CN116004897B - 一种金粟兰属内不同物种的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金粟兰属内不同物种的鉴别方法，属于分子生物学领域。本发明提供一种鉴别金粟兰属内不同物种的SNP位点组合，包括12个SNP位点，所述SNP位点组合分别位于金粟兰psaI基因组序列第7和39位，petL基因组序列第59和72位，rpl2基因组序列第93、500、807和811位，psbZ基因组序列第41、58和89位，rps8基因组序列第214位。本发明能够准确鉴定金粟兰属内10个物种，耗时短，克服了传统形态鉴定的弊端，本发明为金粟兰属内10个物种的准确分类鉴定提供了重要保障。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种金粟兰属内不同物种的鉴别方法。
背景技术
金粟兰属(Chloranthus Sw.)隶属于金粟兰科(Chloranthaceae)，是早期演化的被子植物类群之一，产地遍及各大洲，是研究被子植物起源与演化的理想类群。该属内的一些种类(金粟兰和鱼子兰)被作为园林观赏植物广泛栽培，一些种类(宽叶金粟兰(C.henryi)、银线草(C.japonicus)、丝穗金粟兰(C.fortunei)、及己(C.serratus)、网脉金粟兰(C.nervosus)等)为传统的中药植物被广泛使用，但存在严重的实名混淆问题。因为该属内一些形态特征(叶、叶片数量、叶缘形态、植株大小等)极为相似，如果仅依据传统的形态分类很难将物种不同生长时期的植株(尤其是生长的初期)区分。尽管已有文献资料论述了该属内植物较为可靠的形态分类特征为花部器官(尤其药隔形态)(卢永彬，etal.2019)，然而，植物生长均会经历较为漫长的营养生长期，那么开展对金粟兰属内营养生长期物种的分类鉴定，则需要提供一套更为准确的物种的分类标准。
发明内容
本发明的目的是提供一种金粟兰属内不同物种的鉴别方法，以解决上述现有技术存在的问题，该鉴定方法能够准确鉴定金粟兰属内10个物种，耗时短，克服了传统形态鉴定的弊端，并为金粟兰属内不同物种的分类鉴定提供重要保障。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种鉴别金粟兰属内不同物种的SNP位点组合，包括12个SNP位点，所述SNP位点组合分别位于金粟兰psaI基因组序列第7和39位，petL基因组序列第59和72位，rpl2基因组序列第93、500、807和811位，psbZ基因组序列第41、58和89位，rps8基因组序列第214位；
所述psaI基因组序列如SEQ ID NO：1所示；所述petL基因组序列如SEQ ID NO：2所示；所述rpl2基因组序列如SEQ ID NO：3所示；所述psbZ基因组序列如SEQ ID NO：4所示；所述rps8基因组序列如SEQ ID NO：5所示。
本发明还提供一种金粟兰属内不同物种的鉴别方法，包括以下步骤：
提取待测植株DNA后进行文库构建，通过二代测序获得金粟兰属内不同物种浅层基因组序列，通过生物信息学方法组装叶绿体全基因组，经比对筛选出物种间差异基因片段，根据物种间差异基因片段的SNP位点组合判断待测植株物种。
进一步地，所述物种间差异基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-5所示。
进一步地，若psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第39位碱基型为G，则判定该物种为C.japonicus；若petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59位为T，则判定该物种为C.serratus；若rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93位碱基型为G和第500位为T，则判定该物种为C.japonicus；若rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807和811的碱基型分别为A，C，C和T，且psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第39位碱基型为C，则判定该物种为C.nervosus；若psbZ基因片段在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位分别为C，T，C碱基型且rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93位碱基为A，则判定该物种为C.spicatus；若petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59位为C且psbZ基因片段在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位碱基型分别为C，C，C，则判定该物种为C.henryi；若rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第500位为C且psbZ基因片段在如SEQID NO：4所示序列第41，58，89位分别为T，C，C，则判定该物种为C.oldhamii；若psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第7和39位，petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59和72位，rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807，811位，psbZ基因片段在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位以及rps8基因片段在如SEQ ID NO：5所示序列第214位分别为G，C，C，G，A，C，T，T，C，C，T和A，则判定该物种为C.angustifolius；若psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第7和39位，petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59和72位，rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807，811位，psbZ基因片段在如SEQ IDNO：4所示序列第41，58，89位以及rps8基因片段在如SEQ ID NO：5所示序列第214位分别为G，C，C，G，A，C，T，T，C，C，T，G，则判定该物种为C.fortunei。
进一步地，金粟兰属内不同物种包括宽叶金粟兰(C.henryi)、银线草(C.japonicus)、丝穗金粟兰(C.fortunei)、及己(C.serratus)、网脉金粟兰(C.nervosus)、华南金粟兰(C.sessilifolius)、中国台湾金粟兰(C.oldhamii)、狭叶金粟兰(C.angustifolius)、鱼子兰(C.erectus)和金粟兰(C.spicatus)。
本发明公开了以下技术效果：
本发明主要利用基因组浅层测序(Genome Skimming)，通过二代测序技术获得全基因组较低测序深度基因组数据，借助于生物信息学手段，得到叶绿体全基因组序列数据，并通过对比75个(筛选特异性片段样本)金粟兰植物材料的叶绿体基因组全长数据，筛选到了能完全区分金粟兰属内10个物种的叶绿体基因组的5个种间差异基因petL，psaI，rpl2，psbZ和rps8，将5个种间差异基因的编码区序列进行种间多序列比对，获得区分金粟兰属内10种物种植株的碱基位点组合信息，并在更多金粟兰属植物样本(36个，验证特异性片段样本)中得以验证。本发明提供的鉴定方法能够准确鉴定金粟兰属内10个物种，耗时短，克服了传统形态鉴定的弊端，本发明为金粟兰属内10个物种的准确分类鉴定提供重要保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为psaI基因多序列比对结果；
图2为petL基因多序列比对结果；
图3、图4和图5为rpl2基因多序列比对结果；
图6为psbZ基因多序列比对结果；
图7为rps8基因多序列比对结果；
图8为本发明构建的系统进化树；
图9为验证本发明的系统发育树。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
叶绿体是所有绿色植物特有的细胞器。该基因组多为单拷贝，其序列和结构都相当保守，分子性状的同源性更为容易确定，可被应用于植物的系统发育研究。为了更准确地鉴定既具有园艺品种也具有丰富药用资源物种，更为重要的是极具科研价值的金粟兰属内10个物种的分类鉴定，包括宽叶金粟兰(C.henryi)、银线草(C.japonicus)、丝穗金粟兰(C.fortunei)、及己(C.serratus)、网脉金粟兰(C.nervosus)、华南金粟兰(C.sessilifolius)、中国台湾金粟兰(C.oldhamii)、狭叶金粟兰(C.angustifolius)、鱼子兰(C.erectus)和金粟兰(C.spicatus)，本发明通过对111个金粟兰植物材料的叶绿体基因组全长数据比对分析，旨在筛选到了能完全区分金粟兰属内10个物种的叶绿体基因组的编码序列。特此，通过二代测序开展下述研究：
1 材料与方法
1.1 材料
本发明的研究分析一共涉及111例金粟兰个体，隶属10个种，基本信息如下：
表1样品信息表
1.2试验方法
1.2.1DNA提取
将10个种的金粟兰新鲜叶片清理后硅胶干燥备用，CTAB法提取DNA(Allen etal.2006)。
1.2.2DNA浓度测定
在DNA文库构建前，Qubit 3.0测定样品DNA的浓度。试剂使用Qubit dsDNA HSAssay Kit双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒(Life Invitrogen,美国)。测定浓度后的样品稀释，准备DNA打断。将测定浓度后的样品DNA在打断管中稀释至浓度5ng/μL，65μL。
1.2.3DNA样品打碎
打断管放入Covaris超声波破碎仪中，将DNA打碎至500bp左右的长度。碎样后DNA片段长度检测:琼脂糖电泳检测，如果样品DNA片段偏大，需重新打碎DNA样品。
1.2.4DNA文库构建
1.2.4.1末端修饰和接头连接
使用UltraTM II试剂盒构建DNA文库。首先对样品DNA进行末端修饰和接头连接(adaptor ligation)。
1.2.4.2DNA片段筛选
接下来，磁珠接头筛选，筛选合适大小的DNA双链片段(400-500bp)，修饰后的DNA(加上插入部分，接头，底物等)双链片段按650bp算，第一次筛选加20μl的磁珠，第二次加10μl的磁珠。第一次筛选去掉大片段的DNA双链片段，第二次去掉过小的DNA双链片段。
筛选后的DNA片段取15μl至PCR管中，写上对应的编号。
1.2.4.3文库PCR
PCR管中加入筛选后的DNA样品、Q5、index、Master mix。每个index对应一个样品，测序时通过index编号区分DNA样品。
1.2.4.4DNA文库PCR产物纯化
将PCR产物移至1.5mL试管中，加45μL磁珠。混匀，静置5min，瞬离，上磁力架孵育5min；弃上清液，加300μl的80％酒精清洗，180度转动试管两次，静置，弃上清液；重复酒精清洗一次；吸干酒精，磁珠自然干燥；加33μl水，从磁力架上取出试管，在桌面上敲打，使磁珠在水中混匀；瞬离，混匀，静置5min，瞬离后上磁力架孵育5min。取30μl上清液至PCR管中，写上对应的编号。
1.2.4.5DNA片段浓度和大小测定
DNA文库片段大小和浓度测定。Qubit 3.0测定样品浓度A，测定浓度后样品稀释至30ng/μL左右，DNA浓度>30ng/μL的样品，使用On-Chip Electrophoresis芯片；DNA浓度≦30ng/μL的样品，使用Highly-sensitive Electrophoresis芯片。
配胶，将染料与胶混匀后过滤；准备DNA文库样品；在芯片注胶平台往芯片孔内加入胶、marker、ladder、DNA文库样品；将芯片置生物芯片系统上跑胶后读取DNA片段大小数据B。
样品混匀后送公司测序。将前面所得DNA大小和浓度代入公式(1.515×1000×A)/B(bp)，将文库稀释到3n mol。稀释后将所有的样品混匀后送去测序。
1.3数据处理
1.3.1叶绿体基因组组装
在Illumina HiSeq X-Ten测序平台完成叶绿体基因组测序(华大基因，北京)。每个物种，大约生成2.0GB的原始数据，双端150bp的读取长度。对原始序列读取进行筛选，去除低质量的序列。叶绿体基因组使用Spades 3.9.0(Bankevich et al.,2012)组装，从高质量数据中组装Contigs。
1.3.2叶绿体拼接
从NCBI下载已公布的金粟兰植物的叶绿体基因组作为参考(C.angustifolius：NC_062597.1；C.fortunei：NC_065306.1；C.japonicus：NC_026565.1；C.erectus：NC_039627.1；C.spicatus：NC_009598.1)，将组装的Contigs比对到参考基因组，获各测序样本的叶绿体基因组框架。
最后，将过滤的reads重新mapping到拼接好的叶绿体基因组框架上进行校正与检测，然后获得完整的叶绿体基因组序列。
1.4筛选物种间差异基因
1.4.1筛选方法：采用Nucleotide-Nucleotide BLAST 2.13.0+比对策略，将每个种种内的叶绿体编码基因分别单独进行相互比对，筛选比对结果为0gap和0mismatch的基因为种内保守基因。选择10个种种内均保守的基因，进行第二轮Nucleotide-NucleotideBLAST 2.13.0+比对，筛选物种间存在差异的基因，作为种间区分的分子标记。
通过以上分析，一共筛选到4个基因(petL，psaI，rpl2，psbZ)可从10个金粟兰种中区分出8个种，无法有效区分C.angustifolius和C.fortunei种，再重新从这2个种的种内保守基因取交集基因，单独进行种间比对，筛选C.angustifolius和C.fortunei中间有差异的基因，作为区分这两个种的分子标记。本次分析选取了rps8作为C.angustifolius和C.fortunei种间区分标记。5个种间差异基因的信息如下：
表2 5个种间差异基因的信息
1.4.2筛选目的基因的差异碱基
通过比对种间差异基因、分析各DNA片段的核苷酸多态性后筛选出合适的特异性片段，其在金粟兰属内10个物种中的序列如下，采用ESPript3.0(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)进行种间多序列比对，结果如图1-7所示(图中阴影位点碱基相同，空白处碱基为种间差异碱基)。
psaI基因特异片段(SEQ ID NO：1)：
ATGACAGATCTCAATTTACCCTCTATTTTTGTGCCTTTCGTGGGCCTAGTATTTCCGG CAATTGCAATGGCTTCTTTATCTCTTCATGTTCAAAAAAACAAGATTGTCTAG；
注：阴影部分代表psaI基因在金粟兰属内10个物种中的SNP位点，【G】代表G/T；【C】代表G/C，如图1所示。
petL基因特异片段(SEQ ID NO：2)：
ATGCCTACTATAACTAGTTATTTCGGTTTTTTACTGGCTGCTTCAACTATAACCTCAG CCCTATTGATTGGGCTGAGCAAGATACGACTTATTTGA；
注：阴影部分代表petL基因在金粟兰属内10个物种中的SNP位点，【C】代表C/T；【G】代表G/T，如图2所示。
rpl2基因特异片段(SEQ ID NO：3)：
ATACACTTATACAAAACTTCTACCCCGAGCACACGCAATGGAGCCGTAGACAGTCAAGTGAAATCCAATCCACGAAATAATTTGATCTATGGACAGCATCATTGTGGTAAAGGTCGTAATGCCAGAGGAATCATTACCGCAGGGCATAGAGGGGGAGGTCATAAGCGTCTATACCGTAAAATAGATTTTCGACGGAATGAAAAAGACATATCTGGTAGAATCGTAACCATAGAATACGACCCTAATCGAAATGCATACATTTGTCTCATACACTATGGGGATGGTGAGAAGAGATATATTTTACATCCCAGAGGGGCTATAATTGGAGATACCATTGTTTCTGGTACAGAAGTTCCTATATCAATGGGAAATGCCCTACCTTTGACCGATATGCCCTTAGGCACGGCCATACATAACATAGAAATCACACTTGGAAAGGGTGGACAATTAGCTAGAGCAGCAGGTGCTGTAGCGAAACTGATTGCAAAAGAGGGTAAATCGGCCACATTAAGATTACCATCTGGGGAGGTCCGTTTGATATCCAAAAACTGCTCAGCAACAGTCGGACAAGTGGGTAATGTTGGGGTGAACCAGAAAAGTTTGGGTAGAGCCGGATCTAAGTGTTGGCTAGGTAAGCGTCCTGTAGTAAGAGGAGTAGTTATGAACCCTGTAGACCATCCCCATGGGGGTGGTGAAGGGAGGTCCCCAATTGGTAGAAAAAAACCCACAACCCCTTGGGGTTATCCTGCGCTTGGAAGAAGAAGTAGGAAAAGGAATAAATATAGTGATAGTTTGATTCTTCGTCGTCGTTAATAG；
注：阴影部分代表rpl2基因在金粟兰属内10个物种中的SNP位点，从上到下依次为：【A】代表A/G，【C】代表C/T，【T】代表T/C，【T】代表T/A，如图4-5所示。
psbZ基因特异片段(SEQ ID NO：4)：
ATGACTATTGCTTTCCAATTGGCTGTTTTTGCATTAATTGCTACTTCATCAATCTTACTGATTAGTGTACCCGTTGTATTTGCTTCTTTTGATGGTTGGTCAAGTAACAAAAATGTTGTATTTTCCGGTACGTCGTTATGGATTGGATTAGTCTTTCTGGTAGCTATCCTTAATTCTCTCATCTCTTGA；
注：阴影部分代表psbZ基因在金粟兰属内10个物种中的SNP位点，从上到下依次为：【C】代表C/T，【C】代表C/T，【T】代表T/C，如图6所示。
rps8基因特异片段(SEQ ID NO：5)：
ATGGGTAAGGACACTATTGCCGATATAATAACTTCTATAAGAAATGCTGACATGGAAAAAAAAGGAACAGTTCGAATAGCATCTACTAATATAAGTGAAAACATTATTCAAATACTTCTACGAGAAGGTTTTATTGAAAACGTTAGGAAACATCGGGAAAACAACAAATATTTCTTGGTTTCAACCCTGCGACATAGAGGGAATAGGAAGGGAACATATAGAAATATTTTAAAGCGTATCAGCCGACCCGGTCTACGAATCTATTCGAACTATCAACGAATTCCTAGGATTTTAGGTGGAATGGGAATTGTAATTCTTTCTACTTCTCGAGGTATAATGACAGATCGAGAAGCTCGACTAGAAGGAATTGGAGGAGAAATTTTGTGTTATATATGGTAA；
注：阴影部分代表rps8基因在金粟兰属内C.angustifolius和C.fortunei 2个物种中的SNP位点，从上到下依次为：【A】代表A/G，如图7所示。
根据序列比对结果得知，差异基因区分金粟兰属内10种物种植株的碱基位点信息如表3所示：
表3种间区分碱基信息
注：阴影处的碱基为区分物种的标记位点；碱基位点信息是指该位点位于上述如SEQ IDNO：1-5所示的相应目的基因特异片段序列的位置；表格中N碱基表示任意碱基型。
表4种间区分标记与种信息
| petL | psaI | rpl2 | psbZ | rps8 | |
| C.japonicus | √ | ||||
| C.erectus | √ | ||||
| C.sessilifolius | √ | ||||
| C.serratus | √ | ||||
| C.henryi | √ | √ | |||
| C.oldhamii | √ | √ | |||
| C.nervosus | √ | √ | |||
| C.spicatus | √ | √ | |||
| C.angustifolius | √ | √ | √ | √ | √ |
| C.fortunei | √ | √ | √ | √ | √ |
注：√表示用于区分种所需基因。
结合表3和表4可知：
1、若psaI基因基因序列在如SEQ ID NO：1所示序列的第39号位点出现碱基型为G，则判定该物种为C.japonicus；
2、若petL基因序列在如SEQ ID NO：2所示序列的第59号位点出现碱基型为T，则判定该物种为C.serratus；
3、若rpl2基因序列在如SEQ ID NO：3所示序列的第93号位点碱基型为G，则判定该物种为C.erectus，若在第500号位点为T，则判定该物种为C.sessilifolius；
4、若rpl2基因在如SEQ ID NO：3所示序列的第93，500，807，811的碱基型分别为A，C，C，T且psaI基因在如SEQ ID NO：1所示序列的第39位碱基型为C，则判定该物种为C.nervosus；
5、若psbZ基因序列在如SEQ ID NO：4所示序列的第41，58，89位分别为C，T，C碱基型且rpl2基因序列在如SEQ ID NO：3所示序列的第93位碱基为A，则判定该物种为C.spicatus；
6、若petL基因序列在如SEQ ID NO：2所示序列第59位为C碱基且psbZ基因序列在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位碱基型分别为C，C，C，则判定该物种为C.henryi；
7、若rpl2基因序列在如SEQ ID NO：3所示序列第500位为C碱基且psbZ基因序列在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位分别为T，C，C基因，则判定该物种为C.oldhamii；
8、若psaI基因序列在如SEQ ID NO：1所示序列第7和39位，petL基因序列在如SEQIDNO：2所示序列第59和72位，rpl2基因序列在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807，811位，psbZ基因序列在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位以及rps8基因序列在如SEQ IDNO：5所示序列第214位分别为G，C，C，G，A，C，T，T，C，C，T，A，则判定该物种为C.angustifolius；
9、若psaI基因序列在如SEQ ID NO：1所示序列第7和39位，petL基因序列在如SEQIDNO：2所示序列第59和72位，rpl2基因序列在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807，811位，psbZ基因序列在如SEQ ID NO：3所示序列第41，58，89位以及rps8基因序列在如SEQ IDNO：3所示序列第214位分别为G，C，C，G，A，C，T，T，C，C，T，G，则判定该物种为C.fortunei。
1.5相似性矩阵
5个差异基因编码区序列分别采用CLUSTAL O(1.2.4)软件，默认参数进行比对，比对后的基因按照一定的顺序串联整合成该代表该物种的基因序列集，并通过CLUSTAL O(1.2.4)软件，设置--distmat-out--percent-id，--full参数获得相似矩阵结果。
表5相似性矩阵
1.6系统进化树
5个差异基因分别采用CLUSTAL O(1.2.4)软件、默认参数进行多序列比对，比对后的基因按照一定的顺序串联整合成该物种的基因序列集，用于后续构树。采用IQ-TREE2.0.5(http://www.iqtree.org/)软件对比对后的序列进行模型选择和构建最大似然法(ML法：Maximum Likelihood method)系统发育树，最优模型选择基于BIC(Bayesianinformation criterion scores)。构树参数设置为：-m MFP-B 1000-alrt 1000。本次进化树最优模型为：HKY+F。构建的系统进化树如图8所示，证实本发明筛选的5个差异基因标记能够区分金粟兰属内10个种，并能构建系统进化树，显示10个种的亲缘关系。
1.7样本验证
根据5个差异基因种间差异位点，为了检验筛选大的差异位点具有广泛的使用性，我们在更多的金粟兰属植物上进行了验证，步骤如下：
(1)浅层基因组测序：对表1样品信息表中的验证特异性的样本进行浅层基因组测序，方法步骤如上文1.2试验方法；
(2)叶绿体基因组组装：同1.3.1和1.3.2；
(3)特异性片段的筛选：对所有验证特异性的样本单独建库；分别以筛选出的5个种间差异基因petL，psaI，rpl2，psbZ和rps8为索引对验证特异性的样本库进行blast，获得验证样本的所有的特异性片段，结果同1.4.2筛选的如SEQ ID NO：1-5所示的片段一致；
(4)验证性样本多序列比对：利用mafft比对，查看对应变异的位点信息，结果同表3一致；
(5)构建系统发育树：对比对好的序列串联后，用IQtree构建系统树。
验证结果
图9为验证本发明的系统发育树，其中带有编号的表示为验证的样本，拉丁名不缩写的为筛选特异性片段的一致树。由此可见，采用本发明鉴定方法验证的多样本系统发育树与系统进化树显示的金粟兰属内10个物种亲缘关系相一致，证实本发明鉴定方法能够准确分类鉴定金粟兰属内10个物种。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种金粟兰属内不同物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测植株DNA后进行文库构建，通过二代测序获得金粟兰属内不同物种浅层基因组序列，通过生物信息学方法组装叶绿体全基因组，经比对筛选出物种间差异基因片段，根据物种间差异基因片段的SNP位点组合判断待测植株物种；
所述物种间差异基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-5所示；
若psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第39位碱基型为G，则判定该物种为C. japonicus；若petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59位为T，则判定该物种为C. serratus；若rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93位碱基型为G和第500位为T，则判定该物种为C. japonicus；若rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807和811的碱基型分别为A，C，C和T，且psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第39位碱基型为C，则判定该物种为C. nervosus；若psbZ基因片段在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位分别为C，T，C碱基型且rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93位碱基为A，则判定该物种为C. spicatus；若petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59位为C且psbZ基因片段在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位碱基型分别为C，C，C，则判定该物种为C.henryi；若rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第500位为C且psbZ基因片段在如SEQID NO：4所示序列第41，58，89位分别为T，C，C，则判定该物种为C. oldhamii；若psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第7和39位，petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59和72位，rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807，811位，psbZ基因片段在如SEQ ID NO：4所示序列第41，58，89位以及rps8基因片段在如SEQ ID NO：5所示序列第214位分别为G，C，C，G，A，C，T，T，C，C，T和A，则判定该物种为C. angustifolius；若psaI基因片段在如SEQ ID NO：1所示序列第7和39位，petL基因片段在如SEQ ID NO：2所示序列第59和72位，rpl2基因片段在如SEQ ID NO：3所示序列第93，500，807，811位，psbZ基因片段在如SEQID NO：4所示序列第41，58，89位以及rps8基因片段在如SEQ ID NO：5所示序列第214位分别为G，C，C，G，A，C，T，T，C，C，T，G，则判定该物种为C. fortunei。
2.根据权利要求1所述的鉴别方法，其特征在于，金粟兰属内不同物种包括宽叶金粟兰（C. henryi）、银线草（C. japonicus）、丝穗金粟兰（C. fortunei）、及己（C. serratus）、网脉金粟兰（C. nervosus）、华南金粟兰（C. sessilifolius）、中国台湾金粟兰（C. oldhamii）、狭叶金粟兰（C.angustifolius）、鱼子兰（C. erectus）和金粟兰（C. spicatus）。
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