CN116814838B - 一种高效获得茶树杂交种质的育种方法与子代鉴定的特异分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效获得茶树杂交种质的育种方法与子代鉴定的特异分子标记及其应用，属于分子生物学和茶树育种技术领域。育种方法包括以下步骤：(1)杂交亲本的选择：(2)网室的搭建：(3)蜂传授粉：(4)杂交子代的获得：目标亲本茶树茶籽成熟时，分别收取两个亲本的茶籽，并按照正常生产管理进行育苗和栽植，即得。有益效果：本发明基于上述人工杂交的缺点发明了“网室+蜜蜂”茶树杂交育种方法。且“网室+蜜蜂”茶树杂交育种的方法相较于人工杂交育种更为高效且降低成本，并且可以同时获得以两种亲本互为父母本的正、反交子代，对茶树遗传理论研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和茶树育种技术领域，具体涉及一种高效获得茶树杂交种质的育种方法与子代鉴定的特异分子标记及其应用。
背景技术
茶树育种在科学研究和产业发展中具有重要作用。目前，茶树新品种获得的主要方式之一为杂交育种，即具有遗传背景差异的亲本，通过授粉受精的方式将遗传物质传递给子代，经过基因的自由组合，使双亲的遗传物质在子代中重新组合排列，形成多个不同类型的基因型，从而为选育新优品种提供丰富的遗传材料。人工杂交是茶树杂交育种的主要方法，但是人工对茶树进行授粉效率低且结实率低，导致我国现有茶树杂交遗传群体较小、遗传群体代数极低(几乎没有F2代)、杂交组合少、育种效率低等问题，进而导致茶树的农艺和品质性状遗传规律和机制研究进展缓慢、重大品种数量少，因此茶树高效杂交技术亟待突破。
蜜蜂授粉杂交技术已在枣树、棉花等植物中具有研究。茶树花属于虫媒花，在自然状态下就通过昆虫进行授粉，蜜蜂采粉时从一朵花转移到另一朵花时授粉便随之完成，且同一花朵会被多次重复传粉，柱头有多次机会进行授粉，从而增加了授粉的成功率；同时，由于茶树具有自交的可能性以及为了预防日常管理人员进出网室或者其它意外导致外源花粉串粉等引起的假子代，所以需要对其子代进行真伪鉴定。现有技术的缺陷和不足：
①人工杂交费时、费力、损伤花器官，这些不利因素导致茶树授粉效果不佳、结实率低，对后期茶树性状的遗传研究非常不利；
②在现有技术中会种植一个用于杂交茶园，但是茶树属于多年生木本植物，新茶园至少需要等待两三年才能够进行杂交，前期投入的花费多以及耗时长导致很多育种专家还是采用人工杂交的方式；
③蜜蜂授粉网室孔目的大小需要确定可以隔离外界并且网室内通风透气，孔目太大不能阻挡外界花粉进入网室内，太小又导致网室内不够通风，现有技术中并未有针对孔目大小是否可行的说明，此孔目大小的可行性需要在后期子代真伪鉴定中得出结论；
④作为一种新的茶树杂交育种方式，理应对其所得子代进行真伪鉴定才能够证实此方法的可行性，那么分子标记技术可以鉴定子代的真伪，但是需要针对不同的品种有其特异的标记，由于茶树相关研究较少，现有技术中并未有针对黄金叶与中茶102两种茶树品种的特异分子标记。
公布号为CN109315284 A的中国专利申请文献，公开了一种设施虫媒茶树杂交方法，包括以下步骤：(1)茶树盆栽，选取目标茶树亲本进行无性繁育盆栽，期间进行整修修建，栽培至2龄树体；(2)简易大棚，搭建一个防风、防雨、防虫的简易大棚；待到茶树开花期间，将需要杂交的茶树亲本盆栽移入大棚内；(3)虫媒授粉，使用蜜蜂、熊蜂或其他虫媒进行虫媒进行授粉。该茶树杂交方法对茶树杂交工作有减少工作量、减少劳动力投入、避开不利天气因素、提高工作效率，且大棚设施、盆栽亲本可多年重复使用，可有效降低工作成本。但该专利并未对所得子代进行真伪鉴定，且并未提及针对黄金叶与中茶102两种茶树品种的特异分子标记。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种快速鉴定茶树杂交子代的真伪的方法以及如何高效获得茶树杂交种质的育种方法。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
本发明的第一方面提出一种用于茶树杂交子代真伪鉴定的特异InDel分子标记INS-10引物，所述特异InDel分子标记INS-10引物为：
上游引物：GAACTTGGAGCTTAGAGTG；(SEQ ID NO:9)
下游引物：GATTATGAAGAGGGATTGAC。(SEQ ID NO:10)。
有益效果：本技术利用毛细管电泳技术筛选特异SSR标记，并结合全基因组数据开发特异InDel标记鉴定杂交子代真伪，实现了茶树杂交子代真伪的快速鉴定，为高效创制茶树种质的分子育种提供重要依据和支撑。
本发明的第二方面提出上述特异分子标记INS-10引物在鉴定黄金叶与中茶102杂交子代真伪中的应用。
本发明的第三方面提出一种高效获得茶树杂交种质的育种方法，包括以下步骤：
(1)杂交亲本的选择：在正常栽培茶园中，根据育种目标选择两个用于杂交的亲本茶树品种，并确保无杂株；
(2)网室的搭建：在目标亲本茶树开花前，搭建一个全封闭的防虫网室，网室内保留目标亲本的两个茶树品种；
(3)蜂传授粉：目标亲本茶树开花时期，在网室内放置蜂巢，每个蜂巢内放置中华蜜蜂7000-9000只；
(4)杂交子代的获得：目标亲本茶树茶籽成熟时，分别收取两个亲本的茶籽，并按照正常生产管理进行育苗和栽植，即得。
有益效果：本专利利用“网室+蜜蜂”茶树杂交育种的方法在现有茶园中进行杂交，可以同时获得以两种亲本互为父母本的正、反交子代，所以相较于人工杂交育种更为高效且成本很低。
优选的，所述步骤(2)中防虫网室的材料为尼龙纱帐。
优选的，所述步骤(2)中防虫网室的孔目为80目。
优选的，所述步骤(3)中蜜蜂为中华蜜蜂。
优选的，所述步骤(3)中蜂巢的个数按照蜜蜂在网室内的密度为71只/m3计算。
本发明的第四方面提出一种茶树杂交子代真伪的鉴定方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA提取：采集网室内目标亲本的两个茶树以及其正、反交F1代幼苗组织，利用试剂盒法提取基因组DNA；
S2：DNA样品检测与稀释：以NanoDrop 2000(ThermoScientific)核酸测定仪对DNA的质量和浓度进行检测确认，然后统一稀释至35-40ng/μL；
S3：PCR扩增：在4个SSR标记和1个InDel标记中，分别选择3对SSR标记与1对InDel标记对正、反交子代进行验证，PCR扩增体系如下：5μL 2×Taq Master Mix，1μL DNA模板，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物和3μL ddH2O；所述InDel标记的引物序列如上述特异分子标记INS-10引物序列所示；
S4：Fragment AnalyzerTM毛细管电泳：
将所有配制好的试剂放入仪器(Fragment AnalyzerTM96，USA)指定位置，运行相应程序即可，得到样品的电泳结果；
S5：毛细管电泳结果分析：使用PROSizeTM2.0软件来展示毛细管电泳结果，若杂交子代在4个标记扩增后所获得的峰图有1对标记显示其同时出现父母本峰图，且无其他明显主峰，则认定为杂交种；若所获得的峰图与亲本不一致，则认定为非杂交种。
说明：SSR标记和InDel标记分子标记是根据茶树品种开发的特异的标记，SSR标记已在下列文献中发表：
1.Shengrui Liu,Yanlin An,Fangdong Li,et.al.Genome-wide identificationof simple sequence repeats and development of polymorphic SSR markers forgenetic studies in tea plant(Camellia sinensis)[J].Molecular Breeding,2018,38(5):1-13；
2.姜燕华.我国茶树地方品种遗传多样性及人为选择影响的研究[D].北京：中国农业科学院，2010；
3.Tan Li-Qiang,Wang Li-Yuan,Wei Kang,et.al.Floral transcriptomesequencing for SSR marker development and linkage map construction in the teaplant(Camellia sinensis)[J].Plos one,2013,8(11):1-12)；
InDel标记是本课题组根据黄金叶与中茶102基因组信息开发的特异标记。
优选的，所述步骤S3中4个SSR标记分别为CsL52、CsL68、A180和FM1081。
优选的，所述步骤S4中的试剂均来自DNF-900 35-500bp试剂盒。
本发明的优点在于：
(1)本发明基于上述人工杂交的缺点发明了“网室+蜜蜂”茶树杂交育种方法。且“网室+蜜蜂”茶树杂交育种的方法相较于人工杂交育种更为高效且降低成本，并且可以同时获得以两种亲本互为父母本的正、反交子代，对茶树性状的遗传机理解析具有重要意义。并且在本发明实际案例中，利用黄化叶色茶树品种‘黄金叶’与正常叶色茶树品种‘中茶102’进行“网室+蜜蜂”杂交授粉后，获得大量叶色不同黄化程度的F1代群体，为茶树黄化性状的遗传机制研究提供重要遗传材料；
(2)本发明网室内配置的蜂种为中华蜜蜂。中华蜜蜂是我国独有的当家蜂种，是以杂木树为主的森林群落及传统农业的主要传粉昆虫，有利用零星蜜源植物、采集力强、利用率较高、秋季采蜜期长及适应性、抗螨抗病能力强，消耗饲料少等其它蜂种所无法比拟的优点，非常适合中国山区定点饲养。若替换为其它蜂种(如意大利蜂)，可能不太适应在种植密度较大的成年茶树间以及秋季传粉，导致授粉效率下降(蜜蜂的数量是根据蜂场养殖经验所规定；网室的孔目大小是为了外界花粉无法进入网室内，但又保持了通风效果而定)；
(3)本发明是在现有栽培茶园中进行杂交，不需要前期茶园的建设等一系列费时费力的工作，仅需对茶园进行正常的水肥管理以及修剪即可；在此基础上，由于蜜蜂授粉杂交技术初次利用在茶树中，并且茶树具有自交的可能性(茶树具有自交不亲和性)，所以需要对此方式所得杂交遗传群体进行真伪鉴定。目前对于植物真伪鉴定的分子标记技术主要为RAPD、SSR等，但由于茶树杂交群体较难获得，相关研究较少。所以，本技术利用毛细管电泳技术筛选特异SSR标记，并结合全基因组数据开发特异InDel标记鉴定杂交子代真伪，本发明将为高效创制茶树种质的分子育种提供重要依据和支撑。
附图说明
图1为本发明实施例1网室大棚平面示意图；
图2为本发明实施例1网室大棚田间示意图；
图3为本发明实施例1网室大棚内蜜蜂授粉示意图；
图4为本发明实施例1正、反交子代茶苗田间示意图；
图5为本发明实施例1标记CsL52毛细管电泳中‘黄金叶’峰图；
图6为本发明实施例1标记CsL52毛细管电泳中‘中茶102’峰图；
图7为本发明实施例1标记CsL52毛细管电泳中鉴定为真实子代的峰图；
图8为本发明实施例1中25份正交子代毛细管鉴定结果图；
图9为本发明实施例1中InDel标记的设计示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供一种茶树高效杂交育种的方法(高效获得茶树杂交种质的方法)，包括以下步骤：
1、杂交亲本的选择：在安徽省宣城麻姑山茶树种质资源圃(北纬30.98°，东经118.93°)中选择8年生黄化叶色新品系‘黄金叶’以及正常叶色国家级品种‘中茶102’互为父母本，作为杂交育种的亲本，正交组合(“黄金叶×中茶102”)和反交组合(“中茶102×黄金叶”)。
2、搭建隔离网室：9月中旬在中茶102与黄金叶开花前期搭建宽9m、长15m、高2.5m的隔离网室，网室内保留两种茶树品种各100株(根据栽培茶园可视情况改变网室大小与茶树株数)。网室使用尼龙纱帐防虫网全包围覆盖防虫网，防虫网的孔目设置为80目，并且关键位置使用抱箍、卡槽、卡簧、扎丝等固定防止脱落，防虫网底部使用泥土全面覆盖封严实，防止蜜蜂钻出，网套上设置供放蜂用的进出口拉链。防虫网设置好后需仔细检查是否有破洞或底部未压实情况，保证网室的封闭性。
3、蜂传授粉：待防虫网搭建完成，茶树开花前期进入网室内，可适当梳去部分弱蕾，保留饱满健壮的花蕾。10月中旬开花时期，在防虫网网室内放置保留适当蜂蜜的65×44.5×35.5cm的蜂巢，每个蜂巢内放置中华蜜蜂约8000只，保证网室内每71/m3只中华蜜蜂进行授粉，每隔3天观察网室内蜜蜂状态，并适当添补蜜蜂。12月下旬，待花期结束，撤去蜂巢及防虫网(可重复使用)。
4、杂交子代的获得：次年10月至11月待茶籽成熟发褐时，分别采摘中茶102与黄金叶所结茶籽，作为正交与反交材料；对茶籽进行晾晒除皮后分别播种于安徽农业大学郭河茶树种质与资源圃的育苗圃中。待茶籽培育成苗后，对F1代群体植株进行编号：正交子代为正F1-1、正F1-2、正F1-3等，反交子代为反F1-1、反F1-2、反F1-3等挂牌标记。
5、杂交子代的鉴定：
(1)基因组DNA提取：采集网室内‘黄金叶’与‘中茶102’以及其正、反交F1代幼苗组织，利用试剂盒法提取基因组DNA。
(2)DNA样品检测与稀释：以NanoDrop 2000(ThermoScientific)核酸测定仪对DNA的质量和浓度进行检测确认，然后统一稀释至35-40ng/μL。
(3)InDel标记的筛选：根据黄金叶与中茶102基因组数据中InDel位点信息，选取不同差异片段大小InDel位点，并取位点侧翼100bp序列，利用blast的方法进行目标变异位点的拷贝数分析，结果表明多数位点为基因组中的多拷贝位点，筛选出单拷贝位点并设计引物。之后应用琼脂糖电泳或毛细管电泳对标记的PCR扩增产物进行分析，依据子代片段大小判断标记此标记是否可行。InDel标记的设计示意图如图9所示。
(4)PCR扩增：实验室前期共筛选4个SSR标记和1个InDel标记(表2)，从中分别选择3对SSR标记与1对InDel标记对正、反交子代进行验证，PCR扩增体系如下：
表1PCR扩增反应体系
其中，Taq Plus Master Mix来自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2849M。由于本实验采用96孔板进行PCR扩增，则需在加完反应体系且离心后加入20μL矿物油进行封层防止蒸发。
PCR扩增程序如下：
表2用于扩增5个标记的引物序列
(5)Fragment AnalyzerTM毛细管电泳：
毛细管电泳实验中试剂均来自DNF-900 35-500bp试剂盒。将所有配制好的试剂放入仪器(Fragment AnalyzerTM96，USA)指定位置，运行相应程序即可，，每次可得到95个样品的电泳结果。
(5)毛细管电泳结果分析：使用PROSizeTM2.0软件来展示毛细管电泳结果，若杂交子代在4个标记扩增后所获得的峰图有1对标记显示其同时出现父母本峰图(图5)，且无其他明显主峰，则认定为杂交种；若所获得的峰图与亲本不一致，则认定为非杂交种，后期应剔除对应植株。
6、实验结果与讨论：隔离网罩内分别获得正、反交F1代茶籽14224和2194颗，平均每株黄金叶茶树结实142粒，中茶102结实22粒；育出茶苗各8091和710株。之后对所得幼苗子代与亲本茶树品种进行毛细管电泳后的毛细管电泳结果的胶图和峰图进行比对(图5、6)(注：Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此引物对样品所扩增出的条带误差在±3bp)。
CsL52、A180、FM1081、INS-10用于正交子代的鉴定，CsL52、CsL68、A180、INS10标记用于反交子代的鉴定。结果显示：在误差允许范围内，鉴定了270株正交子代中235株至少在一对标记中得到验证，占87.04％，即真实子代90株反交子代中78株至少在一对标记中得到验证，占86.6％，即真实子代。可见，利用特异的标记可以精确地将子代进行真伪鉴定。
从实验结果来看，茶树“网室+蜜蜂”杂交技术的构建所获得的子代数量远高于人工杂交授粉，且杂交过程不消耗人力物力，达到了高效获得茶树杂交种质的标准。并且在杂交过程中网室的密封性把控严格、蜜蜂的数量把控到位，对后期杂交子代真伪鉴定结果具有良好的影响，因此在后续的育种实践工作中，可以注意以下几点：一是目标亲本需确定是否有无杂株，并及时清理；二是茶树前期可以进行适当修剪茶树、施肥等工作；三是必须在茶树开花前期搭建好牢固密封的网室，降低外界花粉进入隔离网罩防止其他杂种的产生；四是蜜蜂品种很多，但是有些传粉性很差，为了保证授粉的效果应当采用强授粉性蜜蜂，例如中华蜜蜂。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种用于茶树杂交子代真伪鉴定的特异InDel分子标记INS-10引物，其特征在于，所述特异InDel分子标记INS-10引物为：
上游引物：GAACTTGGAGCTTAGAGTG； （SEQ ID NO:9）
下游引物：GATTATGAAGAGGGATTGAC（SEQ ID NO:10）。
2.权利要求1所述的特异InDel分子标记INS-10引物在鉴定黄化叶色茶树品种‘黄金叶’与正常叶色茶树品种‘中茶 102’杂交子代真伪中的应用。
3.一种茶树杂交子代真伪的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：基因组DNA提取：采集网室内目标亲本的两个茶树以及其正、反交F1代幼苗组织，利用试剂盒法提取基因组DNA；所述目标亲本的两个茶树为黄化叶色茶树品种‘黄金叶’与正常叶色茶树品种‘中茶 102’；
S2：DNA样品检测与稀释：以NanoDrop 2000 (ThermoScientific)核酸测定仪对DNA的质量和浓度进行检测确认，然后统一稀释至35-40 ng/μL；
S3：PCR扩增：采用3个SSR标记：CsL52、A180、FM1081和1个如权利要求1所述的InDel分子标记INS-10对正交子代进行验证；采用3个SSR标记：CsL52、CsL68、A180和1个如权利要求1所述的InDel分子标记INS-10对反交子代进行验证，PCR扩增体系如下：5μL2×Taq MasterMix，1μLDNA模板，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物和3μLddH2O；
S4：Fragment Analyzer™毛细管电泳：
将配制好的试剂放入仪器（Fragment Analyzer™ 96，USA）指定位置，运行相应程序即可，得到样品的电泳结果；
S5：毛细管电泳结果分析：使用PROSize™ 2.0软件来展示毛细管电泳结果，若杂交子代在4个标记扩增后所获得的峰图有1对标记显示其同时出现父母本峰图，且无其他明显主峰，则认定为杂交种；若所获得的峰图与亲本不一致，则认定为非杂交种。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S3中PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S4中的试剂均来自DNF-90035-500 bp试剂盒。
6.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述CsL52的上游引物序列、下游引物序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述CsL68的上游引物序列、下游引物序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
8.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述A180的上游引物序列、下游引物序列分别如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示。
9.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述FM1081的上游引物序列、下游引物序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示。
10.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤S3中采用96孔板进行PCR扩增。
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