CN114645044B - 一种与国兰花期相关的ssr分子标记引物及其应用 - Google Patents

一种与国兰花期相关的ssr分子标记引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与国兰花期相关的SSR分子标记引物及其应用。该SSR分子标记引物包括10对SSR引物序列。利用上述SSR引物扩增获得的SSR分子标记可用于国兰种质资源开花时间的鉴定。本发明检测方法在短时间内即可完成不同季节开花的国兰品种鉴定，具有省时、高效、低成本、操作简便等优势，可应用于国兰种质资源或品种的开花时间鉴定及分子辅助育种，对于国兰花期改良育种具有广泛应用价值。

Description

一种与国兰花期相关的SSR分子标记引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记及其检测技术领域，具体涉及一种与国兰花期相关的SSR分子标记引物及其应用。
背景技术
兰科植物拥有高度特化的花器官和丰富的生物多样性，是珍贵的园艺观赏花卉。全世界约有736属28000种(Chase et al.,2015)，按生态习性可分为地生兰、气生兰、腐生兰三大类。其中兰属地生种大多原产中国，因此又称国兰，已有800多年的栽培历史，被列为中国十大名花之一，主要包括建兰、墨兰、春兰、蕙兰、莲瓣兰、豆瓣兰、寒兰和春剑等8大种类。
其中仅有建兰花期较长，植株从每年6月至11月可多次开花，其余7大类国兰每年均只开一次花，难以满足市场常年需求。因此通过中间杂交，选择可开花期跨度大，可一年多次开花的杂交后代，对国兰产业发展具有重要意义。
随着分子生物学技术的发展，基于DNA多态性的分子标记技术逐渐成为生物基因分型、遗传多样性分析、品种鉴定以及分子辅助育种的重要工具。在遗传多样性分析中，传统的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等。得益于高通量测序技术的迅速发展，SSR标记因其在基因组、转录组中分布宽泛，具有多态性丰富，操作便利，共显性且高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物种质资源鉴定和分子辅助育种。然而目前国兰育种仍以传统杂交育种为主，从种子萌发到出瓶移栽需要2-3年时间，随后种苗通常需要经历3年以上童期才能正常开花，因此子代开花性状需经历5-6年时间，育种成本高，周期长，且性状难以预测。本发明提供一种与国兰开花性状相关的SSR荧光标记及其应用，针对当前国兰花期改良的育种过程中，表型鉴定周期长、成本高、易受生长季节和环境影响等一系列问题，提供与国兰花期相关SSR引物并利用这些引物对国兰不同品种进行鉴定，能快速区分不同花期品种。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种与国兰花期相关的SSR分子标记引物及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种与国兰花期相关的SSR分子标记引物，其包括以下10对SSR引物序列：
SSR_23084_c0_g1 F：5'-TTGTTTGCTACAGGTCAGCG-3'
R：5'-TCAGGATGCCTGAAAAATCA-3'
SSR_21692_c0_g1 F：5'-TTCTTTAATGCCATCTCGGC-3'
R：5'-CGCCAACTGGAGTTCTCTTC-3'
SSR_54963_c2_g1 F：5'-ATCGTGCGCAAAATCTCTCT-3'
R：5'-CAGTCACCATCTCCCTCACA-3'
SSR_40348_c2_g1 F：5'-TGCTAAACGATGAAGCATGG-3'
R：5'-GCGCAGTTGCTATTCTACGA-3'
SSR_44302_c3_g1 F：5'-TCAATAAGTCGAGATGCTCCAT-3'
R：5'-CACGAGACAAAATGCTTCCC-3'
SSR_45085_c2_g1 F：5'-TTGATTTCTTTAACAAAATGATGC-3'
R：5'-TGTTGCAATCTAAGATCATTGAAGA-3'
SSR_49600_c0_g3 F：5'-TTGGCTGATGATTGCTCTTG-3'
R：5'-CCACCTGCAGTCCCTAAAGA-3'
SSR_53453_c0_g1 F：5'-TTAAGCAGATAAGATCAACACGG-3'
R：5'-CACTCCAAGGGGTGGTAGAAG-3'
SSR_55630_c0_g1 F：5'-ATCCTACCTGAAAGATGCCAAGA-3'
R：5'-ATCTCTTCTGAAGGTTTTCCAGC-3'
SSR6577 F：5'-GGAACTTGAGCTCCAATTAGAAA-3'
R：5'-GGGCTGAAAGAATAATTCATCTG-3'。
本发明的第二个目的是提供上述的SSR分子标记引物在国兰花期鉴定中的应用。
进一步的，采用引物SSR_44302_c3_g1对国兰进行PCR扩增，夏季开花品种对应的bp数在180-214之间，且扩增曲线为多个峰，秋冬季开花品种中对应的bp数在187-222之间，且扩增曲线为1个峰。
采用引物组合SSR_23084_c0_g1+SSR_54963_c2_g1对国兰进行PCR扩增，夏秋季开花品种中扩增得2个峰，对应的bp数分别为266和278；春季开花品种中扩增得1个峰，对应的bp数为262-264。
采用引物组合SSR6577+SSR_49600_c0_g3对国兰进行PCR扩增，夏秋季开花品种中扩增得2-3个峰，对应的bp数在461-497之间；春季开花品种中扩增得1个峰，对应的bp数为480。
采用引物组合SSR_53453_c0_g1+SSR_55630_c0_g1对国兰进行PCR扩增，夏秋季开花品种中扩增片段在108-122bp之间，而在春季开花的品种中略大，扩增对应的bp数为112-124。
本发明的第三个目的是提供上述的SSR分子标记引物在国兰分子辅助育种中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述的SSR分子标记引物在国兰遗传多样性分析中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种用于鉴定国兰花期的试剂盒，该试剂盒含有上述的SSR分子标记引物。
本发明的第六个目的是提供一种鉴定国兰花期的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以待鉴定材料的DNA作为模板，用上述的SSR分子标记引物中的一种或多种组合进行PCR扩增；
S2：将PCR产物进行凝胶电泳分离成像，根据扩增产物大小及扩增峰数量鉴定国兰花期。
本发明通过转录组测序结果，进一步筛选FT-及其调控的的下游开花相关MADS-box通路相关基因，在相关通路里找到了与开花时间相关的30条unigene，根据unigene里SSR位点分布特点，合成30对SSR引物，通过引物筛选，最终得到了10对多态性较好的位点，并进一步进行验证，最终证明上述SSR引物中5号引物、组合1+3号、7+10号以及8+9号引物的扩增多态性与开花时间性状关联好，获得的SSR分子标记可用于国兰种质资源开花时间的鉴定。本发明检测方法在短时间内即可完成不同季节开花的国兰品种鉴定，具有省时、高效、低成本、操作简便等优势，可应用于国兰种质资源或品种的开花时间鉴定及分子辅助育种，对于国兰花期改良育种具有广泛应用价值。
附图说明
图1为采用引物SSR_23084_c0_g1扩增不同国兰品种的凝胶电泳图。图1中样品编号对应表1中样品序号。
图2为采用本发明的1-5号SSR分子标记引物分别扩增春兰宜春仙品种的扩增峰图。图中编号1-5对应表2中引物序号1-5。
图3为采用本发明的6-10号SSR分子标记引物分别扩增春兰宜春仙品种的扩增峰图。图中编号6-10对应表2中引物序号6-10。
图4为采用引物SSR_44302_c3_g1扩增不同国兰品种的扩增峰图。A、B、C、D分别为春季开花的春兰宜春仙、夏秋季开花的建兰东坡梅，建兰夏皇梅、春季开花的墨兰国华。
图5为采用引物组合SSR_23084_c0_g1+SSR_54963_c2_g1扩增不同国兰品种的扩增峰图。A为夏秋季开花的建兰东坡梅、B为春季开花的春兰宜春仙、C为春季开花的墨兰国华。
图6为采用引物组合SSR6577+SSR_49600_c0_g3扩增不同国兰品种的扩增峰图。A为夏秋季开花的建兰东坡梅、B为夏秋季开花的寒兰神州第一梅、C为春季开花的春兰宜春仙。
图7为采用引物组合SSR_53453_c0_g1+SSR_55630_c0_g1扩增不同国兰品种的扩增峰图。A为夏秋季开花的建兰东坡梅、B为春季开花的春兰宜春仙、C为春季开花的墨兰国华。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、试验材料
2019年7月在广东省农业科学院环境园艺研究所国兰种质资源圃，选取不同季节开花的国兰品种建兰、墨兰、春兰、寒兰、蕙兰共40份，如下表1所示。
表1 40份国兰品种
Figure BDA0003517944290000051
Figure BDA0003517944290000061
/>
Figure BDA0003517944290000071
2、样品准备
取500mg新鲜植物组织样品(健康叶片或花器官)放于1.5mL离心管中，经液氮冷冻后用组织研磨仪研磨成干粉。
3、DNA提取
(1)向装有样品的离心管中加入800μL3×CTAB(确保CTAB中已加入巯基还原剂，浓度为1％)，震荡混匀。
(2)放在65℃的水浴锅中浴热50min，期间每隔10min震荡混匀。
(3)浴热完成后向离心管中加入700μL抽提液(氯仿异戊醇24:1)，震荡混匀，12000rpm离心15min。
(4)取上清液于新的1.5mL的离心管中(避免吸取沉淀)后向离心管中加入等体积的核酸抽提液，震荡混匀，12000rpm离心10min。
(5)取上清液于新的1.5mL的离心管中(避免吸取沉淀)后向离心管中加入等体积的异丙醇，反复颠倒10-20次，-20℃沉淀2h。
(6)12000rpm离心2min，倒掉上清液，留沉淀，加入1mL75％乙醇，静置1min。
(7)12000rpm离心1min，倒掉上清液，留沉淀，加入1mL 75％乙醇，静置1min。
(8)12000rpm离心1min，倒掉上清液，留沉淀，空管12000rpm离心2min。
(9)吸净残液放入通风橱中干燥2-3min，用80-100μL双蒸水溶解沉淀。-20℃保存。
4、PCR扩增
PCR反应体系包括10×PCR Buffer 3μL，2.5mM dNTP 2μL，MgCl2 2μL，Primer A 2μL，Primer B 2μL，Template 1μL，H2O 18μL，Taq酶0.2μL。
PCR反应程序为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
5、琼脂糖凝胶电泳
2.5％琼脂糖凝胶，每孔上样15μL PCR产物，100bp ladder指示，120v跑电泳60min初步筛选多态性引物(以同一引物不同样品扩增的片段大小为指标)(图1)。
6、SSR-PCR及毛细管电泳检测
6.1荧光引物PCR扩增
PCR反应体系总体积为10μL，包括1.2μL DNA模板(50ng/μL)，1.0μL 10×BufferΙ缓冲液，0.1μL TAKARA HS Taq酶(5U/μL)，0.6μL正向引物(5μM)，0.6μL反向引物(5μM)，0.8μL 2.5mM dNTP，0.5μL TP-M13(5μM)，去离子水补足至10μL。
PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；95℃30s，53℃30s，72℃30s，10个循环；60℃30min；4℃保存。
6.2毛细管电泳检测
96孔板中每孔加入扩增产物1.0μL，ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液(体积比0.5:8.5)9μL，95℃变性3min后，上ABI 3730XL检测仪进行检测，1kV电压进样10s，电泳15kV，30min。
7、SSR信息分析
根据转录组测序结果，进一步筛选出开花调控通路相关基因，如FT,TFL1,MADS-box等；已经验证报道的重要的植物开花调控模式。经检索，在相关通路里找到了与花期调控相关的71条unigene(单基因簇，非重复序列)，根据unigene里SSR位点分布特点，合成71对SSR引物，通过引物筛选，最终得到了10对多态性较好的位点(表2)，对40个国兰个体进行验证。
表2筛选出的10对多态性SSR引物
Figure BDA0003517944290000091
Figure BDA0003517944290000101
结果发现，5号及10号引物可明显区分秋季开花和春季开花品种。如5号引物SSR_44302_c3_g1在14个夏季开花个体中对应的bp数在180-214之间，且扩增曲线为多个峰，秋冬季开花个体中对应的bp数在187-222之间，且扩增曲线多为1个峰。采用5号引物SSR_44302_c3_g1扩增40份国兰品种个体的峰值见表3，扩增峰图见图4。
其余引物扩增位点分别在不同程度上对不同季节开花的品种进行了区分。10对引物的扩增峰图如图2和图3所示。
表3 40个体对应的峰值(以引物SSR_44302为例)
Figure BDA0003517944290000102
/>
Figure BDA0003517944290000111
8、引物组合的扩增效果
为了达到更好便捷的区分不同季节开花品种，我们进一步分别对10对的引物进行两两组合。结果发现引物组合SSR_23084_c0_g1+SSR_54963_c2_g1；SSR6577+SSR_49600_c0_g3；SSR_53453_c0_g1+SSR_55630_c0_g1能够更好的区分不同季节开花品种。其中引物SSR_23084_c0_g1+SSR_54963_c2_g1组合在夏秋季开花品种中扩增得两个峰，对应的bp数分别为266和278；春季开花的品种中扩增得单峰，对应的bp数为262-264(图5)。引物SSR6577+SSR_49600_c0_g3组合在夏秋季开花品种中扩增得2-3个峰，对应的bp数在461-497之间；而春季开花品种中扩增得单峰，对应的bp数为480(图6)。引物SSR_53453_c0_g1+SSR_55630_c0_g1组合在夏秋季开花品种中扩增片段在108-122bp之间，而在春季开花的品种中略大，扩增对应的bp数为112-124(图7)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种与国兰花期相关的SSR分子标记引物，其特征在于，包括以下7对SSR引物序列：SSR_23084_c0_g1 F：5'-TTGTTTGCTACAGGTCAGCG-3'
R：5'-TCAGGATGCCTGAAAAATCA-3'
SSR_54963_c2_g1 F：5'-ATCGTGCGCAAAATCTCTCT-3'
R：5'-CAGTCACCATCTCCCTCACA-3'
SSR_44302_c3_g1 F：5'-TCAATAAGTCGAGATGCTCCAT-3'
R：5'-CACGAGACAAAATGCTTCCC-3'
SSR_49600_c0_g3 F：5'-TTGGCTGATGATTGCTCTTG-3'
R：5'-CCACCTGCAGTCCCTAAAGA-3'
SSR_53453_c0_g1 F：5'-TTAAGCAGATAAGATCAACACGG-3'
R：5'-CACTCCAAGGGGTGGTAGAAG-3'
SSR_55630_c0_g1 F：5'-ATCCTACCTGAAAGATGCCAAGA-3'
R：5'-ATCTCTTCTGAAGGTTTTCCAGC-3'
SSR6577 F：5'-GGAACTTGAGCTCCAATTAGAAA-3'
R：5'-GGGCTGAAAGAATAATTCATCTG-3'。
2.权利要求1所述的SSR分子标记引物在国兰花期鉴定中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用引物SSR_44302_c3_g1对国兰进行PCR扩增，夏季开花品种对应的bp数在180-214之间，且扩增曲线为多个峰，秋冬季开花品种中对应的bp数在187-222之间，且扩增曲线为1个峰。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用引物组合SSR_23084_c0_g1+
SSR_54963_c2_g1对国兰进行PCR扩增，夏秋季开花品种中扩增得2个峰，对应的bp
数分别为266和278；春季开花品种中扩增得1个峰，对应的bp数为262-264。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用引物组合SSR6577+SSR_49600_c0_g3对国兰进行PCR扩增，夏秋季开花品种中扩增得2-3个峰，对应的bp数在461-497之间；
春季开花品种中扩增得1个峰，对应的bp数为480。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用引物组合SSR_53453_c0_g1+SSR_55630_c0_g1对国兰进行PCR扩增，夏秋季开花品种中扩增片段在108-122bp之间，而在春季开花的品种中略大，扩增对应的bp数为112-124。
7.权利要求1所述的SSR分子标记引物在国兰分子辅助育种中的应用。
8.权利要求1所述的SSR分子标记引物在国兰遗传多样性分析中的应用。
9.一种用于鉴定国兰花期的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的SSR分子标记引物。
10.一种鉴定国兰花期的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以待鉴定材料的DNA作为模板，用权利要求1所述的SSR分子标记引物进行PCR扩增；
S2：将PCR产物进行凝胶电泳分离成像，根据扩增产物大小及扩增峰数量鉴定国兰花期。
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