CN114058728B - 一套用于茶枝柑品系鉴定的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一套用于茶枝柑品系鉴定的分子标记及其应用，所述分子标记包括表2‑3中给出的337个SNP位点，所述茶枝柑为大洞5号、大种油身和细种油身。本发明优点有：所用的SNP位点少，品系鉴定准确，有利于遗传育种的应用，避免品系退化，为保障陈皮市场的品质提供基础。

Description

一套用于茶枝柑品系鉴定的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因检测技术领域，尤其涉及植物品种鉴定技术。

背景技术

陈皮(Pericarpium CitriReticulatae)是我国一味传统中药，又名陈橘皮、橘皮；是芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培种的干燥果皮。陈皮根据产地可分为“陈皮”及“广陈皮”。自古“广陈皮”就为陈皮药材的上等品。晚清医书《本草害利》中便有“以广东新会皮为胜，陈久者良，故名陈皮”的记载。茶枝柑(Citrus reticulatacv.Chachiensis)是广陈皮的原植物，属芸香科(Reticulata)柑橘属(Citrus)，主产于广东省江门市新会区。茶枝柑别名大红柑、新会柑；是当地传统栽培柑橘品种。

茶枝柑是经过长期选育、培育而来的广东新会优良选系；最早的栽培活动记载于宋朝。经过数百年的自然杂交、芽变及人为栽培，茶枝柑形成了果形及株形差异明显的不同品系。在建国前，新会茶枝柑可分为大种油身(大种油皮)、细种油身(细种油皮、油皮仔)、大蒂柑(大地柑、粗粒)、高蒂柑(高笃)、短枝密叶等5个品系。随着20世纪60年代茶枝柑品系资源的普查及品种资源库的建立，当时认为最优秀的品系——大种油身被大力推广。当地也重新选育出大洞株系(选育自大种油身)、夏桥株系、杜江株系等优良株系。上世纪八十年代，选自大洞株系的单株大洞5号在全国柑橘鉴评中被评为优秀单株，从而开始在新会当地推广种植。而过去主栽培的5个品系中，大蒂柑、高蒂柑与短枝密叶也由于品系质量过低或其他环境、人为因素被逐渐淘汰，仅存少量资源保留。故目前茶枝柑在新会的品系有大种油身、细种油身、大洞5号等，且普遍认为此三个品系的果皮香气差异较大；特别是细种油身的香气较为清新，与其他两个品系浓郁的香气相比，差异明显。但是品种选育与后期推广工作的不足，致使目前茶枝柑的种植已存在较为严重的品系混杂的情况。

茶枝柑种植过程中，育苗制度不严。这种现状导致茶枝柑种苗市场混乱。部分商品苗培育、销售商以假充真，以次充好。这使得陈皮市场同样出现品质优劣混杂，滥竽充数的情况。新会除少部分种植经验丰富的老柑农外，多数柑农并不明确自己果园内的果树品系。

品种/品系混杂一般与生物学混杂和机械混杂有关。生物学混杂指天然杂交等造成基因型混杂、性状分离，从而影响品种/品系的纯度。茶枝柑种植以无性繁殖方式为主；种子中的合子胚也多败育，实生苗多由珠心胚发育而来，其遗传背景应当比较简单。但是由于茶枝柑存在自然芽变，且通常劣变大于优变。故芽变材料的流通，也会导致其生物学上的混杂。同时，机械混杂也是品种/品系混杂的重要原因。种苗品系混杂会导致种性下降，这是容易导致茶枝柑种苗出现品系退化，或加剧其品系衰退原因之一。

因此，若能研发出一种能够准确鉴定茶枝柑品系的方法，维持茶枝柑种苗品系，将对保障陈皮市场的品质提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一套用于茶枝柑品系鉴定的分子标记及其应用，以解决现有技术中茶枝柑品系混杂的问题。

为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

一套用于茶枝柑品系鉴定的分子标记，所述分子标记包括表2-3中给出的337个SNP位点，所述茶枝柑品系为大洞5号、大种油身和细种油身。

进一步地，所述分子标记是由表2-3中给出的337个SNP位点组成，所述茶枝柑品系为大洞5号、大种油身和细种油身。

本发明还提供所述的分子标记在茶枝柑品系鉴定中的应用。

所述的分子标记茶枝柑品系鉴定的应用，步骤包括：

将待测样品基因组DNA的对应表2-3中337个SNP位点的基因型与表2-3中给出的337个SNP位点基因型进行分析，确定待测样品是否为茶枝柑品系的其中一个品种。

更优地，所述将待测样品基因组DNA的对应表2-3中337个SNP位点的基因型与表2-3中给出的337个SNP位点基因型分析的操作是采用主成分分析方法，结合Genome-wideComplex Trait Analysis，版本：1.26.0，计算PCA值，通过计算得到的PCA值绘制PCA图。

本发明的优点包括：以表2-3所示的337个SNP位点为依据，大洞5号、大种油身和细种油身为标准样品，对待测样品的DNA信息进行茶枝柑品系鉴定；所用的SNP位点少，品系鉴定准确，有利于遗传育种的应用，避免品系退化，为保障陈皮市场的品质提供基础。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：

图1是实施例一基于337个SNP标记位点的邻接法系统分类树；

图2是实施例一基于337个SNP标记位点的PCA聚类结果图；

图3中的A是图2中大种油身分布区域的放大图；

图3中的B是图2中细种油身分布区域的放大图；

图4-6是海头大围茶枝柑品系样品的PCA聚类结果图。

具体实施方式

下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

样品DNA提取与检测

本实施例采用植物基因组DNA快速提取试剂盒(N1192)，厂家：广州东盛生物科技有限公司，对植物组织样品DNA进行提取，具体操作如下；

1.取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。

2.研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GPL的离心管中，加入1μl RNase，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混匀样品。

3.加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min。

4.小心将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入等体积缓冲液GPD，充分混匀。

5.将混匀的液体转入纯化柱，静置1min，12,000rpm离心30sec,弃滤液。(纯化柱容积为700μl左右，可分次加入离心。)

6.向纯化柱中加入500μl去蛋白液PS。12,000rpm离心30sec，弃滤液。

7.向纯化柱中加入500μl漂洗液PE。12,000rpm离心30sec，弃滤液。

8.重复步骤7，向纯化柱中加入500μl漂洗液PE。12,000rpm离心30sec，弃滤液。

9.离心纯化柱，12,000rpm离心2min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

10.将纯化柱置于新的1.5ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加40-100μl纯化液TE。室温放置2min。12,000rpm离心2min，管底即为高纯度基因组DNA。-20℃保存。

11.采用1％琼脂糖电泳检测样品DNA是否有降解及蛋白杂质，采用NanoDrop 2000spectrophotometer(Thermo Scientific)分光光度计检测样品纯度(OD260/280)，采用Invitrogen Qubit Fluorometer进行DNA浓度检测。

文库构建与高通量测序

采用Illumina测序仪标准DNA文库建库试剂盒，检测合格后的样品DNA根据Illumina DNA文库构建标准流程，构建插入片段大小约为350bp的双末端测序文库，国产替代试剂盒的建库方法和策略类似。所述插入片段是指连接在测序接头内部需要测序的样品DNA片段。因此，文库指的是两侧为测序接头，中间为需要测序的样品DNA片段的合成DNA序列。文库构建完成后以qPCR方法和Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies,USA)进行质控，DNA片段大小分布符合正态分布的DNA测序文库为合格。对质检合格的DNA测序文库采用Illumina Novaseq6000(Illumina,USA)高通量测序平台进行测序，测序策略为PE150(Pair-End 150)，每样品测序量为6Gb。

分子标记检测

本实施例选取大洞5号，大种油身，细种油身3个品系进行取样，具体取样信息如表1所示，3个品系各自为1个组别，每个组别选取8个样品，3个品系共选取24个样品。

表1

参照上文所述的样品DNA提取与检测、文库构建与高通量测序方法对3个组别24个样品一一获得相应的DNA测序文库的测序数据。

从NCBI公共数据库获取柑橘基因组Citrus reticulata(版本号ASM325862v1)，基因组大小344Mb。采用bwa(版本0.7.17-r1188)的mem比对策略以柑橘基因组为参考序列，对上述所得的3个组别24个样品测序数据进行双末端比对，选取双末端都能比上的reads，然后采用samtools(版本1.9)序列分析软件的sort和mpileup功能对所述reads进行SNP检测。针对3个组别(大洞5号，大种油身，细种油身)的24个样品按以下条件进行SNP筛选：3个组别(大洞5号，大种油身，细种油身)任一组内要求80％的样品SNP类型一致，且其与另外2组样品的SNP位点不一致，根据以上筛选条件共计获得337个SNP位点。NCBI公共数据库柑橘基因组Citrus reticulata(版本号ASM325862v1)的参考基因组(染色体)、所述337个SNP位点如下表2-3所示：

表2

表3

表2、3说明：NO.是茶枝柑品系SNP位点代号；Chr是NCBI公共数据库中柑橘基因组Citrus reticulata(版本号ASM325862v1)的参考基因组(染色体)序列号；Pos是SNP在参考基因组(染色体)序列上的位置；Ref是参考基因组(染色体)序列SNP位点的碱基型；DDa、DDd、DDb、DDe、DDc、DDf、DDg、DDh、DZa、DZd、DZb、DZe、DZc、DZf、DZg、DZh、XZa、XZd、XZb、XZe、XZc、XZf、XZg、XZh中的两个字符代表每一行位点上的基因型。

邻接法构建系统树与主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)

基于筛选获得的337个SNP位点，采用邻接法构建系统树，如图1所示。采用PCA(principal components analysis)即主成分分析方法，结合(GCTA)Genome-wide ComplexTrait Analysis(版本：1.26.0)计算PCA值，通过计算得到的PCA值绘制PCA图，如图2所示。图3的A是图2中大种油身分布区域的放大图，图3的B是图2中细种油身分布区域的放大图，结果显示，邻接法系统树和PCA分析都能很好地对三个品系进行分组。

实施例二

本实施例以大洞5号，大种油身，细种油身为标准样品，选取24个海头大围茶枝柑品系样品(HTDW17-40)作为待测样品进行鉴定测试，具体取样信息如下表4所示。

表4

本实施例参照实施例一所述的样品DNA提取与检测、文库构建与高通量测序方法、分子标记检测方法筛选出24个待测样品(HTDW17-40)的337个SNP位点，再把24个待测样品(HTDW17-40)的337个SNP位点的基因型与实施例一获得的大洞5号8个样品，大种油身8个样品，细种油身8个样品的337个SNP位点的基因型一同参照实施例一的PCA分析方法进行处理。得到海头大围样品的PCA鉴定结果如图4-6所示，均鉴定为大种油身品系。需要说明的是，可以同时检测24个待测样品，也可以把24个检测样品分批进行检测，不影响结果。24个待测样品、标准样品可以集中在同一个PCA鉴定结果图中显示，申请人为能够尽量清晰显示24个待测样品的鉴定情况，所以用图4-6显示。不管是在同一张结果图中显示还是分开若干个结果图显示，均不影响结果。

待测样品HTDW17-40的337个SNP位点的基因型如表5-6所示。

表5

表6

表5、6说明：NO.是茶枝柑品系SNP位点代号；Chr是NCBI公共数据库中柑橘基因组Citrus reticulata(版本号ASM325862v1)的参考基因组(染色体)序列号；Pos是SNP在参考基因组(染色体)序列上的位置；Ref是参考基因组(染色体)序列SNP位点的碱基型；HTDW17、HTDW18、HTDW19、HTDW20、HTDW21、HTDW22、HTDW23、HTDW24、HTDW25、HTDW26、HTDW27、HTDW28、HTDW29、HTDW30、HTDW31、HTDW32、HTDW33、HTDW34、HTDW35、HTDW36、HTDW37、HTDW38、HTDW39、HTDW40中的两个字符代表每一行位点上的基因型。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (3)

1.检测表2和表3所示的337个SNP位点分子标记的试剂在茶枝柑品系鉴定中的应用，所述茶枝柑的学名为Citrus reticulata cv. Chachiensis，所述茶枝柑品系为大洞5号、大种油身和细种油身；

表2和表3中，NO.是茶枝柑品系SNP位点代号；Chr是NCBI公共数据库中版本号为ASM325862v1的柑橘Citrus reticulata的染色体参考基因组序列号；Pos是相应SNP位点在染色体参考基因组序列上的位置；Ref是染色体参考基因组序列在相应SNP位点的碱基型；DDa、DDd、DDb、DDe、DDc、DDf、DDg、DDh、DZa、DZd、DZb、DZe、DZc、DZf、DZg、DZh、XZa、XZd、XZb、XZe、XZc、XZf、XZg、XZh中的两个字符代表每一行位点上的基因型；DZa-h是大种油身，DDa-h是大洞5号，XZa-h是细种油身。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

步骤包括：将待测样品基因组DNA的所述337个SNP位点的基因型与表2-3所示的选取自大洞5号、大种油身和细种油身的3个茶枝柑品系的24个标准样品的所述337个SNP位点的基因型进行主成分分析（PCA），确定待测样品是否为所述茶枝柑品系的其中一个品系。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述PCA分析是采用Genome-wide Complex TraitAnalysis版本1.26.0，计算PCA值，通过计算得到的PCA值绘制PCA图。