CN106520980B - 一种对男性个体进行y-str分型的方法和系统 - Google Patents
一种对男性个体进行y-str分型的方法和系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106520980B CN106520980B CN201611083685.6A CN201611083685A CN106520980B CN 106520980 B CN106520980 B CN 106520980B CN 201611083685 A CN201611083685 A CN 201611083685A CN 106520980 B CN106520980 B CN 106520980B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- locus
- seq
- amplimer
- male
- str
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Abstract
本发明提供一种对男性个体进行Y‑STR分型的方法和系统，该方法包括获得所述男性个体的DNA，获得所述DNA包括24个Y‑STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型，所述24个Y‑STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA‑H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617；根据所述男性个体25个基因座的基因型获得该个体的Y‑STR分型结果。利用该分型结果可对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分的检测及多个男性混合样本中男性成分的检测等。
Description
技术领域
本发明涉及一种分型方法和系统，尤其涉及一种对男性个体进行Y-STR分型的方法和系统。
背景技术
串联重复序列(short tandem repeat,STR)是广泛存在于人类染色体DNA中的一类多态性遗传标记系统，因其存在范围广(平均16kb中即有一个STR基因座)，核心序列小(2-7bp)且扩增产物长度均小于500bp，等位基因位点的数字即代表序列重复的次数。STR基因座的等位基因片断长度集中，故可对多个STR基因座进行复合扩增。复合扩增多个STR基因座，累计鉴别能力可以接近或达到DNA指纹水平。
Y染色体为男性特有的染色体，同一父系所有的男性个体都具有相同的Y-STR单倍型。Y-STR检验作为常染色体检验的一种补充手段，对家系排查、父权亲权鉴定、男女混合成分中男性成分的检测及多个男性混合成分的判定具有重要的应用价值，而且因为涉案犯罪行为人90％以上为男性，Y-STR检验在DNA检验中扮演着越来越重要的角色。
现在法医DNA技术的作用更多的体现在被动比对方面，把Y-STR检验法引进到侦查学领域破获案件，创立了“Y-STR家系排查法”，可以缩小命案侦查范围，为侦查提出指向性的线索。家系排查指将犯罪现场提取到的Y-STR数据，与一定范围内的家系进行比对，一旦比中，便可以指向犯罪行为人所在家系。
目前河南、山东等正在以县(市)为单位建库，以行政村为单元绘制家系图谱，在家系图谱的基础上采集生物样本，开展Y-STR数据库建设工作。通过Y数据库自动化比对，可快速指向犯罪嫌疑人所在家系，缩小侦查范围；快速指向无名尸体所在家系，指明侦查方向；可以排除女性DNA的干扰，获得明确的男性信息，入库自动比对。河南Y库采取“边打边建，以打促建”的方针，已经利用该库成功破获数百起命案积案，颇有成效。
专利CN103866019中公开了一种用于法医Y-STR检测的Y-STR荧光复合扩增检验试剂，具体公开了21个Y-STR基因座及扩增引物。然而，其引物的设计使得一些Y-STR基因座的扩增产物排列过于紧密甚至前一个基因座的扩增产物跨到下一个基因座的范围内，造成分型无法判读，另外基因座排布紧密还可能造成等位基因分型标准物在分析时出现串扰、错位从而导致整个结果无法正确分析判读。
如何提供一种可解决上述问题的对男性个体进行Y-STR分型的方法和系统成为有待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种对男性个体进行Y-STR分型的方法，通过采用特定Y-STR基因座组合以及针对这些基因座设计的特定引物，使得在分型过程中不会出现分型无法判读、分型串扰、错位的问题，能准确地获得男性个体包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型，从而为实现对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分来源推断，和/或男男混合样本中男性成分来源推断等提供数据支持。
本发明还提供一种对男性个体进行Y-STR分型的系统，通过该系统可以实现对男性个体针对上述25个基因座的准确分型。
本发明还提供了一种复合检测体系，所述检测体系能准确获得男性个体包括24个Y-STR基因座和性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型。
本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。
本发明提供的一种对男性个体进行Y-STR分型的方法，该方法包括：
1)获得男性个体的DNA；
2)获得所述DNA包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型，所述24个Y-STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，包括采用与所述基因座对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；
其中基因座DYS460的扩增引物对应于SEQ ID No.1至SEQ ID No.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的扩增引物相同，为SEQ ID No.3至SEQ ID No.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的扩增引物分别对应于SEQ ID No.5至SEQ ID No.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.13至SEQ ID No.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的扩增引物分别对应于SEQ ID No.15至SEQ ID No.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.39至SEQ ID No.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的扩增引物分别对应于SEQ ID No.41至SEQ ID No.44的核苷酸序列；
3)根据所述男性个体25个基因座的基因型获得该个体的Y-STR分型结果。
在本发明的方案中，所述25个基因座是申请人通过对大量男性个体的生存环境、种族起源等进行综合分析获得的。针对上述基因座的引物也是申请人通过大量实验获得的，成功解决了在对男性个体的Y-STR分型过程存在的分型无法判读、分型串扰、错位的问题，同时这些特定Y染色体基因座的组合还能实现对男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分来源推断，和/或男男混合样本中男性成分来源推断。
进一步的，在本申请的方案中，“获得男性个体的DNA”指的是提取该个体的例如血液、组织等样本中的DNA，或者直接获得含有所述个体DNA的血卡。“所述男性个体的Y-STR分型结果”指的是能用于对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分来源推断，和/或男男混合样本中男性成分来源推断的Y-STR分型结果。其中男男混合样本中男性成分来源推断指对来自非同一父系家族的男性个体的区分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述引物为荧光标记引物。
在本发明的另一个具体实施方式中，其中2)还包括在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述25个基因座的基因型的步骤。在本发明的方案中，所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪，例如ABI3130或ABI3500型遗传分析仪，通过ID-X软件或其他GeneMapper软件等分析该PCR扩增产物中所述25个基因座的基因型。
本发明提供的一种对男性个体进行Y-STR分型的系统，所述系统包括DNA获取体系，复合检测体系、推断体系；
所述DNA获取体系用于获得所述男性个体的DNA；
所述复合检测体系用于获得所述DNA包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型，并根据该基因型获得该个体的Y-STR分型结果，
所述24个Y-STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，获得所述25个基因座的基因型的过程包括采用与所述基因座对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；
其中基因座DYS460的扩增引物对应于SEQ ID No.1至SEQ ID No.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的扩增引物相同，为SEQ ID No.3至SEQ ID No.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的扩增引物分别对应于SEQ ID No.5至SEQ ID No.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.13至SEQ ID No.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的扩增引物分别对应于SEQ ID No.15至SEQ ID No.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.39至SEQ ID No.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的扩增引物分别对应于SEQ ID No.41至SEQ ID No.44的核苷酸序列；
所述推断体系用于根据所述个体的Y-STR分型结果对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分来源推断，和/或男男混合样本中男性成分来源推断。
在本发明的一个具体实施方式中，所述引物为荧光标记引物。
更进一步的，所述复合检测体系还用于在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述25个基因座的基因型。
更进一步的，所述遗传分析仪利用针对各基因座的等位基因的分型标准物来确定男性个体DNA中各基因座的基因型。
本发明提供的一种复合检测体系，所述体系包括男性个体DNA，25个基因座，以及扩增引物，
所述复合检测体系用于利用所述扩增引物获得所述DNA包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的扩增产物，并由所述扩增产物获得男性个体的DNA的25个基因座的基因型，并进一步由该基因型获得所述个体的Y-STR分型结果，
所述24个Y-STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，
所述扩增引物由与所述25个基因座对应的扩增引物组成，其中基因座DYS460的扩增引物对应于SEQ ID No.1至SEQ ID No.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的扩增引物相同，为SEQ ID No.3至SEQ ID No.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的扩增引物分别对应于SEQ ID No.5至SEQ ID No.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.13至SEQ ID No.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的扩增引物分别对应于SEQ ID No.15至SEQ ID No.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.39至SEQ ID No.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的扩增引物分别对应于SEQ ID No.41至SEQ ID No.44的核苷酸序列。
在本发明的方案中，所述DNA聚合酶可以是Fast Start DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Hotstart DNA聚合酶中的一种或多种。
本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。
在本发明的方案中，本发明利用所述复合检测体系进行22个基因座的分型的方法，包括：1)将获取的男性个体DNA作为模板；2)使用所述扩增引物作为模板的男性个体DNA进行多重PCR扩增反应以得到扩增产物；3)将所述扩增产物利用遗传分析仪进行分析，以获得25个基因座的基因型。
在本发明的方案中，所述25个基因座信息如表1所示：
表1
| 基因座 | 重复序列 | 5’标记 |
| DYS19 | TAGA | ROX |
| DYS385a/b | GAAA | HEX |
| DYS389I/II | (TCTG)(TCTA) | FAM |
| DYS390 | (TCTA)(TCTG) | FAM |
| DYS391 | TCTA | TAMRA |
| DYS392 | TAT | FAM |
| DYS393 | AGAT | ROX |
| DYS437 | TCTA | HEX |
| DYS448 | AGAGAT | TAMRA |
| DYS456 | AGAT | TAMRA |
| DYS635 | TSTA | ROX |
| GATA H4 | TAGA | HEX |
| DYS438 | TTTTC | TAMRA |
| DYS439 | AGAT | ROX |
| DYS460 | ATAG | FAM |
| DYS447 | TAAWA | TAMRA |
| DYS527ab | GAAA | ROX |
| DYS617 | TAT | TAMRA |
| DYS522 | GATA | HEX |
| DYS444 | TAGA | ROX |
| DYS458 | GAAA | HEX |
| Amelogenin | --- | HEX |
本发明提供的扩增引物序列如下。所述22对扩增引物及其相对应的基因座如下表2所示，PCRU代表上游引物，PCRL代表下游引物；
表2
本发明方案具有以下的优点：
1、本发明的检测方法和检测系统采用特定的STR基因座组合以及引物序列，使得最终获得的分型图谱上各位点之间排布均匀，且引物特异性高，可以得到完整的STR分型，峰型尖锐清晰，平衡性好，无Pull-up峰、stutter带，无非特异性人工产物出现，完全能够满足法医Y-STR检验的要求。
2、使用本发明的检测方法和检测系统同时检测特定24个Y-STR位点和1个Amelogenin位点，具有高的亲权鉴定能力、男性个体进行家系排查、以及男女混合样本中男性成分来源推断，和/或男男混合样本中男性成分来源推断。
3、本发明的方案可以通过使用荧光标记，利用常规的遗传分析仪，根据所要扩增的基因的分子量和荧光颜色的不同，获得直观的检测结果，并且该结果与现有检测系统相比，准确性为100％。
4、本发明提供的方案能有效从基因水平为其家系排查、亲权鉴定等提供准确的科学依据。
附图说明
图1显示了本申请各基因座的等位基因排布图(其中第一行为蓝色荧光，第二行为绿色荧光，第三行为黄色荧光，第四行为红色荧光)。
图2显示了使用本发明系统获得的一个样本的分型结果图。
图3显示了使用专利CN103866019体系获得的等位基因分型标准物(ladder)的分型图(其中第一行为蓝色荧光，第二行为绿色荧光，第三行为黑色荧光，第四行为红色荧光)。
图4显示了使用本申请体系获得的等位基因分型标准物(ladder)的分型图(其中第一行为蓝色荧光，第二行为绿色荧光，第三行为黑色荧光，第四行为红色荧光)。
图5显示了使用专利CN103866019体系获得的基因座DYS460等位基因分型图(其中第一行为蓝色荧光，第二行为绿色荧光，第三行为黑色荧光，第四行为红色荧光)。
具体实施方式
以下实施例中使用的193份人抗凝血(男性193份)，由公安部物证鉴定中心提供。
以下实施例中使用的方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂耗材和仪器如下表3所示：
表3
实施例1、对本发明的对男性个体进行Y-STR分型的方法和系统准确性的验证
在本实施例中，所述男性个体为193份男性人抗凝血，已知其个体来源，但在本申请实施例1的实施过程中设定其个体来源未知，采用本申请方法和系统对其进行Y-STR分型，包括：
1)利用本发明的系统中的DNA获取体系获得男性个体的DNA，2)利用本发明的系统中的复合检测体系获得所述DNA包括24个Y-STR基因座以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型，并根据该基因型获得该个体的Y-STR分型结果，3)利用本发明的系统中所述推断体系，根据所述个体的Y-STR分型结果对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分来源，和/或男女混合样本中男性成分来源推断。
本实施例中，所述复合检测体系用于利用所述扩增引物获得所述DNA包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的扩增产物，并由所述扩增产物获得男性个体的DNA的25个基因座的基因型，并进一步由该基因型获得所述个体的Y-STR分型结果；
所述24个Y-STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617；
所述扩增引物由与所述25个基因座对应的扩增引物组成，其中基因座DYS460的扩增引物对应于SEQ ID No.1至SEQ ID No.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的扩增引物相同，为SEQ ID No.3至SEQ ID No.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的扩增引物分别对应于SEQ ID No.5至SEQ ID No.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.13至SEQ ID No.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的扩增引物分别对应于SEQ ID No.15至SEQ ID No.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.39至SEQ ID No.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的扩增引物分别对应于SEQ ID No.41至SEQ ID No.44的核苷酸序列。
1、获得含上述192个男性个体DNA的192份血卡作为实验样本，并使用标准DNA9948作为阳性对照样本。
2、利用所述复合检测体系对上述样本进行25个基因座的分型，包括：使用所述扩增引物对DNA模板进行多重PCR扩增，以获得扩增产物；将扩增产物利用遗传分析仪确定25个基因座的基因型。具体过程如下：
2.1、引物池配置
扩增引物池的配置，其中所述25个基因座对应的扩增引物如上所述；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
将合成好的引物用1×TE缓冲液稀释到100μM，将25个基因座的上下游引物等比混合，得到浓度为50μM的引物。从22管PCR引物中分别取不同体积加入到一个新的离心管中，作为22重PCR引物池，在该引物池中，各STR位点的引物的终浓度如下表4所示：
表4
| STR基因座 | 终浓度(μmol/L) |
| DYS460 | 0.15 |
| DYS389 I/II | 0.3 |
| DYS390 | 0.23 |
| DYS392 | 0.5 |
| Amelogenin | 0.15 |
| DYS458 | 0.2 |
| DYS437 | 0.3 |
| DYS385a/b | 0.3 |
| GATA-H4 | 0.4 |
| DYS522 | 0.4 |
| DYS456 | 0.15 |
| DYS391 | 0.24 |
| DYS447 | 0.26 |
| DYS438 | 0.32 |
| DYS448 | 0.32 |
| DYS617 | 0.5 |
| DYS393 | 0.15 |
| DYS635 | 0.3 |
| DYS439 | 0.3 |
| DYS19 | 0.4 |
| DYS444 | 0.36 |
| DYS527a/b | 0.4 |
2.2、多重PCR反应
本实施例使用9700型PCR扩增仪进行多重PCR反应。
(1)配置PCRmix(25μL体系)，如下表5所示。
表5
| 试剂名称 | 浓度 |
| PCR引物池 | 12.5μL |
| Tris-HCl | 20mM |
| KCl | 50mM |
| MgCl<sub>2</sub> | 1.6mM |
| 牛血清白蛋白 | 0.8mg/ml |
| Tween-20 | 0.2％ |
| 甘油 | 3.2％ |
| NaN<sub>3</sub> | 0.02％ |
| dNTP | 200μM |
| Taq DNA聚合酶 | 2U |
| 男性个体DNA模板卡片 | 0.25mm<sup>2</sup> |
| 总计 | 25μL |
(2)扩增程序
PCR扩增过程的热循环参数为：①95℃，11min；②28个循环，每个循环94℃1min，60℃1min，72℃1min；③60℃，60min；④25℃，保温。
2.3、PCR产物分型
待分型样品的准备：
1.电泳上样混合物的准备，按下面比率准备内标和去离子甲酰胺组成上样混合物：10μl Typer500内标+1000μl去离子甲酰胺，混合均匀。
2.每管加入10μl上样混合物、1μl扩增产物，混匀。
3.95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后电泳。
ABI3130XL型遗传分析仪上进行检测。应用ABI 3130XL Date CollectionSoftware 3.1收集数据，GeneMapper 3.3软件对电泳结果进行分析，获得所述25个基因座的基因型。
2.4、结果分析
使用本发明系统对193份DNA样品进行分型的一个代表性分型结果如图2所示，为了验证分型结果的准确性，从193份DNA样品中随机抽取100份DNA样品，对25个基因座进行测序(北京迈奥德恩生物科技有限公司测序)，采用本实施例的复合检测体系获得的所有的分型结果与测序结果均一致，一致性达到100％，此结果证本发明复合检测体系分型结果准确。
3、根据所述男性个体25个基因座的基因型获得该个体的Y-STR分型结果，并进行父系亲属鉴定。由本实施例方法获得的上述193份检材的父系亲属鉴定结果，与其已知的个体父系亲属鉴定结果一致，说明本发明方法可以进行男性个体的父系亲属鉴定。
进一步的，上述25个基因座的基因型也可以用于对男性个体进行家系排查、男女混合样本中男性成分来源推断，和/或男男混合样本中男性成分来源推断。
实施例2本发明检测系统与专利CN103866019中检测体系的比较
1.本发明检测系统与专利CN103866019检测体系中针对各基因座所设计的引物扩增各等位基因的扩增产物大小范围如下：
专利CN103866019：
本申请(其中图1显示了本申请各基因座的扩增产物排布图)：
从黑线标示可看出，专利CN103866019中DYS460和DYS389II扩增产物排布过紧密，会造成以下两种问题：
问题1)、等位基因分型标准物(ladder)分型错误。
图3显示了使用专利CN103866019系统获得的等位基因分型标准物(ladder)的分型图，可以看出，所示专利CN103866019，基因座DYS438和DYS389II的等位基因分型标准物分型错位，DYS438的第一个峰应该是7，红框标示，第一个峰识别错误，由于该错误导致后续全部错位。本领域技术人员公知等位基因分型标准物分型错误将必然导致无法对样本进行正确分型。
图4显示了使用本申请系统获得的等位基因分型标准物(ladder)的分型图，可以看出，各等位基因位点之间排布均匀，且引物特异性高，可以得到完整的STR分型，峰型尖锐清晰，平衡性好。
问题2)、本该是前一个基因座的分型，却在下一个基因座的范围内，无法判读。
比如DYS460的等位基因分布是7,8,9,10,11,12,13(https://yhrd.org/tools/marker/DYS460，YHRD数据库)。我们对812个男性样本的基因座DYS460做了测试，发现其中有4个样本的分型是13，有两个样本是14,如下表所示。
LOCUS:DYS460
| 等位基因分型 | 样本个数 | 频率 |
| 8 | 1 | 0.0012 |
| 9 | 195 | 0.2401 |
| 10 | 328 | 0.4040 |
| 11 | 268 | 0.3300 |
| 12 | 14 | 0.0172 |
| 13 | 4 | 0.0049 |
| 14 | 2 | 0.0025 |
GD:0.67
对于专利CN103866019，当DYS460出现分型是13时，对应峰的位置是120bp，14对应124bp。而DYS458的范围大小是121bp-164bp，所以用专利CN103866019的系统，DYS460等位基因14会在DYS458的范围内，DYS458出现两个峰而无法准确判断。DYS460分型为14的样本会在图5所示红框的位置。因此，对于DYS460基因座的一些等位基因类型，专利CN103866019系统是无法准确进行分型的。而本申请方案中，由于申请人对各基因座等位基因的引物，以及特定的基因座的组合和排布进行重新设计，使得不存在上述问题，由以上本申请的各等位基因的扩增产物大小范围可知，DYS460等位基因14不会错误的出现在下一个基因座DYS389I的位置上。
2.本发明检测系统与专利CN103866019检测系统稳定性比较
申请人经过试验验证，本发明的检测系统在引物池(引物mix)和PCR缓冲液混合一周以内都可以稳定的检测出各基因座的等位基因，而CN103866019检测系统在引物池和PCR缓冲液混合后，至少对于DYS389II基因座对应的扩增产物会因为引物之间形成二聚体而逐渐降低，两小时DYS389II基因座会因为其扩增产物低于检出限而发生等位基因分型缺失，如下表所示，等位基因分型成功比例随时间延长不断减少，一天以后基本上无法进行分型，而本申请系统在放置一周以后仍然能够对所有等位基因进行成功分型，上述系统PCR体系均采用常规的酶和试剂：
对于基因座DYS389II：
本发明检测系统与专利CN103866019检测系统相比，具有高的检测稳定性，能够更为准确，完整的获得男性个体基因座各等位基因的分型，能为后续的对男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分的检测及多个男性混合样本中男性成分的检测提供准确、完整的数据。
序列表
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 一种对男性个体进行Y-STR分型的方法和系统
<130> 160616GF
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
cgaggaatct gacacctc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gcattccata tcatctatc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
atcttctgta tccaactctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ggcttatccc tgagtagcag 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
cgataatatt ttacacattt t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
cagggtgaca gtaaaatgaa 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
aatcagaccc agttgatgca a 21
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
agacgctcca aaggaccca 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
aactcagcaa caggaatga 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
ctatggttct ggcattacaa g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
gactatgggc gtgagtgcat 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
aaacagagga agaccctgtc attc 24
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
ctgaagagct agacaccat 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
atcgcattcc aattacatag t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
ttagcacttt cagcacatca c 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gactctttcc tctgatggtg 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
gcccatccaa atcattcata at 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
agccggtgct ggaagacaga 20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
atcgttggga ccttgtgata atg 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
attagggttc tctagaggga cag 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
gctgttccct attcattcaa tcat 24
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
ctatagggag acggaataaa a 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
attcgtgtta tctctgcctt 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
tgactggtgt gtcacagcat g 21
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
agtccatgac agctgatgc 19
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
gtggcagacg cctataatcc 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
tgacgttgtc aaagagcttc aa 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tttattccgc tgtgttggag a 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
gctggagtca ttcctaatgt gg 22
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
aaactttgag gtatgtctca ta 22
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
ctgtcatgga atgctctctt g 21
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
aatctgccca aatatcca 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
atgctcgagt tgttatgg 18
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
ctgaagtggc ttggaattc 19
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
ctagcgtcaa tctctgcacc tg 22
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ctgaatgact actgagtttc t 21
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
atgtgtatga aaggtgtgaa cca 23
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
tgtacggctg tctaagggat c 21
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
gtcgttatcg caaacatag 19
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
gatgcattct aggaagatta 20
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
tgtaggcagg ttttatggag g 21
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
agtccgggag tgatagcatt ag 22
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
cctgggctct gtaaagaata gtg 23
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
agagcttaaa ctgggaagct g 21
Claims (8)
1.一种对男性个体进行Y-STR分型的方法，其特征在于，该方法包括：
1)获得所述男性个体的DNA；
2)获得所述DNA包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型，所述24个Y-STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，包括采用与所述基因座对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；
其中基因座DYS460的扩增引物对应于SEQ ID No.1至SEQ ID No.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的扩增引物相同，为SEQ ID No.3至SEQ ID No.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的扩增引物分别对应于SEQ ID No.5至SEQ ID No.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.13至SEQ ID No.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的扩增引物分别对应于SEQ ID No.15至SEQ ID No.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.39至SEQ ID No.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的扩增引物分别对应于SEQ ID No.41至SEQ ID No.44的核苷酸序列；
3)根据所述男性个体25个基因座的基因型获得所述男性个体的Y-STR分型结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物为荧光标记引物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中2)还包括在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述25个基因座的基因型的步骤。
4.一种对男性个体进行Y-STR分型的系统，其特征在于，所述系统包括DNA获取体系，复合检测体系、推断体系；
所述DNA获取体系用于获得所述男性个体的DNA；
所述复合检测体系用于获得所述DNA包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的基因型，并根据该基因型获得该个体的Y-STR分型结果，
所述24个Y-STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，获得所述25个基因座的基因型的过程包括采用与所述基因座对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；
其中基因座DYS460的扩增引物对应于SEQ ID No.1至SEQ ID No.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的扩增引物相同，为SEQ ID No.3至SEQ ID No.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的扩增引物分别对应于SEQ ID No.5至SEQ ID No.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.13至SEQ ID No.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的扩增引物分别对应于SEQ ID No.15至SEQ ID No.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.39至SEQ ID No.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的扩增引物分别对应于SEQ ID No.41至SEQ ID No.44的核苷酸序列；
所述推断体系用于根据所述个体的Y-STR分型结果对该男性个体进行家系排查、父权亲权鉴定、男女混合样本中男性成分来源推断，和/或男男混合样本中男性成分来源推断。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述引物为荧光标记引物。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于，所述复合检测体系还用于在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述25个基因座的基因型。
7.一种复合检测体系，其特征在于，所述体系包括：男性个体DNA，扩增引物，
所述复合检测体系用于利用所述扩增引物获得所述DNA包括24个Y-STR基因座、以及性别决定基因座Amelogenin在内共25个基因座的扩增产物，并由所述扩增产物获得男性个体的DNA的25个基因座的基因型，并进一步由该基因型获得所述个体的Y-STR分型结果，
所述24个Y-STR基因座为DYS460，DYS389I/II，DYS390，DYS392，DYS458，DYS437，DYS385a/b，GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444，DYS527a/b，DYS617，
所述扩增引物由与所述25个基因座对应的扩增引物组成，其中基因座DYS460的扩增引物对应于SEQ ID No.1至SEQ ID No.2的核苷酸序列；基因座DYS389I/II的扩增引物相同，为SEQ ID No.3至SEQ ID No.4的核苷酸序列；基因座DYS390，DYS392，DYS458，DYS437的扩增引物分别对应于SEQ ID No.5至SEQ ID No.12的核苷酸序列；基因座DYS385a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.13至SEQ ID No.14的核苷酸序列；基因座GATA-H4，DYS522，DYS456，DYS391，DYS447，DYS438，DYS448，DYS393，DYS635，DYS439，DYS19，DYS444的扩增引物分别对应于SEQ ID No.15至SEQ ID No.38的核苷酸序列；基因座DYS527a/b的扩增引物相同，为SEQ ID No.39至SEQ ID No.40的核苷酸序列；基因座DYS617，Amelogenin的扩增引物分别对应于SEQ ID No.41至SEQ ID No.44的核苷酸序列。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求7所述的复合检测体系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611083685.6A CN106520980B (zh) | 2016-11-30 | 2016-11-30 | 一种对男性个体进行y-str分型的方法和系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611083685.6A CN106520980B (zh) | 2016-11-30 | 2016-11-30 | 一种对男性个体进行y-str分型的方法和系统 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106520980A CN106520980A (zh) | 2017-03-22 |
| CN106520980B true CN106520980B (zh) | 2019-11-05 |
Family
ID=58353790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611083685.6A Active CN106520980B (zh) | 2016-11-30 | 2016-11-30 | 一种对男性个体进行y-str分型的方法和系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106520980B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866201B (zh) * | 2017-05-16 | 2021-06-29 | 公安部物证鉴定中心 | 一种基于y-str基因座的复合扩增体系及其专用引物组合 |
| CN109136385A (zh) * | 2017-10-20 | 2019-01-04 | 江苏苏博生物医学科技南京有限公司 | 一种提高个体识别率的y-str基因座的荧光标记检测试剂盒 |
| CN111286548B (zh) * | 2020-04-13 | 2022-06-21 | 公安部物证鉴定中心 | 基于二代测序技术检测68个基因座的试剂盒及其使用的引物组合 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103866019A (zh) * | 2014-03-11 | 2014-06-18 | 公安部物证鉴定中心 | Y-str荧光复合扩增检验试剂 |
| CN104911247A (zh) * | 2014-03-11 | 2015-09-16 | 公安部物证鉴定中心 | 一种用于样本排查的dna检验试剂及专用引物 |
-
2016
- 2016-11-30 CN CN201611083685.6A patent/CN106520980B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103866019A (zh) * | 2014-03-11 | 2014-06-18 | 公安部物证鉴定中心 | Y-str荧光复合扩增检验试剂 |
| CN104911247A (zh) * | 2014-03-11 | 2015-09-16 | 公安部物证鉴定中心 | 一种用于样本排查的dna检验试剂及专用引物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 24个Y-STR基因座荧光标记复合检测体系的建立及其法医学应用;刘宏;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20130415(第04期);摘要，第7页第1段，第9页第1段 * |
| Comprehensive annotated STR physical map of the human Y chromosome:Forensic implications;Erin K.Hanson et al.;《Legal Medicine》;20051207;第8卷;第110-120页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106520980A (zh) | 2017-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5456950B2 (ja) | 短いタンデム反復遺伝子座の多重増幅 | |
| EP3607065B1 (en) | Method and kit for constructing nucleic acid library | |
| CN109468384B (zh) | 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒 | |
| CN102703595B (zh) | 一种碱基选择性可控延伸的str序列高通量检测方法及其检测试剂 | |
| CN106755340A (zh) | 一种利用26个y‑str基因座对男性个体进行y‑str分型的方法和系统 | |
| CN104131072B (zh) | 一种对未知检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统 | |
| CN105463116B (zh) | 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法 | |
| CN106520980B (zh) | 一种对男性个体进行y-str分型的方法和系统 | |
| EP2971087B1 (en) | Assessing dna quality using real-time pcr and ct values | |
| CN109880911A (zh) | 25个人类染色体基因座的复合扩增试剂盒及其应用 | |
| CN105039322B (zh) | Dna标签序列及测序文库构建方法和试剂盒 | |
| US20130178389A1 (en) | Composite assay for developmental disorders | |
| CN106480198B (zh) | 一种对未知检材进行个体识别的方法和系统 | |
| CN106521013B (zh) | 一种针对微量、降解检材的str试剂盒及其应用 | |
| CN107841566B (zh) | 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用 | |
| CN106029902A (zh) | 用于多重分析13个mr y-str的试剂盒和方法 | |
| CN106939334B (zh) | 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法 | |
| CN106244717B (zh) | 一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统 | |
| CN106065417B (zh) | 一种str分型系统及试剂盒 | |
| CN110066792A (zh) | 一种同步检测23个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒 | |
| CN107254516A (zh) | 一种六色荧光str分型方法和系统 | |
| CN108342489A (zh) | 一种对男性个体进行y-snp分型的方法和系统 | |
| EP2024508A2 (en) | Allele detection | |
| CN109762909A (zh) | 一种用于降解检材法医学个体鉴识的44个InDels位点复合扩增检测试剂盒 | |
| CN108517364A (zh) | 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |