CN113355448A

CN113355448A - 一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记及其应用

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Publication number: CN113355448A
Application number: CN202110779936.9A
Authority: CN
Inventors: 徐娟; 刘园; 张海朋; 李莉; 蒋友武; 张红艳
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113355448B

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了用于扩增所述InDel分子标记的引物，包括正向引物和反向引物，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明提供的分子标记为鉴别广陈皮与陈皮提供了有效的分子工具，利用本发明可以简便高效地鉴定广陈皮与陈皮，整顿行业乱象，对陈皮产业的规范和稳定发展具有重要意义。

Description

一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记，本发明还涉及该分子标记的引物以及一种鉴定茶枝柑的方法。

背景技术

陈皮为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，具理气健脾、燥湿化痰、疏肝利胆等多种功效^[1]。在《中国药典》中已明确注明由广东新会地区广泛种植的茶枝柑(C.reticulata‘Chachi’)制成的为广陈皮，而由其他品种如大红袍(C.reticulata‘Dahongpao’)、温州蜜柑(C.reticulata‘Unshiu’)、福橘(C.reticulata‘Tangerina’)等制成的为陈皮^[2]。目前普遍认为广陈皮具有比普通陈皮品质更好^[3]。

广陈皮作为广东省十大道地药材之一，应用范围广泛，且药食同源，具有优良的食用价值。作为地理标志保护产品，新会广陈皮为当地创造和带动了极大的产业发展和经济创收。然而由于广陈皮与普通陈皮具有相似的外观特征，且在炮制后无法经肉眼进行区分，导致以次充好现象，严重扰乱市场秩序，但目前尚无辨别广陈皮真伪的标准，故亟需开发一种简单有效的技术手段。

分子标记技术如SCoT、SSR、ISSR等已应用于柑橘种质资源遗传多样性评价和遗传图谱构建等工作^[4,5,6]，但针对茶枝柑及广陈皮的分子标记数量有限，尚无相关报道用于区分广陈皮与普通陈皮的InDel分子标记，且目前已知的其他分子标记，如SCoT分子标记^[4]和ISSR分子标记^[7]等，PCR扩增结果均会出现多态性条带，其区分结果不如InDel分子标记简单明晰。

参考文献：

[1]刘玉芳,温志佳,邹婉霞,等.南药广陈皮道地性研究进展[J].中药材,2019,(08):249-253.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].中国医药科技出版社,2015.

[3]Duan L,Guo L,Dou L L,et al.Discrimination of Citrus reticulataBlanco and Citrus reticulata'Chachi'by gas chromatograph-mass spectrometrybased metabolomics approach[J].Food Chemistry,2016,212(dec.1):123-127.

[4]席秀利,黄海波,楼步青,等.SCoT分子标记对茶枝柑及近缘种遗传多态性分析[J].中草药,2018,(10):2426-2431.

[5]李映志.宽皮柑橘(Citrus reticulate Blanco)的遗传多样性及系统发育研究[D].华中农业大学,2006.

[6]席秀利.茶枝柑及近缘种的分子鉴别研究[D].广州中医药大学,2017.

[7]邓锋,林向华,梁蔚阳.利用ISSR分子法标记鉴别新会茶枝柑[J].广东药学院学报,2012,28(004):396-399.

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记，该标记可用于区分广陈皮和陈皮，与其它标记相比，InDel标记具有简单明晰等优点。本发明还提供用于扩增该标记的引物以及鉴定茶枝柑的方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的InDel分子标记在鉴定茶枝柑中的应用，该标记可区分广陈皮和陈皮。

用于扩增权利要求1所述InDel分子标记的引物，包括正向引物和反向引物，核苷酸序列如下：

11S-50-Ind6F：GTTTTATTTAGTTTCTTGAATTGCA(SEQ ID NO:2)

11S-50-Ind6R：ATGTAAACTAAATTGAAATTCAATA(SEQ ID NO:3)

一种鉴定茶枝柑的方法，包括以下步骤：

1)提取样品总DNA；

2)以样品总DNA为模板，利用权利要求3所述的引物进行PCR扩增；

3)对扩增产物进行检测，若扩增产物仅有一条250bp条带，则样品为茶枝柑；若扩增产物有/没有250bp条带且有其它条带，则为其它柑橘样品，从而区分广陈皮和陈皮。

优选地，步骤2)中所述PCR扩增的体系为，5μL 2×Phanta Max Buffer，0.2μLdNTP Mix，0.2μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，0.4μL DNA模板，3.4μL ddH₂O。

优选地，步骤2)中所述PCR扩增的程序为：在95℃下预变性5min；再95℃下变性30s，56℃下退火15s，72℃下延伸15s，35个循环；最后72℃下延伸10min，共进行两轮PCR反应，第一轮扩增完成后以PCR产物为第二轮PCR扩增体系的DNA模板，采用相同的PCR扩增体系进行第二轮PCR扩增，第二轮扩增完成后PCR产物保持于4℃下待用。

本发明的有益效果是：申请人利用该标记验证了共72个宽皮柑橘类样品，发现通过扩增该标记能特异性地将茶枝柑与其它宽皮柑橘类进行区分，而且产物条带单一，结果清晰明了，能更好地用于鉴别广陈皮和陈皮及其真伪。

附图说明

图1：茶枝柑分子标记毛细管电泳图。

图2：不同宽皮柑橘品种InDel分子标记毛细管电泳图，图A为样品B1-B22；图B为样品B23-B45；图C为样品B46-B58。

图3：广陈皮(GCP)与陈皮(CP)的InDel分子标记凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

1.材料与方法

1.1材料与试剂

高保真酶(Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase)及PCR试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd.)。

PCR引物由天津擎科生物技术有限公司(Tsingke Biotechnology Co.,Ltd.)合成。

72个宽皮柑橘类样品的品种信息如表1所示。用改良CTAB法^[5]分别提取各柑橘样品的DNA，其中茶枝柑、年橘以及大红袍的DNA被用于筛选InDel。

广陈皮与陈皮样品来源于广东新会等地的市售商品，用本实验方法分别提取其DNA。

表1. 72个宽皮柑橘样品的品种信息

1.2实验方法

1.2.1 InDel引物设计及筛选

根据茶枝柑、年橘以及大红袍3个宽皮柑橘品种的基因组重测序数据，设计特异的高质量引物对，选取的位点均为50bp左右的大片段插入/缺失的位点，采用primer 5.0软件在插入/缺失位点的上下游设计引物。然后对InDel标记引物对进行有效性筛选。最终筛选出一对能区分茶枝柑和其它宽皮柑橘品种的分子InDel引物11S-50-Ind6，其核苷酸序列5’-3’分别为：

11S-50-Ind6F：GTTTTATTTAGTTTCTTGAATTGCA

11S-50-Ind6R：ATGTAAACTAAATTGAAATTCAATA

该引物对以茶枝柑DNA为模板进行PCR扩增时，PCR产物经毛细管电泳检测仅能得到一条约250bp的条带；而以其他宽皮柑橘品种材料为DNA模板进行PCR扩增时，绝大部分品种会得到一条300bp的条带，少数品种会得到包括200bp、250bp、300bp在内的多个条带。

其中茶枝柑特异的约250bp核苷酸序列为：

GTTTTATTTAGTTTCTTGAATTGCAAACAAAATATATATATTTTTTAATTTTCATGCGGTAGATTTTAGGTCTTGTGGCTTAATTTTTAGAATATGACATCCCATTTTTTTTTTTAATTGGTTTAGTTGCTTGAAATTTTCAAACCGCATAATTTGTTTTTTATTATCACTTGAAGCTTCAATTACACAATTATTGAACTATAGATTTGAATCTCGCTCGTATCAATATTGAATTTCAATTTAGTTTACAT(SEQ ID NO:1)

1.2.2 PCR扩增及毛细管电泳分析方法

10μL PCR扩增体系为：5μL 2×Phanta Max Buffer，0.2μL dNTP Mix，0.2μLPhanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，0.4μLDNA模板，3.4μL ddH₂O。反应程序为：在95℃下预变性5min；再95℃下变性30s，56℃下退火15s，72℃下延伸15s，35个循环；最后72℃下延伸10min。共进行两轮PCR反应，第一轮扩增完成后以PCR产物为第二轮PCR扩增体系的DNA模板，采用相同的PCR扩增体系进行第二轮PCR扩增。第二轮扩增完成后PCR产物保持于4℃下待用。

按照以上PCR扩增后，使用QIAcel Advanced毛细管电泳仪对PCR产物进行毛细管电泳。保存电泳图片。

2.实验结果

2.1不同茶枝柑样品的分子标记扩增结果

对14份茶枝柑材料提取DNA，采用分子标记引物11S-50-Ind6分别对其进行扩增，然后进行毛细管电泳，结果如图1所示。所有茶枝柑DNA模板均有且仅能扩增出一条约250bp的条带，表明茶枝柑DNA在该分子标记位点处稳定纯合，不会出现其他杂带。

2.2不同宽皮柑橘品种的分子标记扩增结果

由图2所示，对于上述59种宽皮柑橘样品，仅茶枝柑能特异扩增一条单独的250bp条带，剩余58种材料中有55种材料能扩增出约300bp的条带，B26、B29、B30中虽不能扩增出300bp的条带，但有200bp的条带，能与茶枝柑明显区分。

2.3广陈皮与陈皮的分子标记扩增结果

由图3所示，广陈皮与陈皮样品的分子标记扩增结果与2.2部分结果一致，广陈皮样品能特异扩增出一条250bp左右的条带，而陈皮样品均扩增出300bp的条带，表明该分子标记能对广陈皮和陈皮进行有效区分。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttttattta gtttcttgaa ttgcaaacaa aatatatata ttttttaatt ttcatgcggt 60

agattttagg tcttgtggct taatttttag aatatgacat cccatttttt tttttaattg 120

gtttagttgc ttgaaatttt caaaccgcat aatttgtttt ttattatcac ttgaagcttc 180

aattacacaa ttattgaact atagatttga atctcgctcg tatcaatatt gaatttcaat 240

ttagtttaca t 251

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttttattta gtttcttgaa ttgca 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtaaacta aattgaaatt caata 25

Claims

1.一种用于鉴定茶枝柑的InDel分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的InDel分子标记在鉴定茶枝柑中的应用，所述InDel分子标记可区分广陈皮和陈皮。

3.用于扩增权利要求1所述InDel分子标记的引物，包括正向引物和反向引物，核苷酸序列如下：

11S-50-Ind6F：GTTTTATTTAGTTTCTTGAATTGCA

11S-50-Ind6R：ATGTAAACTAAATTGAAATTCAATA。

4.一种鉴定茶枝柑的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)提取样品总DNA；

3)对扩增产物进行检测，若扩增产物仅有一条250bp条带，则样品为茶枝柑；若扩增产物有/没有250bp条带且有其它条带，则为其它柑橘样品。

5.如权利要求4所述鉴定茶枝柑的方法，其特征在于：步骤2)中所述PCR扩增的体系为，5μL 2×Phanta Max Buffer，0.2μL dNTP Mix，0.2μL Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，0.4μL DNA模板，3.4μL ddH₂O。

6.如权利要求4所述鉴定茶枝柑的方法，其特征在于：步骤2)中所述PCR扩增的程序为：在95℃下预变性5min；再95℃下变性30s，56℃下退火15s，72℃下延伸15s，35个循环；最后72℃下延伸10min，共进行两轮PCR反应，第一轮扩增完成后以PCR产物为第二轮PCR扩增体系的DNA模板，采用相同的PCR扩增体系进行第二轮PCR扩增，第二轮扩增完成后PCR产物保持于4℃下待用。