记主要为树体特性，如叶型、叶色、树势等以及结合一些生理特性，但是可利用的形态标记较少，易受环境影响，在子代鉴定上有较大的误差和不确定性。随着现代分子标记技术的建立与成熟，为子代真实性的早期鉴定提供了更加准确而高效的方法，但是大多操作过程繁琐，并且会涉及一些毒性试剂，因此不适合安全高效的鉴定工作。因此，如何高效的进行自交育种，获得更多的自交种质，进而创制茶树自交系，成为目前的主要目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种茶树高效自交育种的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种茶树高效自交育种的方法，所述方法包括：在茶树开花前期，在茶园搭建防虫网大棚，大棚内只保留一个茶树品种；在茶树开花时期，在大棚内配置蜜蜂，利用蜜蜂进行自花授粉，并进行自交后代的鉴定。

本发明利用SSR和InDel共8个分子标记对自交种进行鉴定，用于扩增SSR和InDel标记的8对引物分别如SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16所示。

具体方法包括以下步骤：

(1)自交亲本的选择：结合前期大田试验统计结果选择花期长、结实率较高的品种作为育种目标；

(2)防虫网大棚的搭建：在茶树开花前期，在茶园搭建一个防虫网大棚，大棚内只保留一个茶树品种；

(3)田间管理：选择好亲本后，在春茶过后，不再对目标茶树进行修剪，增施磷钾肥(一般认为氮、磷、钾含量比例为2∶1∶1较为适宜)；待大棚内的茶树开花前期，对对茶树下部老叶烂叶进行清理，并适时修剪；

(4)蜂传授粉：在茶树开花时期，在大棚内放置蜂巢，利用蜜蜂进行自花授粉；

(5)自交后代的鉴定：利用SSR和InDel分子标记结合高通量毛细管电泳检测技术鉴定自交种。

前述的方法，茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的行距为1.2-1.5米。

优选地，防虫网大棚的长度10米，宽度4.5米，高度2.5米，防虫网的孔目为80目，防虫网材质为尼龙纱帐。

前述的方法，步骤(4)中蜂巢放置时间为每年10月中旬，根据蜂场养殖经验，每个蜂巢放置蜜蜂约8000头。

优选地，大棚内配置的蜂种为中华蜜蜂。中华蜜蜂是我国独有的当家蜂种，是以杂木树为主的森林群落及传统农业的主要传粉昆虫，有利用零星蜜源植物、采集力强、利用率较高、采蜜期长及适应性、抗螨抗病能力强，消耗饲料少等其它蜂种所无法比拟的优点，非常适合中国山区定点饲养。若替换为其它蜂种(如意大利蜂)，可能不太适应传粉，导致授粉效率下降。

前述的方法，步骤(5)包括：次年待茶果成熟发褐时，采摘茶果除皮后晾晒，后期播种于育苗圃，待茶籽发芽长成幼苗时单棵移栽至资源圃，并利用SSR和InDel分子标记结合高通量毛细管电泳检测技术鉴定自交种。

进一步地，步骤(5)包括如下子步骤：

1)利用改良的CTAB法(Clarke，J.D.(2009)Cetyltrimethyl Ammonium Bromide(CTAB)DNA Miniprep for Plant DNA Isolation.Cold Spring Harb Protoc，pp.5177)提取亲本和子代幼苗的基因组DNA；

2)以1)提取的DNA为模板，利用8对引物进行PCR扩增；

3)利用毛细管电泳检测技术检测PCR扩增产物，根据电泳带型判定子代是否为自交种。

优选地，PCR反应体系为：DNA模板1-1.2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×TaqPlus Master Mix 5μL，用ddH₂O补齐至10μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。

本发明中，茶树品种优选舒茶早。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明将单个茶树品种进行防虫网隔离繁殖，防止茶树其他品种的异花授粉，保证其自花授粉。

(二)本发明极大改善了人工自花授粉工作量大、且对茶树花朵的伤害性大等缺点，利用在防虫网大棚内进行蜜蜂传粉的方法，免去了挂牌、套袋、人工授粉、摘袋等复杂工序，有效降低工作成本。

(三)本发明采用的SSR和InDel分子标记鉴定方法，具有稳定性好、准确率高的特点。进一步通过结合使用Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对于子代鉴定的结果更加精确、快速、简单、高效。

(四)茶树蜂传授粉所得的子代再利用高质量的分子标记进行鉴定，剔除可疑的子代，这样能够确保所收获的自交种准确率达到100％。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中自交授粉隔离网室结构设计示意图。

图2为本发明较佳实施例中实验基地中自交授粉隔离网室外部实景图。

图3为本发明较佳实施例中实验基地中自交授粉隔离网室内部实景图。

图4为本发明较佳实施例中随机挑选的24份子代基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。

图5为本发明较佳实施例中提供的8个高质量分子标记对亲本和子代PCR产物的Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳胶图。

具体实施方式

为获得大量茶树自交种质，从而加速育种进程，本发明提供的一种茶树高效自交育种方法，主要采用防虫网大棚配以蜜蜂授粉为主，利用蜜蜂的生活特性，对茶树花粉进行多次自花传粉，解决现有技术中茶树自交方法存在结实率低、成本高、自交育种效率较低的问题，利用特异性分子标记鉴定子代为辅，解决自交后代存在的不确定性。

本发明提供如下技术方案：

一种茶树高效自交育种的方法，包括以下步骤：

(1)用于自交亲本的选择：在茶树资源圃选择开花多、结实率高的茶树品种；

(2)隔离网室设计与搭建：在茶树开花前期，搭建一个包围了防虫网的大棚，大棚内只保留一个茶树品种；

(3)田间管理：选择好亲本后，在春茶过后，不再对目标茶树进行修剪，增施磷钾肥，一般认为氮、磷、钾含量比例为2∶1∶1较为适宜，对于幼年茶园，生长势差的茶园可适当提高氮肥。待大棚内的茶树开花前期，对较茂密的茶树下部老叶烂叶进行清理，修剪去无效分枝以增加其通风性，适时修剪，促进树体成型，茶树现蕾期可适当梳去部分弱蕾，保留饱满健壮的花蕾；

(5)自交后代的鉴定：次年待茶果成熟发褐时，采摘茶果除皮后晾晒，后期播种于育苗圃，待茶籽发芽长成幼苗时单棵移栽至资源圃；利用芯片毛细管电泳检测技术鉴定子代的真伪并剔除可疑子代。

优选地，步骤(1)中茶树亲本筛选可选择具有特殊抗性、特殊优点的优良品种，同时保证水肥充足，不进行芽叶采摘。茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的株距1.2-1.5米。

优选地，步骤(2)中隔离网室采用热浸镀锌钢管，拐角处结合热浸镀锌连接管，根据茶树密度以及蜜蜂的飞行习惯，隔离网室设置为长度10米，宽度4.5米，高度2.5米，大棚全包围防虫网，使用抱箍、卡槽、卡簧、扎丝等固定，防虫网底部用泥土封严实，防止蜜蜂钻出以及外界蜜蜂和昆虫进入，防虫网一侧设置供放蜂用的进出口拉链。根据前期对茶树花粉粒径大小的研究，结合防虫网的通风透光性，将防虫网的孔目设置为80目。

优选地，步骤(4)中的蜂巢放置时间约为每年10月中旬，每个蜂巢放置蜜蜂(蜂种为中华蜜蜂)约8000头，待大棚内花期结束，授粉完成后，回收蜂巢，撤去防虫网，该网可进行重复利用。

优选地，步骤(5)中利用CTAB法提取亲本和子代的基因组DNA，均稀释至30-50ng/μL。使用实验室前期筛选的稳定性好、多态性高的SSR和InDel标记对稀释后的DNA进行PCR扩增，所述8个引物对的序列如SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ IDNO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16。

进一步地，PCR反应体系为：DNA模板1μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×Taq PlusMaster Mix(Dye)5μL，ddH₂O 3μL。其中，Taq Plus Master Mix来自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2849M。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

优选地，步骤(5)中通过毛细管电泳检测技术检测PCR产物，根据电泳带型判定待鉴定的子代是否为自交种。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1茶树高效自交育种的方法

本实施例提供一种茶树高效自交育种的方法(高效获得茶树自交种质的方法)，包括以下步骤：

1、自交亲本的选择：在安徽农业大学郭河茶树品种与资源圃(31°25′N，117°09′E)中选择开花多、结实率高并且自交结实率较高的5年生国家级茶树良种舒茶早(Camelliasinensis var.sinensis‘Shuchazao’)作为自交育种的亲本。授粉前后保证水肥充足，不进行芽叶采摘。茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的株距1.2-1.5米。

2、隔离网室设计与搭建：9月中旬，在舒茶早开花前期，在苗圃中部圈出一块宽4.5米、长10米的茶树，隔离网室内保留舒茶早茶树40株，清除周围1米内的茶树，只保留茶树品种舒茶早，再搭建防虫网大棚。防虫网大棚采用热浸镀锌钢管，拐角处结合热浸镀锌连接管，根据茶树密度以及蜜蜂的飞行习惯，隔离网室设置为长度10米，宽度4.5米，高度2.5米，大棚全包围防虫网，防虫网的孔目设置为80目，防虫网网套底部用泥土封严实，防止蜜蜂钻出，网套上设置供放蜂用的进出口拉链。防虫网罩好后，仔细检查是否有破洞或底部未压实情况，保证网室的封闭性(图1～图3)。

3、田间管理：在春茶过后，不再对舒茶早茶树进行修剪，增施磷钾肥，一般认为氮、磷、钾含量比例为2∶1∶1较为适宜，对于幼年茶园，生长势差的茶园可适当提高氮肥。待防虫网搭建完成后，进入大棚内对较茂密的茶树下部老叶烂叶进行清理，修剪去无效分枝以增加其通风性，适时修剪，促进树体成型，茶树现蕾期适当梳去部分弱蕾，保留饱满健壮的花蕾。

4、蜂传授粉：10月中旬，在舒茶早开花时期，在防虫网大棚内放置一个蜜蜂蜂巢，内部保留适当的蜂蜜，蜂巢内放置蜜蜂8000头(蜂种为中华蜜蜂)，利用蜜蜂进行自花传粉，每隔15天观察大棚内蜜蜂状态，适当添补蜜蜂。12月下旬，待舒茶早花期结束，撤去防虫网。

5、自交后代的鉴定：约次年10月下旬至11月初，待大棚内舒茶早植株上的茶果成熟发褐时，采摘茶果除皮后晾晒，后期将茶籽播种于育苗圃，待茶籽发芽长成幼苗时单棵移栽至资源圃。具体步骤如下：

(1)基因组DNA提取：采集大棚内2株舒茶早亲本、舒茶早周围的茶树品种(铁观音、福鼎大白茶、安徽3号、凫早2号、迎霜、中茶108、桂红3号、尧山秀绿、名山白毫131和鄂茶5号)各1株以及125份资源圃内子代幼苗的组织，利用改良的CTAB法提取基因组DNA。①称取0.1g茶树组织放入预冷的研钵中，迅速加入液氮研磨，直至样品材料成粉末状。加700μLCTAB提取液(提前预热至65℃)，加10μLβ-巯基乙醇，65℃水浴15min，每隔5min上下摇匀6-8次。②加600μL氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)，12000rpm离心10min。取上清液500μL于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，上下摇匀6-8次，12000rpm离心5min，弃上清。③加500μL的70％乙醇，将底部沉淀吹打混匀，12000rpm离心5min，弃上清。重复一次步骤③。④打开离心管盖放入通风橱吹干剩余乙醇，加入100μL灭菌水混匀待用。

(2)DNA样品检测与稀释：以NanoDrop 2000(ThermoScientific)核酸测定仪对DNA的质量和浓度进行检测确认，并用1.5％琼脂糖凝胶对随机挑选的24份样品DNA进行凝胶电泳，检测其DNA质量，电泳结果见图4。结果显示，DNA条带清晰，适用于基因分型研究。然后统一稀释至30-50ng/μL。

(3)PCR扩增：选择实验室前期筛选的4个SSR标记和4个InDel标记(表1)。共10uLPCR扩增体系：Taq Mix酶5μL，ddH₂O 3μL，DNA模板1μL，上、下游引物各0.5μL。离心后加入20μL矿物油封住。其中，Taq Plus Master Mix来自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2849M。PCR扩增程序设为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸5min。

表1用于扩增8个标记的引物序列

(4)毛细管电泳：①Gel：40mL dsDNA 800Separation Gel中加2μL的Intercalating Dye，充分混匀。②930dsDNA Inter Buffer：将5×Inter Buffer稀释5倍。③Capillary conditioning solution：将5×Capillary conditioning solution稀释5倍，在96孔板里分别加入1mL Capillary conditioning solution，避免出现气泡。④Marker：在96孔板里分别加入30μL 35bp-500bp Markers，各孔加入20μL Mineral oil封住，离心。⑤样品制备：在96孔板中每个孔里加20μL Dilution buffer和3μL PCR产物，最后一个孔加入24μL 35-500bp Range DNA Ladder，离心避免出现气泡。实验中试剂均来自DNF-900 35-500bp试剂盒。将所有配制好的试剂放入仪器指定位置，运行程序(Fragment Analyzer^TM96，USA)。

(5)毛细管电泳结果分析：使用PROSize^TM 2.0软件来展示毛细管电泳结果，见图5。若子代在8个标记扩增后所获得的峰图均与亲本舒茶早一致，则认定为自交种；若所获得的峰图与舒茶早不一致，则认定为非自交种，后期应剔除对应植株。

6、实验结果与讨论：隔离网罩内共获得种子782粒，平均每株舒茶早茶树结实19.55粒。通过对所得子代、亲本以及亲本周围的茶树品种进行毛细管电泳后的胶图和峰图进行仔细比对，分别统计出特异性等位位点，由于Fragment Analyzer ^TM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此引物对样品所扩增出的条带误差在±3bp。结果显示：舒茶早周围的茶树品种在8个分子标记扩增后的条带表现出高度特异性，并且没有任何品种与舒茶早条带完全一致。舒茶早在标记CsL15扩增后的条带为128和135bp；在标记CsL52扩增后的条带为203和213bp；在标记CsL69扩增后的条带为298和326bp；在标记CsL76扩增后的条带为208和214bp；在标记CsInDel03扩增后的条带为332和351bp；在标记CsInDel08扩增后的条带为216和241bp；在标记CsInDel09扩增后的条带为205和226bp；在标记CsInDel37扩增后的条带为228bp。在误差允许范围内，125份子代DNA在这8个标记扩增后的条带与舒茶早完全一致的共有58份，用“★”表示(图3)，自交子代真实率为46.4％。剔除剩余可疑的子代后，真实的舒茶早自交后代将用于后期自交系的创制。可见，利用上述8对引物可以精确地将子代与舒茶早亲本以及隔离网室周围的茶树品种进行区分，从而达到鉴定子代的效果。

从实验结果来看，虽然获得的后代种子远低于自然界杂交种子，但是相对于人工自交授粉，已经达到了高效获得茶树自交种质的标准。由于鉴定的自交子代真实率低于理论值，因此在后续的育种实践工作中，可以适当提高防虫网的目数，降低外界花粉或较小的昆虫进入隔离网罩的几率，提高自交子代真实率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 茶树自交育种的方法

<130> PI202110682

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataacttgga tttttgaacg cct 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atagtagtta tggtggtggc gtg 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgaaatca ggccaaaatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcatagcag accaacgact 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggtttctt agaggggata 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggagacaat ggaggtaatg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacccacaca gtagaccaga 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaaccacgag atgaagaaga 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggagtccaa ccgtcaatgt t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtccaggca tcccaacaat t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agacaactcc gggtaatgga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcttgtggt tcttcaggta 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttgtgcag tttgggagtt g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggttgaggtt gaggttgagg t 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagcaggcaa attcagcaac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taacctttga tggcctgcaa 20

Claims

1.茶树自交育种的方法，其特征在于，所述方法包括：在茶树开花前期，在茶园搭建防虫网大棚，大棚内只保留一个茶树品种；在茶树开花时期，在大棚内配置蜜蜂，利用蜜蜂进行自花授粉，并进行自交后代的鉴定；

利用SSR和InDel共8个分子标记对自交种进行鉴定，用于扩增SSR和InDel标记的8对引物分别如SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ IDNO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(3)田间管理：选择好亲本后，在春茶过后，不再对目标茶树进行修剪，增施磷钾肥；待大棚内的茶树开花前期，对对茶树下部老叶烂叶进行清理，并适时修剪；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的行距为1.2-1.5米。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，防虫网大棚的长度10米，宽度4.5米，高度2.5米，防虫网的孔目为80目，防虫网材质为尼龙纱帐。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中蜂巢放置时间为每年10月中旬，蜂巢中放置蜜蜂8000头。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，大棚内配置的蜂种为中华蜜蜂。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)包括：次年待茶果成熟发褐时，采摘茶果除皮后晾晒，后期播种于育苗圃，待茶籽发芽长成幼苗时单棵移栽至资源圃，并利用SSR和InDel分子标记结合高通量毛细管电泳检测技术鉴定自交种。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(5)包括如下子步骤：

1)利用改良的CTAB法提取亲本和子代幼苗的基因组DNA；

2)以1)提取的DNA为模板，利用8对引物进行PCR扩增；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为：DNA模板1-1.2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×Taq Plus Master Mix 5μL，用ddH₂O补齐至10μL；

PCR反应程序为：94-95℃预变性3-5min；94℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，茶树品种为舒茶早。