CN108330177A - 鉴定人类y染色体分型的引物组和其应用及应用其的产品 - Google Patents

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CN108330177A CN201711012046.5A CN201711012046A CN108330177A CN 108330177 A CN108330177 A CN 108330177A CN 201711012046 A CN201711012046 A CN 201711012046A CN 108330177 A CN108330177 A CN 108330177A
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Abstract

本发明提供了鉴定人类Y染色体分型的引物组和其应用及应用其的产品，涉及生物技术领域，该鉴定人类Y染色体分型的引物组，共包括27个引物对，能够扩增29个人类Y染色体STR基因座，其中包含多个Y染色体上的快速突变位点，降低了同一父系男性个体间无法有效区分的局限性。本发明中的鉴定人类Y染色体分型的试剂盒，包括上述引物组或试剂，能够快速、准确的对人类Y染色体进行分型鉴定，灵敏度高、特异性强。

Description

鉴定人类Y染色体分型的引物组和其应用及应用其的产品
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及鉴定人类Y染色体分型的引物组和其应用及应用其的产品。
背景技术
在人类46条染色体中，Y染色体是最小的一条的G组近端着丝粒染色体，约含有5.9万kb的DNA人类Y染色体的长度几乎只有X染色体的1/3，在不同种族、民族群体中其长度具有很大的变异性。整个Y染色体主要由PAR区(pseudoautosomal region)和男性特异区(male-specific region，MSY)组成。在男性减数分裂过程中，拟常染色区可与X染色体重组交换。其余95％为Y染色体特异区。
基因多态性(gene polymorphism)是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longthpolymorphism)。
STR即短串联重复序列(short tandem repeat,STR)，也叫微卫星(microsatellite)或简单重复序列(simple sequence repeats)，一种长度多态性。STR基因座是由几个(多为2至4个)碱基对作为核心单位，串联重复形成的一类DNA序列，由于核心单位重复数目的变化，构成了STR基因座的遗传多态性。微卫星分子标记已被广泛应用于构建基因图谱、种质鉴定、亲缘关系分析、分子标记与经济性状关系分析及遗传疾病诊断。
和常染色体一样，Y染色体也具有明显的遗传多态性。目前Y染色体遗传标记已应用于法医学、人类学、古生物学等方面。
目前市面上主流的Y染色体STR分型试剂盒生产公司主要有美国普洛麦格公司和美国Applied Biosystems公司，进口试剂盒主要选取欧美人群的推荐基因座进行研发，存在试剂盒包含的基因座在亚洲人群中多态性较低导致同一父系男性个体间无法有效区分和识别能力低的问题，不能满足实际需求。
因此，增加适于亚洲人Y染色体STR基因座的数量和降低同一父系男性个体间无法有效区分的局限性是目前有待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供鉴定人类Y染色体分型的引物组，本发明的第二个目的在于提供了上述引物组在鉴定人类Y染色体分型中的应用，本发明的第三个目的在于提供了上述的引物组在制备鉴定人类Y染色体分型的产品中的应用，本发明的第四个目的在于提供了鉴定人类Y染色体分型的试剂盒，以缓解现有技术中存在的Y染色体STR基因座的数量的局限和同一父系男性个体间无法有效区分的技术问题。
为实现上述目的，特采用以下技术方案：
鉴定人类Y染色体分型的引物组，所述引物组可以扩增如下29个人类Y染色体STR基因座：DYS456，DYS576，DYS570，DYS481，DYF387S1，DYS627，DYS549，DYS458，DYS460，DYS437，DYS439，DYS392，DYS385a，DYS385b，DYS643，DYS393，DYS391，DYS390，DYS635，DYS449，DYS533，DYS438，DYS389I，DYS448，DYS389II，DYS19，GATA，H4，和DYS518。
进一步的，所述引物组包括如下27个引物对：
用于扩增DYS456基因座的引物对1：包括DYS456-F和DYS456-R，所述DYS456-F具有如SEQ ID NO.1所示序列，DYS456-R具有如SEQ ID NO.2所示序列；
用于扩增DYS576基因座的引物对2：包括DYS576-F和DYS576-R，所述DYS576-F具有如SEQ ID NO.3所示序列，DYS576-R具有如SEQ ID NO.4所示序列；
用于扩增DYS570基因座的引物对3：包括DYS570-F和DYS570-R，所述DYS570-F具有如SEQ ID NO.5所示序列，DYS570-R具有如SEQ ID NO.6所示序列；
用于扩增DYS481基因座的引物对4：包括DYS481-F和DYS481-R，所述DYS481-F具有如SEQ ID NO.7所示序列，DYS481-R具有如SEQ ID NO.8所示序列；
用于扩增DYF387S1基因座的引物对5：包括DYF387S1-F和DYF387S1-R，所述DYF387S1-F具有如SEQ ID NO.9所示序列，DYF387S1-R具有如SEQ ID NO.10所示序列；
用于扩增DYS627基因座的引物对6：包括DYS627-F和DYS627-R，所述DYS627-F具有如SEQ ID NO.11所示序列，DYS627-R具有如SEQ ID NO.12所示序列；
用于扩增DYS643基因座的引物对7：包括DYS643-F和DYS643-R，所述DYS643-F具有如SEQ ID NO.13所示序列，DYS643-R具有如SEQ ID NO.14所示序列；
用于扩增DYS549基因座的引物对8：包括DYS549-F和DYS549-R，所述DYS549-F具有如SEQ ID NO.15所示序列，DYS549-R具有如SEQ ID NO.16所示序列；
用于扩增DYS458基因座的引物对9：包括DYS458-F和DYS458-R，所述DYS458-F具有如SEQ ID NO.17所示序列，DYS458-R具有如SEQ ID NO.18所示序列；
用于扩增DYS460基因座的引物对10：包括DYS460-F和DYS460-R，所述DYS460-F具有如SEQ ID NO.19所示序列，DYS460-R具有如SEQ ID NO.20所示序列；
用于扩增DYS437基因座的引物对11：包括DYS437-F和DYS437-R，所述DYS437-F具有如SEQ ID NO.21所示序列，DYS437-R具有如SEQ ID NO.22所示序列；
用于扩增DYS439基因座的引物对12：包括DYS439-F和DYS439-R，所述DYS439-F具有如SEQ ID NO.23所示序列，DYS439-R具有如SEQ ID NO.24所示序列；
用于扩增DYS392基因座的引物对13：包括DYS392-F和DYS392-R，所述DYS392-F具有如SEQ ID NO.25所示序列，DYS392-R具有如SEQ ID NO.26所示序列；
用于扩增DYS385a和DYS385a基因座的引物对14：包括DYS385a/b-F和DYS385a/b-R，所述DYS385a/b-F具有如SEQ ID NO.27所示序列，DYS385a/b-R具有如SEQ ID NO.28所示序列；
用于扩增DYS393基因座的引物对15：包括DYS393-F和DYS393-R，所述DYS393-F具有如SEQ ID NO.29所示序列，DYS393-R具有如SEQ ID NO.30所示序列；
用于扩增DYS391基因座的引物对16：包括DYS391-F和DYS391-R，所述DYS391-F具有如SEQ ID NO.31所示序列，DYS391-R具有如SEQ ID NO.32所示序列；
用于扩增DYS390基因座的引物对17：包括DYS390-F和DYS390-R，所述DYS390-F具有如SEQ ID NO.33所示序列，DYS390-R具有如SEQ ID NO.34所示序列；
用于扩增DYS635基因座的引物对18：包括DYS635-F和DYS635-R，所述DYS635-F具有如SEQ ID NO.35所示序列，DYS635-R具有如SEQ ID NO.36所示序列；
用于扩增DYS449基因座的引物对19：包括DYS449-F和DYS449-R，所述DYS449-F具有如SEQ ID NO.37所示序列，DYS449-R具有如SEQ ID NO.38所示序列；
用于扩增DYS533基因座的引物对20：包括DYS533-F和DYS533-R，所述DYS533-F具有如SEQ ID NO.39所示序列，DYS533-R具有如SEQ ID NO.40所示序列；
用于扩增DYS438基因座的引物对21：包括DYS438-F和DYS438-R，所述DYS438-F具有如SEQ ID NO.41所示序列，DYS438-R具有如SEQ ID NO.42所示序列；
用于扩增DYS389I基因座的引物对22：包括DYS389I-F和DYS389I-R，所述DYS389I-F具有如SEQ ID NO.43所示序列，DYS389I-R具有如SEQ ID NO.44所示序列；
用于扩增DYS448基因座的引物对23：包括DYS448-F和DYS448-R，所述DYS448-F具有如SEQ ID NO.45所示序列，DYS448-R具有如SEQ ID NO.46所示序列；
用于扩增DYS389I基因座的引物对24：包括DYS389I-F和DYS389II-R，所述DYS389I-F具有如SEQ ID NO.47所示序列，DYS389II-R具有如SEQ ID NO.48所示序列；
用于扩增DYS19基因座的引物对25：包括DYS19-F和DYS19-R，所述DYS19-F具有如SEQ ID NO.49所示序列，DYS19-R具有如SEQ ID NO.50所示序列；
用于扩增GATA和H4基因座的引物对26：包括GATA-H4-F和GATA-H4-R，所述GATA-H4-F具有如SEQ ID NO.51所示序列，GATA-H4-R具有如SEQ ID NO.52所示序列；
用于扩增DYS518基因座的引物对27：包括DYS518-F和DYS518-R，所述DYS518-F具有如SEQ ID NO.53所示序列，DYS518-R具有如SEQ ID NO.54所示序列。
进一步的，所述引物对按照如下方式分组：
第一组：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7；
第二组：引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13和引物对14；
第三组：引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19和引物对20；
第四组：引物对21、引物对22、引物对23、引物对24、引物对25、引物对26和引物对27。
进一步的，所述第一组的引物对使用蓝色荧光标记，所述第二组的引物对使用绿色荧光标记，所述第三组的引物对使用黄色荧光标记，所述第四组的引物对使用红色荧光标记。
本发明还提供了上述引物组在鉴定人类Y染色体分型中的应用。
本发明还提供了上述引物组在制备鉴定人类Y染色体分型的产品中的应用。
进一步的，所述产品为试剂盒。
本发明还提供了鉴定人类Y染色体分型的试剂盒，包括上述的引物组。
进一步的，所述试剂盒包括：PCR Master Mix，STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)，Control DNA 9948，ddH2O，STRtyper-29YAllelic Ladder(Plus)和SIZE-525Plus；
其中，STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)为包含所述引物组的预混液。
进一步的，所述SIZE-525Plus为使用荧光标记的分子量内标。
本发明提供的鉴定人类Y染色体分型的引物组，共包括27个引物对，能够扩增29个人类Y染色体STR基因座，其中包含多个Y染色体上的快速突变位点，降低了同一父系男性个体间无法有效区分的局限性，有效降低检测成本，提高检测效率。本发明提供了鉴定人类Y染色体分型的试剂盒，包括本发明提供的引物组或试剂，能够快速、准确的对人类Y染色体进行分型鉴定，灵敏度高、特异性强，检测范围广，检测的DNA样本可来自血液，精液，细胞等常见生物材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2的检测分型图谱；
图2为本发明实施例3提供的样本-父亲检测分型图谱；
图3为本发明实施例3提供的样本-儿子检测分型图谱；
图4为本发明实施例3提供的样本-儿子的舅舅检测分型图谱。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一个方面提供了鉴定人类Y染色体分型的引物组，所述引物组可以扩增如下29个人类Y染色体STR基因座：DYS456，DYS576，DYS570，DYS481，DYF387S1，DYS627，DYS549，DYS458，DYS460，DYS437，DYS439，DYS392，DYS385a，DYS385b，DYS643，DYS393，DYS391，DYS390，DYS635，DYS449，DYS533，DYS438，DYS389I，DYS448，DYS389II，DYS19，GATA，H4和DYS518。
本发明提供的鉴定人类Y染色体分型的引物组，将Y染色体上STR基因座的扩增个数提高至29个，并且包括了Y染色体上的快速突变位点DYF387S1，DYS499，DYS518，DYS533，DYS549，DYS570，DYS576和DYS627，增强了男性近亲识别度。
在一个优选的实施方式中，所述27个引物对为：
用于扩增DYS456基因座的引物对1：包括DYS456-F和DYS456-R，所述DYS456-F具有如SEQ ID NO.1所示序列，DYS456-R具有如SEQ ID NO.2所示序列；
用于扩增DYS576基因座的引物对2：包括DYS576-F和DYS576-R，所述DYS576-F具有如SEQ ID NO.3所示序列，DYS576-R具有如SEQ ID NO.4所示序列；
用于扩增DYS570基因座的引物对3：包括DYS570-F和DYS570-R，所述DYS570-F具有如SEQ ID NO.5所示序列，DYS570-R具有如SEQ ID NO.6所示序列；
用于扩增DYS481基因座的引物对4：包括DYS481-F和DYS481-R，所述DYS481-F具有如SEQ ID NO.7所示序列，DYS481-R具有如SEQ ID NO.8所示序列；
用于扩增DYF387S1基因座的引物对5：包括DYF387S1-F和DYF387S1-R，所述DYF387S1-F具有如SEQ ID NO.9所示序列，DYF387S1-R具有如SEQ ID NO.10所示序列；
用于扩增DYS627基因座的引物对6：包括DYS627-F和DYS627-R，所述DYS627-F具有如SEQ ID NO.11所示序列，DYS627-R具有如SEQ ID NO.12所示序列；
用于扩增DYS643基因座的引物对7：包括DYS643-F和DYS643-R，所述DYS643-F具有如SEQ ID NO.13所示序列，DYS643-R具有如SEQ ID NO.14所示序列；
用于扩增DYS549基因座的引物对8：包括DYS549-F和DYS549-R，所述DYS549-F具有如SEQ ID NO.15所示序列，DYS549-R具有如SEQ ID NO.16所示序列；
用于扩增DYS458基因座的引物对9：包括DYS458-F和DYS458-R，所述DYS458-F具有如SEQ ID NO.17所示序列，DYS458-R具有如SEQ ID NO.18所示序列；
用于扩增DYS460基因座的引物对10：包括DYS460-F和DYS460-R，所述DYS460-F具有如SEQ ID NO.19所示序列，DYS460-R具有如SEQ ID NO.20所示序列；
用于扩增DYS437基因座的引物对11：包括DYS437-F和DYS437-R，所述DYS437-F具有如SEQ ID NO.21所示序列，DYS437-R具有如SEQ ID NO.22所示序列；
用于扩增DYS439基因座的引物对12：包括DYS439-F和DYS439-R，所述DYS439-F具有如SEQ ID NO.23所示序列，DYS439-R具有如SEQ ID NO.24所示序列；
用于扩增DYS392基因座的引物对13：包括DYS392-F和DYS392-R，所述DYS392-F具有如SEQ ID NO.25所示序列，DYS392-R具有如SEQ ID NO.26所示序列；
用于扩增DYS385a和DYS385a基因座的引物对14：包括DYS385a/b-F和DYS385a/b-R，所述DYS385a/b-F具有如SEQ ID NO.27所示序列，DYS385a/b-R具有如SEQ ID NO.28所示序列；
用于扩增DYS393基因座的引物对15：包括DYS393-F和DYS393-R，所述DYS393-F具有如SEQ ID NO.29所示序列，DYS393-R具有如SEQ ID NO.30所示序列；
用于扩增DYS391基因座的引物对16：包括DYS391-F和DYS391-R，所述DYS391-F具有如SEQ ID NO.31所示序列，DYS391-R具有如SEQ ID NO.32所示序列；
用于扩增DYS390基因座的引物对17：包括DYS390-F和DYS390-R，所述DYS390-F具有如SEQ ID NO.33所示序列，DYS390-R具有如SEQ ID NO.34所示序列；
用于扩增DYS635基因座的引物对18：包括DYS635-F和DYS635-R，所述DYS635-F具有如SEQ ID NO.35所示序列，DYS635-R具有如SEQ ID NO.36所示序列；
用于扩增DYS449基因座的引物对19：包括DYS449-F和DYS449-R，所述DYS449-F具有如SEQ ID NO.37所示序列，DYS449-R具有如SEQ ID NO.38所示序列；
用于扩增DYS533基因座的引物对20：包括DYS533-F和DYS533-R，所述DYS533-F具有如SEQ ID NO.39所示序列，DYS533-R具有如SEQ ID NO.40所示序列；
用于扩增DYS438基因座的引物对21：包括DYS438-F和DYS438-R，所述DYS438-F具有如SEQ ID NO.41所示序列，DYS438-R具有如SEQ ID NO.42所示序列；
用于扩增DYS389I基因座的引物对22：包括DYS389I-F和DYS389I-R，所述DYS389I-F具有如SEQ ID NO.43所示序列，DYS389I-R具有如SEQ ID NO.44所示序列；
用于扩增DYS448基因座的引物对23：包括DYS448-F和DYS448-R，所述DYS448-F具有如SEQ ID NO.45所示序列，DYS448-R具有如SEQ ID NO.46所示序列；
用于扩增DYS389I基因座的引物对24：包括DYS389I-F和DYS389II-R，所述DYS389I-F具有如SEQ ID NO.47所示序列，DYS389II-R具有如SEQ ID NO.48所示序列；
用于扩增DYS19基因座的引物对25：包括DYS19-F和DYS19-R，所述DYS19-F具有如SEQ ID NO.49所示序列，DYS19-R具有如SEQ ID NO.50所示序列；
用于扩增GATA和H4基因座的引物对26：包括GATA-H4-F和GATA-H4-R，所述GATA-H4-F具有如SEQ ID NO.51所示序列，GATA-H4-R具有如SEQ ID NO.52所示序列；
用于扩增DYS518基因座的引物对27：包括DYS518-F和DYS518-R，所述DYS518-F具有如SEQ ID NO.53所示序列，DYS518-R具有如SEQ ID NO.54所示序列。
在一个优选的实施方式中，上述引物对按照如下方式分组：
第一组：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7；
第二组：引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13和引物对14；
第三组：引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19和引物对20；
第四组：引物对21、引物对22、引物对23、引物对24、引物对25、引物对26和引物对27。
在一个优选的实施方式中，第一组的引物对使用蓝色荧光标记，第二组的引物对使用绿色荧光标记，第三组的引物对使用黄色荧光标记，第四组的引物对使用红色荧光标记。
在一个更优选的实施方式中，第一组采用荧光标签FAM标记，第二组采用荧光标签HEX标记，第三组采用荧光标签TAMRA标记，第四组采用荧光标签ROX标记，荧光标记位于特异性引物5’端。
在本实施方式中，使用的标记不局限于FAM-HEX-TAMRA-ROX的荧光组合，还可以使用FAM-VIC-NED-PET等其他类似的荧光组合。
本发明提供的鉴定人类Y染色体分型的引物组，采用四色荧光标记，比主流试剂盒常用的五色荧光标记减少了一种荧光染料，并将检测的STR基因座增加至29个，减少了试验成本，提高了检测效率。
本发明的第二个方面提供了上述引物组在鉴定人类Y染色体分型中的应用。
本发明的第三个方面提供了上述引物组在制备鉴定人类Y染色体分型的产品中的应用。
在一个优选的实施方式中，上述产品为试剂盒。
本发明的第四个方面提供了鉴定人类Y染色体分型的试剂盒，包括上述的引物组。
在一个优选的实施方式中，鉴定人类Y染色体分型的试剂盒还包括PCR MasterMix，STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)，Control DNA 9948，ddH2O，STR typer-29YAllelic Ladder(Plus)和SIZE-525Plus；
其中，STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)为包含所述引物组的预混液。
在一个优选的实施方式中，PCR Master Mix包含的成分为MgCl2、dNTP和Taq酶。
在一个优选的实施方式中，STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)包含的上述引物组中各个引物对的浓度为：
引物对1：1.0～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于1.0、1.2nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对2：1.0～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于1.0、1.2nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对3：5.5～6.5nmol/μl，例如可以为，但不限于5.0、6.0nmol/μl或者6.5nmol/μl；引物对4：3.5～4.5nmol/μl，例如可以为，但不限于3.5、4.0nmol/μl或者4.5nmol/μl；引物对5：5.0～6.5nmol/μl，例如可以为，但不限于5.0、5.5nmol/μl或者6.0nmol/μl；引物对6：4.5～6.0nmol/μl，例如可以为，但不限于1.5、2nmol/μl或者6.0nmol/μl；引物对7：1.5～2.5nmol/μl，例如可以为，但不限于5.0、5.5nmol/μl或者2.5nmol/μl；引物对8：4.5～6.0nmol/μl，例如可以为，但不限于5.0、5.5nmol/μl或者6.0nmol/μl；引物对9：0.5～1.0nmol/μl，例如可以为，但不限于0.5、0.8nmol/μl或者1.0nmol/μl；引物对10：0.5～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于0.5、1.0nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对11：5～6.5nmol/μl，例如可以为，但不限于5、5.5nmol/μl或者6.5nmol/μl；引物对12：2.0～3.0nmol/μl，例如可以为，但不限于2.0、2.5nmol/μl或者3nmol/μl；引物对13：1.0～2.0nmol/μl，例如可以为，但不限于1.0、1.5nmol/μl或者2.0nmol/μl；引物对14：1.0～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于1.0、1.2nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对15：0.2～1.0nmol/μl，例如可以为，但不限于0.5、0.8nmol/μl或者1nmol/μl；引物对16：5.0～6.5nmol/μl，例如可以为，但不限于5.5、6.0nmol/μl或者6.5nmol/μl；引物对17：1.0～2.0nmol/μl，例如可以为，但不限于1.0、1.5nmol/μl或者2.0nmol/μl；引物对18：2.0～3.5nmol/μl，例如可以为，但不限于2.0、2.5nmol/μl或者3.5nmol/μl；引物对19：0.5～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于0.5、1.0nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对20：0.5～1.0nmol/μl，例如可以为，但不限于0.5、0.7nmol/μl或者1.0nmol/μl；引物对21：0.5～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于0.5、1.0nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对22：1.0～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于1.0、1.2nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对23：1.0～1.5nmol/μl，例如可以为，但不限于1.0、1.2nmol/μl或者1.5nmol/μl；引物对24：5.0～6.5nmol/μl，例如可以为，但不限于5.0、5.5nmol/μl或者6.5nmol/μl；引物对25：3.5～5.0nmol/μl，例如可以为，但不限于4.0、4.5nmol/μl或者5.0nmol/μl；引物对26：5.0～7.0nmol/μl，例如可以为，但不限于5.5、6.0nmol/μl或者6.5nmol/μl；引物对27：4.5～5.5nmol/μl，例如可以为，但不限于4.5、5.0nmol/μl或者5.5nmol/μl。
在一个更优选的实施方式中，STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)包含的上述引物组中各个引物对的浓度为：引物对1：1.2nmol/μl、引物对2：1.2nmol/μl、引物对3：6.0nmol/μl、引物对4：4.0nmol/μl、引物对5：6.0nmol/μl、引物对6：5.0nmol/μl、引物对7：2.0nmol/μl、引物对8：5.0nmol/μl、引物对9：0.5nmol/μl、引物对10：1.0nmol/μl、引物对11：6.0nmol/μl、引物对12：2.5nmol/μl、引物对13：1.5nmol/μl、引物对14：1.2nmol/μl、引物对15：0.5nmol/μl、引物对16：6.0nmol/μl、引物对17：1.5nmol/μl、引物对18：2.5nmol/μl、引物对19：1.0nmol/μl、引物对20：0.5nmol/μl、引物对21：1.0nmol/μl、引物对22：1.2nmol/μl、引物对23：1.2nmol/μl、引物对24：6.0nmol/μl、引物对25：4.0nmol/μl、引物对26：6.0nmol/μl、引物对27：5.0nmol/μl。
在一个优选的实施方式中，所述SIZE-525Plus为使用荧光标记的分子量内标。
在一个更优选的实施方式中，SIZE-525Plus使用荧光标签Cy5标记。
在本实施方式中，使用的标记不局限于荧光标签Cy5，还可以使用荧标签LIZ等其他荧光标签。
在一个优选的实施方式中，上述的试剂盒适用的PCR扩增条件为95℃预变性5min；94℃变性10s，60～62℃退火1min，30个循环；60℃延伸15min；
退火温度例如可以为，但不限于60℃、61℃或者62℃。
在一个更优选的实施方式中，PCR扩增条件为95℃预变性5min；94℃变性10s，61℃退火1min，30个循环；60℃延伸15min。
在一个优选的实施方式中，上述试剂盒可以检测的样本例如可以为，但不限于血液、精液、细胞或者毛发。
在一个优选的实施方式中，上述试剂盒可以检测的DNA样本，可以采用的提取方法例如可以为，但不限于Chelex-100提取法、磁珠提取法、试剂盒提取法或者氯仿提取法。
本发明提供的鉴定人类Y染色体分型的试剂盒，包括本发明提供的引物组，可检测的样本范围广泛，能够快速、准确的鉴定人类Y染色体分型，在性犯罪案件及父系亲缘关系鉴定中具有特殊应用价值。
为了更清楚的说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：人类Y染色体29个STR基因座的复合扩增引物的设计
根据发明所需，设计27对特异性引物，能同时复合扩增29个Y染色体STR基因座，包括：DYS456，DYS576，DYS570，DYS481，DYF387S1，DYS627，DYS549，DYS458，DYS460，DYS437，DYS439，DYS392，DYS385a，DYS385b，DYS643，DYS393，DYS391，DYS390，DYS635，DYS449，DYS533，DYS438，DYS389I，DYS448，DYS389II，DYS19，GATA，H4和DYS518。
设计好的引物通过Primer3软件测定，使各个基因座的退火温度尽可能接近。为避免引物与引物之间可能出现的相互作用，使用AutoDimer v1.0软件进行引物二聚体的检测，检测无二聚体产生则为可用。此外，为检测扩增产物的特异性，用BLAST软件查询是否存在目的序列之外的可被扩增的序列。设计的复合扩增引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.54所示。
上述的引物按照如下方式分组：
第一组：DYS456-F和DYS456-R、DYS576-F和DYS576-R、DYS570-F和DYS570-R、DYS481-F和DYS481-R、DYF387S1-F和DYF387S1-R、DYS627-F和DYS627-R、DYS643-F和DYS643-R；
第二组：DYS549-F和DYS549-R、DYS458-F和DYS458-R、DYS460-F和DYS460-R、DYS437-F和DYS437-R、DYS439-F和DYS439-R、DYS392-F和DYS392-R、DYS385a/b-F和DYS385a/b-R；
第三组：DYS393-F和DYS393-R、DYS391-F和DYS391-R、DYS390-F和DYS390-R、DYS635-F和DYS635-R、DYS449-F和DYS449-R、DYS533-F和DYS533-R；
第四组：DYS438-F和DYS438-R、DYS389I-F和DYS389I-R、DYS448-F和DYS448-R、DYS389I-F和DYS389II-R、DYS19-F和DYS19-R、GATA和H4-F和GATA和H4-R、DYS518-F和DYS518-R、DYS518-F和DYS518-R。
第一组采用荧光标签FAM标记，第二组采用荧光标签HEX标记，第三组采用荧光标签TAMRA标记，第四组采用荧光标签ROX标记，荧光标记位于特异性引物5’端。
实施例2建立复合PCR反应体系
27对特异性引物按照浓度：引物对1：1.2nmol/μl、引物对2：1.2nmol/μl、引物对3：6nmol/μl、引物对4：4nmol/μl、引物对5：6nmol/μl、引物对6：5nmol/μl、引物对7：2nmol/μl、引物对8：5nmol/μl、引物对9：0.5nmol/μl、引物对10：1nmol/μl、引物对11：6nmol/μl、引物对12：2.5nmol/μl、引物对13：1.5nmol/μl、引物对14：1.2nmol/μl、引物对15：0.5nmol/μl、引物对16：6nmol/μl、引物对17：1.5nmol/μl、引物对18：2.5nmol/μl、引物对19：1nmol/μl、引物对20：0.5nmol/μl、引物对21：1nmol/μl、引物对22：1.2nmol/μl、引物对23：1.2nmol/μl、引物对24：6nmol/μl、引物对25：4nmol/μl、引物对26：6nmol/μl、引物对27：5nmol/μl。将上述浓度的引物对配置成引物预混液STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)。
反应体系配置如表1所示：
表1复合PCR反应体系
试剂 体积
PCR Master Mix 5μL
STRtyper-29Y PrimerMix(Plus) 3μL
DNA样品 0.5-4ng
ddH2O 加至10μL
按照复合PCR扩增条件：95℃预变性5min；94℃变性10s，61℃退火1min，30个循环；60℃延伸15min。在ABI 9700扩增仪复合扩增29个STR基因座位点，使用ABI3130型遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳分离。由Data Collection Software 3.1收集数据，并用GeneMarker软件进行片段长度分析，结果显示扩增均衡性、峰高良好，没有非特异性扩增，结果如图1所示。
实施例3人类Y染色体分型的应用
鉴定人类Y染色体分型的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1.收集同一家系中，父亲，儿子和儿子的舅舅的血斑。
2.Chelex-100法提取基因组DNA，参考《GA/T 383-2002法庭科学DNA实验室检验规范》进行。
3.按照表2配制反应体系：
表2 PCR反应体系
4.在ABI 9700扩增仪上进行DNA扩增，扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性10s，61℃退火1min，30个循环；60℃延伸15min。
5.由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(SIZE-525Plus)组成上样混合物。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物或系统中等位基因分析标准物STR typer-29Y AllelicLadder(Plus)混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，电泳。
6.使用ABI3130型遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳分离。由DataCollection Software 3.1收集数据，并用GeneMarker软件进行片段长度分析。结果如表3及图2，图3，图4所示：
表3三个样品STR基因座长度对比
结果显示：样本-父亲和样本-儿子的29个Y-STR基因座检测结果完全一致，说明该两个样本属于同一个男性家系，样本-儿子的舅舅与其余两个样本的家系差异较远。说明本试剂盒可以应用于Y染色体分型和鉴定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州祥音生物医药科技有限公司
<120> 鉴定人类Y染色体分型的引物组和其应用及应用其的产品
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaccttgtg ataatgtact agat 24
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggagatggac ctaactaatg g 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggacgacacg aaacagaga 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagaattgac tggctatgac t 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggcgaacgtt accattaaac 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gacgaagatg aactaaaccc t 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggtgtttgat ggggttgct 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
accgagaacc ctactgttg 19
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggtacttgca ttttagacca tt 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gccaccttgt gctacttgtg a 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acccgatgtg accgagcct 19
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agatttacat gcttaatttt gacaatatac 30
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggaatggtgg ggaattgaac 20
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gcctgggtgg aatgagatac tgttatga 28
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccctgactaa caccttggaa 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atggaccctt tgacatttgt g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
caacctgaat gaaacgacaa t 21
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gcaccacgcc caccct 16
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aacgattgac actactaatt aga 23
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggacatagaa gatagacgat gc 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gctgggacta tgggcgtgct tgcat 25
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gccgactgct gaaccgatga 20
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atggactgaa tggtactgac gatg 24
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gtggcttgga atgattttac c 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cttgagattg caacagagac a 21
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
actactgaaa aaccgatgga ga 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tggaatgaac tgaaatgatg g 21
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gggctgctga ccctattt 18
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gaatgtggga tgatacttgt ggaa 24
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cactgacaaa aaatgctgta tg 22
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
agatatgaat gaaagaatac accc 24
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
gcagagacaa atagagactg 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
aattttacac atttttgggc c 21
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gtgggctaaa tggatgacct 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cacgattgga gaactgaacg a 21
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
gtgcacatac attgtttaga gact 24
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
gattggctga gagaacgact 20
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
gcctggactt ggcttttg 18
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gagataacag atttggaaga tacc 24
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aattatatgc actaatgaga cca 23
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
tggggaagat ttgaacgg 18
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
gcaacacgat tgaaacgaca ttga 24
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
caattagacc tgctgagact aa 22
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gcaacgagaa gatgtattag atatgtg 27
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
gctacctaac tggctagaga tac 23
<210> 46
<211> 26
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ggatggaaat ttagagatag atttac 26
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
caattagacc tgctgagact aa 22
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gcaacgagaa gatgtattag atat 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ttgaactatg actactgctt tgatgt 26
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
gctaatatgc caccctttta ttattt 26
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<400> 51
ggtgatgacg agataaaccg at 22
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
ggtgacttaa tggaatgata aat 23
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ggcaacacac ttgaaactg 19
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ttgaaaaccc cacgagatgc 20

Claims (10)

1.鉴定人类Y染色体分型的引物组，其特征在于，所述引物组可以扩增如下29个人类Y染色体STR基因座：DYS456，DYS576，DYS570，DYS481，DYF387S1，DYS627，DYS549，DYS458，DYS460，DYS437，DYS439，DYS392，DYS385a，DYS385b，DYS643，DYS393，DYS391，DYS390，DYS635，DYS449，DYS533，DYS438，DYS389I，DYS448，DYS389II，DYS19，GATA，H4和DYS518。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，包括如下27个引物对：
用于扩增DYS456基因座的引物对1：包括DYS456-F和DYS456-R，所述DYS456-F具有如SEQ ID NO.1所示序列，DYS456-R具有如SEQ ID NO.2所示序列；
用于扩增DYS576基因座的引物对2：包括DYS576-F和DYS576-R，所述DYS576-F具有如SEQ ID NO.3所示序列，DYS576-R具有如SEQ ID NO.4所示序列；
用于扩增DYS570基因座的引物对3：包括DYS570-F和DYS570-R，所述DYS570-F具有如SEQ ID NO.5所示序列，DYS570-R具有如SEQ ID NO.6所示序列；
用于扩增DYS481基因座的引物对4：包括DYS481-F和DYS481-R，所述DYS481-F具有如SEQ ID NO.7所示序列，DYS481-R具有如SEQ ID NO.8所示序列；
用于扩增DYF387S1基因座的引物对5：包括DYF387S1-F和DYF387S1-R，所述DYF387S1-F具有如SEQ ID NO.9所示序列，DYF387S1-R具有如SEQ ID NO.10所示序列；
用于扩增DYS627基因座的引物对6：包括DYS627-F和DYS627-R，所述DYS627-F具有如SEQ ID NO.11所示序列，DYS627-R具有如SEQ ID NO.12所示序列；
用于扩增DYS643基因座的引物对7：包括DYS643-F和DYS643-R，所述DYS643-F具有如SEQ ID NO.13所示序列，DYS643-R具有如SEQ ID NO.14所示序列；
用于扩增DYS549基因座的引物对8：包括DYS549-F和DYS549-R，所述DYS549-F具有如SEQ ID NO.15所示序列，DYS549-R具有如SEQ ID NO.16所示序列；
用于扩增DYS458基因座的引物对9：包括DYS458-F和DYS458-R，所述DYS458-F具有如SEQ ID NO.17所示序列，DYS458-R具有如SEQ ID NO.18所示序列；
用于扩增DYS460基因座的引物对10：包括DYS460-F和DYS460-R，所述DYS460-F具有如SEQ ID NO.19所示序列，DYS460-R具有如SEQ ID NO.20所示序列；
用于扩增DYS437基因座的引物对11：包括DYS437-F和DYS437-R，所述DYS437-F具有如SEQ ID NO.21所示序列，DYS437-R具有如SEQ ID NO.22所示序列；
用于扩增DYS439基因座的引物对12：包括DYS439-F和DYS439-R，所述DYS439-F具有如SEQ ID NO.23所示序列，DYS439-R具有如SEQ ID NO.24所示序列；
用于扩增DYS392基因座的引物对13：包括DYS392-F和DYS392-R，所述DYS392-F具有如SEQ ID NO.25所示序列，DYS392-R具有如SEQ ID NO.26所示序列；
用于扩增DYS385a和DYS385a基因座的引物对14：包括DYS385a/b-F和DYS385a/b-R，所述DYS385a/b-F具有如SEQ ID NO.27所示序列，DYS385a/b-R具有如SEQ ID NO.28所示序列；
用于扩增DYS393基因座的引物对15：包括DYS393-F和DYS393-R，所述DYS393-F具有如SEQ ID NO.29所示序列，DYS393-R具有如SEQ ID NO.30所示序列；
用于扩增DYS391基因座的引物对16：包括DYS391-F和DYS391-R，所述DYS391-F具有如SEQ ID NO.31所示序列，DYS391-R具有如SEQ ID NO.32所示序列；
用于扩增DYS390基因座的引物对17：包括DYS390-F和DYS390-R，所述DYS390-F具有如SEQ ID NO.33所示序列，DYS390-R具有如SEQ ID NO.34所示序列；
用于扩增DYS635基因座的引物对18：包括DYS635-F和DYS635-R，所述DYS635-F具有如SEQ ID NO.35所示序列，DYS635-R具有如SEQ ID NO.36所示序列；
用于扩增DYS449基因座的引物对19：包括DYS449-F和DYS449-R，所述DYS449-F具有如SEQ ID NO.37所示序列，DYS449-R具有如SEQ ID NO.38所示序列；
用于扩增DYS533基因座的引物对20：包括DYS533-F和DYS533-R，所述DYS533-F具有如SEQ ID NO.39所示序列，DYS533-R具有如SEQ ID NO.40所示序列；
用于扩增DYS438基因座的引物对21：包括DYS438-F和DYS438-R，所述DYS438-F具有如SEQ ID NO.41所示序列，DYS438-R具有如SEQ ID NO.42所示序列；
用于扩增DYS389I基因座的引物对22：包括DYS389I-F和DYS389I-R，所述DYS389I-F具有如SEQ ID NO.43所示序列，DYS389I-R具有如SEQ ID NO.44所示序列；
用于扩增DYS448基因座的引物对23：包括DYS448-F和DYS448-R，所述DYS448-F具有如SEQ ID NO.45所示序列，DYS448-R具有如SEQ ID NO.46所示序列；
用于扩增DYS389I基因座的引物对24：包括DYS389I-F和DYS389II-R，所述DYS389I-F具有如SEQ ID NO.47所示序列，DYS389II-R具有如SEQ ID NO.48所示序列；
用于扩增DYS19基因座的引物对25：包括DYS19-F和DYS19-R，所述DYS19-F具有如SEQID NO.49所示序列，DYS19-R具有如SEQ ID NO.50所示序列；
用于扩增GATA和H4基因座的引物对26：包括GATA-H4-F和GATA-H4-R，所述GATA-H4-F具有如SEQ ID NO.51所示序列，GATA-H4-R具有如SEQ ID NO.52所示序列；
用于扩增DYS518基因座的引物对27：包括DYS518-F和DYS518-R，所述DYS518-F具有如SEQ ID NO.53所示序列，DYS518-R具有如SEQ ID NO.54所示序列。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述引物对按照如下方式分组：
第一组：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6和引物对7；
第二组：引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13和引物对14；
第三组：引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19和引物对20；
第四组：引物对21、引物对22、引物对23、引物对24、引物对25、引物对26和引物对27。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述第一组的引物对使用蓝色荧光标记，所述第二组的引物对使用绿色荧光标记，所述第三组的引物对使用黄色荧光标记，所述第四组的引物对使用红色荧光标记。
5.如权利要求1-4任一项所述的引物组在鉴定人类Y染色体分型中的应用。
6.如权利要求1-4任一项所述的引物组在制备鉴定人类Y染色体分型的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。
8.鉴定人类Y染色体分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述的引物组。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PCR Master Mix，STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)，Control DNA 9948，ddH2O，STRtyper-29Y AllelicLadder(Plus)和SIZE-525Plus；
其中，所述STRtyper-29Y Primer Mix(Plus)为包含所述引物组的预混液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述SIZE-525Plus为使用荧光标记的分子量内标。
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