CN108060226A - 胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胃溃疡相关易感基因TNF‑α突变检测试剂盒及使用方法，涉及分子生物学和基因检测诊断学技术领域，所述胃溃疡相关易感基因TNF‑α突变检测试剂盒包括用于对待测样品目标区域进行扩增的胃溃疡相关易感基因的特异性引物和所检测的基因位点RS号；所述胃溃疡相关易感基因TNF‑α突变检测试剂盒的使用方法，包括检测体系和检测方法。本发明胃溃疡相关易感基因TNF‑α突变检测试剂盒能同时对rs2294008、rs1143627、rs16944三个基因位点的基因型进行检测，区别于只能对一个样品的某一段区域进行测序的常规Sanger测序法，检测效率高，检测成本低。
Description
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因检测诊断学技术领域，具体涉及一种胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒及使用方法。
背景技术：
胃溃疡是常见病、多发病之一，世界各国人群发病率有显著差异，不同时期、地理、气候、民族、遗传和生活习性等均对胃溃疡的流行病学有一定影响，治疗胃溃疡已成为当今医学研究的热点和难点。
胃溃疡相关易感基因TNF-α为初步研究可能与胃溃疡关联的基因。目前，采用检测胃溃疡易感基因TNF-α的常见方法是Sanger测序法，该方法只能对一个样品的某一段区域进行测序，检测效率低，成本高。
基于此，研究并开发设计一种胃溃疡相关易感基因TNF-α筛突变检测试剂盒及检测方法。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测效率高、检测成本低的胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒及使用方法。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒，包括用于对待测样品目标区域进行扩增的胃溃疡相关易感基因的特异性引物和所检测的基因位点RS号。
所述特异性引物的碱基序列如下：
SEQ ID NO:1F:GCCCTCTCCACCACAGCCCACCAGTGACCA
SEQ ID NO:2R:GAAGGCTGTGCTGCTTGCCCTGTTGATGGC
SEQ ID NO:3F:ATCTGCCAGTTTCTCCCTCGCTGTTTTTAT
SEQ ID NO:4R:GCTTTCAAAAGCAGAAGTAGGAGGCTGAGA
SEQ ID NO:5F:GTCTCTACCTTGGGTGCTGTTCTCTGCCTC
SEQ ID NO:6R:GGAGCTCTCTGTCAATTGCAGGAGCCTCTG；
其中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的检测基因位点RS号为rs2294008，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的检测基因位点RS号为rs1143627，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的检测基因位点RS号为rs16944。
胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒的使用方法，包括检测体系和检测方法。
所述检测体系如下：
所述检测方法的步骤为：
1)使用“康为世纪口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”提取待测样本的基因组DNA；
2)采用特异性引物和检测体系进行荧光定量PCR反应来检测基因位点的基因型；
3)使用Roche Light Cycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪进行扩增。
所述步骤3)中扩增程序为：95℃预变性10min；然后按95℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸30s的程序进行20个循环，每完成一次循环退火温度降低0.5℃，直至55℃，停止降温，之后再进行25个循环；扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行，程序为：升温至95℃1min，然后降温至40℃1min，再升温至65℃1s，从65℃连续升温到95℃的过程中以25次/℃的方式进行荧光收集，最后降温至40℃。
本发明的有益效果是：本发明胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒能同时对rs2294008、rs1143627、rs16944三个基因位点的基因型进行检测，区别于只能对一个样品的某一段区域进行测序的常规Sanger测序法，从而克服了Sanger测序法存在的检测效率低、检测成本高的问题；并且所述溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒的使用方法简单，重复性好，从而适用于胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测。
具体实施方式：
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
1、引物设计
本实施例通过NCBI数据库获得胃溃疡基因TNF-α参考序列及rs2294008、rs1143627、rs16944位点，根据该SNP位点的上下游序列，通过大量研究，设计如下所示扩增引物：
2、引物验证
1)使用“康为世纪口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”提取待测样本的基因组DNA，用上述引物组进行荧光定量PCR反应来检测rs2294008、rs1143627、rs16944位点基因型；
2)所述荧光定量PCR反应体系为：10μl反应体系中包括50ng的基因组、4μl HRMMaster Mix、0.5μl上述引物F(5uM)和0.5μl上述引物R(5uM)，补充dd H2O至10μl。
3)96孔板置于Roche Light Cycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪中，扩增程序为：95℃预变性10min；然后按95℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸30s的程序进行20个循环，每完成一次循环退火温度降低0.5℃，直至55℃，停止降温，之后再进行25个循环。
4)扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行，程序为：升温至95℃1min，然后降温至40℃1min，再升温至65℃1s。从65℃连续升温到95℃的过程中以25次/℃的方式进行荧光收集。最后，降温至40℃。
结果显示，本实施例设计的引物可检测rs2294008、rs1143627、rs16944位点基因型，可用于胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒，其特征在于：包括用于对待测样品目标区域进行扩增的胃溃疡相关易感基因的特异性引物和所检测的基因位点RS号。
2.根据权利要求1所述的胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒，其特征在于，所述特异性引物的碱基序列如下：
其中，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的检测基因位点RS号为rs2294008，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的检测基因位点RS号为rs1143627，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的检测基因位点RS号为rs16944。
3.如权利要求2所述胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒的使用方法，其特征在于：包括检测体系和检测方法。
4.根据权利要求3所述的胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述检测体系如下：
5.根据权利要求3所述的胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述检测方法的步骤为：
1)使用“康为世纪口腔拭子基因组DNA提取试剂盒”提取待测样本的基因组DNA；
2)采用特异性引物和检测体系进行荧光定量PCR反应来检测基因位点的基因型；
3)使用Roche Light Cycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪进行扩增。
6.根据权利要求5所述的胃溃疡相关易感基因TNF-α突变检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤3)中扩增程序为：95℃预变性10min；然后按95℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸30s的程序进行20个循环，每完成一次循环退火温度降低0.5℃，直至55℃，停止降温，之后再进行25个循环；扩增产物的熔解步骤在PCR循环结束后立即进行，程序为：升温至95℃1min，然后降温至40℃1min，再升温至65℃1s，从65℃连续升温到95℃的过程中以25次/℃的方式进行荧光收集，最后降温至40℃。
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|---|---|---|---|---|
| JP2020178541A (ja) * | 2019-04-23 | 2020-11-05 | ジェネシスヘルスケア株式会社 | 胃潰瘍のリスクを判定する方法 |
| RU2811577C1 (ru) * | 2023-11-09 | 2024-01-15 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования |
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| JP7097847B2 (ja) | 2019-04-23 | 2022-07-08 | ジェネシスヘルスケア株式会社 | 胃潰瘍のリスクを判定する方法 |
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