CN115896336A - 用于扩增舒茶早ssr标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用，包括7个SSR标记，分别为Cs‑SSR1～Cs‑SSR7；用于扩增它们的引物分别如SEQ ID NO：1‑14所示。本发明提供基于网室隔离的蜂传授粉方法，不仅节约了人工成本，而且极大地提高了授粉效率和自交率，克服了茶树自花授粉基本不育的现象，为茶树新品种选育提供新的种质资源。利用新开发的高多态性且稳定的7对SSR引物对舒茶早自交子代进行鉴定，保证了自交后代的真实性。

Description

用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用

技术领域

本发明涉及植物遗传育种和分子生物学领域，具体地说，涉及用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合及其在茶树自交育种中的应用。

背景技术

茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是一种雌雄同体且高度杂合的多年生木本植物，由于其具有自交不亲和性(Self-incompatibility，SI)的现象，阻碍了茶树自交系的发展，并且导致了茶树高度杂合的基因组。在许多植物中存在着促进异交的现象，这是植物在长期进化过程中防止近亲繁殖，保持遗传多样性的重要机制。前阶段研究发现，自交亲和性与茶树品种以及雌蕊发育阶段相关，并且差异较大，创制自交系可以有目性的增加后代的纯合性，并有助于促进茶树遗传与育种研究。

茶树传统自交育种方法均采取人工授粉法，其过程需要准备花粉、人工授粉、套袋以及后期摘袋等工序，茶树的花朵在授粉过程中会形成多重损伤，例如授粉花朵脱落、雌蕊损伤等，影响结实率。此外，由于茶树自交不亲和性，导致结实率较低，人工授粉需要消耗大量的人力物力，从而导致育种成本增加。

现有的茶树种质鉴定技术主要包括形态学鉴定和分子标记鉴定。形态学标记主要为树体特性，如树型、叶型、芽叶色泽等，但是形态标记在子代鉴定上有较大的不确定性，易受人为观测及环境等因素影响。现代分子标记技术的建立与成熟，为自交子代真实性的鉴定提供了更加准确而高效的方法，但是大多分子实验会涉及一些毒性试剂并且操作过程繁琐，鉴定工作并不安全高效。因此，如何安全高效的进行自交后代的鉴定，获得更多的自交种质，进而创制茶树自交系，成为目前的主要目标。

发明内容

本发明的目的是提供一套用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合。

本发明另一的目的是提供所述引物组合在茶树自交育种中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一套用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合，包括7个SSR标记，分别为Cs-SSR1～Cs-SSR7；用于扩增它们的引物分别如SEQ ID NO：1-2、SEQ ID NO：3-4、SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8、SEQ ID NO：9-10、SEQ ID NO：11-12和SEQ ID NO：13-14所示。

第二方面，本发明提供所述SSR引物组合的以下任一应用：

1)用于舒茶早茶树品种的鉴定及选育；

2)用于舒茶早茶树品种的分子标记辅助育种；

3)用于构建舒茶早SSR指纹图谱；

4)用于制备舒茶早检测试剂；

5)用于茶树自交育种。

第三方面，本发明提供茶树自交育种的方法，所述方法包括：茶树开花前期，在茶园中搭建防虫网大棚，确保大棚内仅有舒茶早一个茶树品种；茶树开花时期，在大棚内放置授粉性蜜蜂，利用蜜蜂进行自花授粉，并利用所述SSR引物组合进行自交后代的鉴定。

具体方法包括以下步骤：

(1)田间管理：春茶过后，不再对目标茶树亲本进行修剪，茶园适当增施磷钾肥；在茶树开花前期，对茶树下部老叶烂叶进行清理，并适时修剪；

(2)搭建防虫网大棚：茶树开花前期，在茶园目标茶树品种四周搭建防虫网大棚，大棚内仅保留一个茶树品种；

(3)蜂传授粉：在大棚内，目标亲本茶树开花时期放置特定品种的蜂巢，利用蜜蜂进行自花授粉，并且每隔3天观察大棚的密封性以及蜜蜂状态并及时调整；

(4)自交后代的鉴定：利用所述SSR引物组合对子代进行PCR检测并结合毛细管电泳鉴定自交种。

进一步地，茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的行距为1.2-1.5米。株距与行距参数依照目标亲本茶树的树形适当调整，若目标亲本茶树为灌木型则株距与行距适当减小，反之增大。

优选地，防虫网大棚长10-13米，宽4-6米，高2.2-3米，孔目为60-80目，防虫网材质为尼龙纱帐。防虫网大棚的长宽高根据目标亲本茶树的树形、株距及行距以适当调整，若目标亲本茶树为灌木型则防虫网大棚长宽高适当减小有利于经济效益，若目标亲本茶树为乔木型防虫网大棚长宽高应适当增加，防止空间狭窄不利于蜜蜂飞行从而导致授粉效率下降。

进一步地，步骤(3)中蜂巢放置时间为当年10月中旬(地理位置31°25′N-31°29′N，117°09′E-117°13′E)，蜂巢中放置特定蜂种蜜蜂6000-8000头。蜜蜂数量可根据目标茶树开花数量合理调整，防止蜜蜂过多或过少对授粉不利。

优选地，大棚内配置的蜂种为中华蜜蜂。杂木树为主的森林群落及传统农业的主要传粉蜜蜂为我国独有的当家蜂种中华蜜蜂，其特殊优点在于采集力强、利用率较高、采蜜期长及适应性、抗螨抗病能力强，消耗饲料少等，非常适合中国山区定点饲养，符合我国茶树的种植现状。若替换为其它蜂种(如意大利蜂)，可能不太适应传粉，导致授粉效率下降。

进一步地，步骤(4)包括：待茶果发褐成熟时，采摘成熟茶果晾晒并除皮，后期将茶籽播种于育苗圃，待茶籽成苗时移栽至资源圃，并利用所述SSR引物组合对子代进行PCR检测并结合毛细管电泳鉴定自交种。

进一步地，步骤(4)包括如下子步骤：

1)取亲本与子代的茶树叶片并利用改良的CTAB法分别提取基因组DNA；

2)以1)提取的DNA为模板，利用7对引物进行PCR扩增；

3)利用毛细管电泳对扩增产物进行检测，根据电泳条带判定子代是否为自交种：用于扩增标记Cs-SSR1的引物对应的扩增产物出现246bp和258bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR2的引物对应的扩增产物出现256bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR3的引物对应的扩增产物出现279bp和285bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR4的引物对应的扩增产物出现267bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR5的引物对应的扩增产物出现185bp和193bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR6的引物对应的扩增产物出现184bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR7的引物对应的扩增产物出现274bp和279bp的特征条带，判定为真实自交种；

优选地，PCR反应体系为10μL：45μg/mLDNA模板1μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×Taq Plus Master Mix 5μL，ddH₂O 3μL。

优选地，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明利用防虫网将单个茶树品种进行隔离，防止其他茶树品种的异花授粉，保证其自花授粉。

(二)本发明利用在防虫网大棚内进行中华蜜蜂传粉的方法，极大改善了人工自花授粉对茶树花朵的伤害性大，并且免去了挂牌、套袋、人工授粉、摘袋等复杂工序，降低工作成本，同时提高授粉效率。

(三)本发明采用的SSR分子标记鉴定方法，具有稳定性好、准确率高的特点。进一步通过结合使用Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对于子代鉴定的结果更加精确、快速、简单、高效。

(四)茶树蜂传授粉所得的子代再利用高质量的分子标记进行鉴定，剔除可疑的子代，这样能够确保所收获的自交种准确率达到100％。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中自交授粉隔离网室结构设计示意图。

图2为本发明较佳实施例中实验基地中自交授粉隔离网室外部实景图。

图3为本发明较佳实施例中实验基地中自交授粉隔离网室内部实景图。

图4为本发明较佳实施例中随机挑选的24份子代基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。

图5为本发明较佳实施例中提供的7个高质量分子标记对亲本和子代PCR产物的Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳胶图。

具体实施方式

为获得大量茶树自交种质，从而加速育种进程，本发明以提供一种高效的茶树自交育种方法，采用尼龙纱帐防虫网大棚配以中华蜜蜂授粉为主，利用中华蜜蜂的生活特性，对茶树花粉进行多次自花授粉，解决现有技术中茶树自交方法存在结实率低、成本高、自交育种效率较低的问题，利用特异性分子标记鉴定子代为辅，鉴定自交后代的真实性。

本发明采用如下技术方案：

一种茶树高效自交育种的方法，包括以下步骤：

(1)用于自交亲本的选择：根据前期大田试验结果，选择花期较长并且结实率较高的茶树品种--舒茶早，作为自交亲本；

(2)田间管理：选择好亲本后，在春茶过后，不再对目标茶树进行修剪，增施磷钾肥(氮、磷、钾含量比为2∶1∶1较为适宜)，对于幼年茶园，生长势差的茶园可适当提高氮肥。待大棚内的茶树开花前期，对较茂密的茶树下部老叶烂叶进行清理，修剪去无效分枝以增加其通风性，适时修剪，促进树体成型，茶树现蕾期可适当梳去部分弱蕾，保留饱满健壮的花蕾；

(3)隔离网室设计与搭建：茶树开花前期，在茶园目标茶树品种四周搭建防虫网大棚，大棚内仅保留一个茶树品种；

(4)蜂传授粉：在大棚内，目标亲本茶树开花时期放置特定品种的蜂巢，利用蜜蜂进行自花授粉；每隔7天观察大棚的密封性以及蜜蜂状态并及时调整；

(5)自交后代的鉴定：次年待茶果成熟发褐时，采摘茶果除皮后晾晒，后期播种于育苗圃，待茶籽成苗时移栽至资源圃，并取其叶片利用新开发的用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合，对子代进行PCR检测并结合高通量毛细管电泳鉴定自交种。

优选地，步骤(1)中茶树亲本茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的行距1.2-1.5米。品种筛选可选择具有特殊抗性、特殊优点的优良品种。

优选地，步骤(2)中隔离网室的框架材质采用热浸镀锌钢管，拐角处结合热浸镀锌连接管，根据茶树密度以及华蜜蜂的飞行习惯，设置隔离网室设置为长度10-13米，宽度4-6米，高度2.2-3米，大棚使用尼龙纱帐防虫网全包围覆盖防虫网，并且关键部位使用抱箍、卡槽、卡簧、扎丝等固定防止脱落，防虫网底部使用泥土全面覆盖封严，以防止棚内蜜蜂钻出以及外界蜜蜂和昆虫进入，防虫网一侧设置进出口拉链供放蜂使用的进出口拉链。根据前期对茶树花粉粒径大小的研究，结合防虫网的通风透光性，将防虫网的孔目设置为60-80目。

优选地，步骤(4)中的蜂巢放置时间约为当年10月中旬，每个蜂巢放置中华蜜蜂约6000-8000头，待大棚内花期结束，即授粉完成后回收蜂巢，撤去防虫网(该网可进行重复利用)。

优选地，步骤(5)中利用CTAB法提取亲本和子代的基因组DNA，并统一稀释浓度至45ng/μL。使用新开发具有稳定性好、多态性高的SSR标记(Cs-SSR1、Cs-SSR2、Cs-SSR3、Cs-SSR4、Cs-SSR5、Cs-SSR6和Cs-SSR7)，利用扩增所述SSR标记的引物对稀释后的DNA进行PCR扩增，所述7对引物的序列分别如SEQ ID NO：1-2、SEQ ID NO：3-4、SEQ ID NO：5-6、SEQ IDNO：7-8、SEQ ID NO：9-10、SEQ ID NO：11-12和SEQ ID NO：13-14所示。

进一步地，PCR反应体系为：DNA模板1μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×Taq PlusMaster Mix 5μL，ddH₂O 3μL，离心后加入20μL石蜡油防止PCR时蒸发。其中，2×Taq PlusMaster Mix来自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2849M。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，16℃保存。

优选地，步骤(5)中通过毛细管电泳检测技术检测PCR产物，根据电泳带型判定待鉴定的子代是否为自交种。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1茶树高效自交育种的方法

本实施例提供一种茶树高效自交育种的方法(高效获得茶树自交种质的方法)，包括以下步骤：

1、自交亲本的选择：在安徽农业大学郭河茶树品种与资源圃(31°25′N，117°09′E)中选择的自交育种的亲本为5年生国家级茶树良种舒茶早(Camellia sinensisvar.sinensis‘Shuchazao’)。授粉前后保证水肥充足，不修剪茶树及进行芽叶采摘。茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的行距1.2-1.5米。

2、隔离网室设计与搭建：9月中旬，在舒茶早开花前期，在苗圃中部圈出一块宽4米、长10米的茶树，隔离网室内保留舒茶早茶树40株，清除周围1米内的其他茶树，只保留茶树品种舒茶早，再搭建防虫网大棚。大棚使用尼龙纱帐防虫网全包围覆盖防虫网，防虫网的孔目设置为80目，并且关键位置使用抱箍、卡槽、卡簧、扎丝等固定防止脱落，防虫网底部使用泥土全面覆盖封严实，防止蜜蜂钻出，网套上设置供放蜂用的进出口拉链。防虫网设置好后需仔细检查是否有破洞或底部未压实情况，保证网室的封闭性(图1～图3)。

3、田间管理：在春茶过后，不再对舒茶早茶树进行修剪，适当增施磷钾肥(一般认为氮、磷、钾含量比为2：1：1较为适宜)，对于幼年茶园，生长势差的茶园可适当提高氮肥。待防虫网搭建完成，茶树开花前期进入大棚内，对较茂密的茶树下部老叶烂叶进行清理，修剪去无效分枝以增加其通风性，适时修剪，促进树体成型，茶树现蕾期可适当梳去部分弱蕾，保留饱满健壮的花蕾。

4、蜂传授粉：10月中旬为舒茶早开花时期，此时在防虫网大棚内放置一个保留适当的蜂蜜的蜂巢，蜂巢内放置中华蜜蜂8000头，利用蜜蜂进行自花授粉，每隔15天观察大棚内蜜蜂状态，并适当添补蜜蜂。12月下旬，待舒茶早花期结束，撤去蜂巢及防虫网。

5、自交后代的鉴定：约次年10月下旬至11月初，待大棚内舒茶早植株上的茶果成熟发褐时，采摘茶果晾晒并除皮，后期将茶籽播种于育苗圃，待茶籽发芽长成幼苗时单棵移栽至资源圃进行自交后代的鉴定。具体步骤如下：

(1)基因组DNA提取：采集大棚内1株舒茶早亲本、舒茶早周围的茶树品种(福鼎大白茶、迎霜、中茶108、和鄂茶12号、菊花春、浙农117、石佛翠、浙农113、乌牛早)各1株以及125份资源圃内子代幼苗的组织，利用改良的CTAB法提取基因组DNA：

①称取0.1g茶树组织放入液氮预冷的2m1离心管中使用球磨仪进行磨样(离心管中提前加入2颗钢珠与适量PVPP)。

②离心管中加700μLCTAB提取液(提前预热至65℃)，65℃水浴15min，每隔5min上下摇匀6-8次。

③加600μL核酸提取液，12000rpm离心10min。取上清液500μL于新的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，轻晃6-8次，12000rpm离心5min，弃上清。

④加500μL的70％乙醇，将底部沉淀吹打混匀，12000rpm离心5min，弃上清。重复一次步骤④。

⑤打开离心管盖放入通风橱吹干剩余乙醇，加入100μL灭菌水混匀待用。

(2)DNA样品检测与稀释：以NanoDrop 2000(ThermoScientific)核酸测定仪对DNA的质量和浓度进行检测确认，并用0.8％琼脂糖凝胶对随机挑选的24份样品DNA进行凝胶电泳，检测其质量，电泳结果见图4。结果显示，DNA条带清晰，适用于基因分型研究。然后将DNA浓度统一稀释至35-45ng/μL。

(3)PCR扩增：使用新开发的用于扩增舒茶早SSR标记的7对引物(表1)。共10μLPCR扩增体系：Taq Mix酶5μL，ddH₂O 3μL，DNA模板1μL，上、下游引物各0.5μL。离心后加入20μL石蜡油封住防止PCR时蒸发。其中，2×Taq Plus Master Mix来自北京康为世纪生物科技有限公司，货号CW2849M。PCR扩增程序设为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，16℃保存。

表1用于扩增7个SSR标记的引物序列

(4)毛细管电泳：

①Gel：45mL dsDNA 905分离胶中加2.5μL的染料，充分混匀。

②930dsDNA缓冲溶液：将5×毛细调节溶液稀释5倍。

③毛细管清洗溶液：在一号96孔板内分别加入1mL稀释5倍的毛细管清洗溶液，避免出现气泡。

④Marker：在二号96孔板内分别加入30μL 35-500bp Markers，各孔加入20μL石蜡油封住。

⑤样品制备：在三号96孔板的前95孔中加22μL稀释缓冲液和3μL PCR产物，最后一个孔加入25μL 1-500bp DNA分子量标准品后离心，实验中试剂均来自DNF-90535-500bp试剂盒。将所有配制好的试剂放入仪器指定位置，运行程序(Fragment Analyzer 96，USA)。

(5)毛细管电泳结果分析：使用PROSize^TM 2.0软件来展示毛细管电泳结果，见图5。若子代在7个标记扩增后所获得的峰图与亲本舒茶早一致，则认定为自交种。

6、实验结果与讨论：隔离网罩内共获得种子782粒，平均每株舒茶早茶树结实19.55粒。通过对所得子代、亲本以及亲本周围的茶树品种进行毛细管电泳后的胶图和峰图进行仔细比对，分别统计出特异性等位位点，由于Fragment Analyzer^TM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此引物对样品所扩增出的条带误差在±3bp。结果显示，7对引物的多态性信息指数(PIC)都大于0.5，说明7个位点都为高度多态性位点，对子代的鉴定效果相对于中低度多态性位点更加精准(表2)。舒茶早在标记Cs-SSR1扩增后的条带为246和258bp位于舒茶早基因组Chr06；Cs-SSR2扩增后的条带为256bp位于舒茶早基因组Chr08；Cs-SSR3扩增后的条带为279和285bp位于舒茶早基因组Chr03；Cs-SSR4扩增后的条带为267bp位于舒茶早基因组Chr12；Cs-SSR5扩增后的条带为185和193bp位于舒茶早基因组Chr12；Cs-SSR6扩增后的条带为184bp位于舒茶早基因组Chr09；Cs-SSR7扩增后的条带为274和279bp位于舒茶早基因组Contig328；7对标记基本分布在舒茶早不同的染色体上使鉴定结果更加精准。在±3bp的误差允许范围内，125份子代DNA在这7个标记扩增后以至少4个标记的条带与舒茶早一致的后代认为真实自交种，并且7个标记能够区分舒茶早与周围其他茶树品种，舒茶早品种用″▲″表示；鉴定得真实自交种共有49份，用″★″表示(图5)，自交子代真实率为41.6％。剔除剩余可疑的子代后，真实的舒茶早自交后代将用于后期自交系的创制。

表2 7对引物在自交子代群体中的多样性信息

从实验结果来看，相对于人工自交授粉，已经达到了高效获得茶树自交种质的标准。为了提高自交子代的真实率，在后续的育种实践工作中，可以适当提高防虫网的目数与大棚的密封性以降低外界花粉或较小的昆虫进入隔离网罩的几率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.用于扩增舒茶早SSR标记的引物组合，其特征在于，包括7个SSR标记，分别为Cs-SSR1～Cs-SSR7；用于扩增它们的引物分别如SEQ ID NO：1-2、SEQ ID NO：3-4、SEQ ID NO：5-6、SEQ ID NO：7-8、SEQ ID NO：9-10、SEQ ID NO：11-12和SEQ ID NO：13-14所示。

2.权利要求1所述SSR引物组合的以下任一应用：

1)用于舒茶早茶树品种的鉴定及选育；

2)用于舒茶早茶树品种的分子标记辅助育种；

3)用于构建舒茶早SSR指纹图谱；

4)用于制备舒茶早检测试剂；

5)用于茶树自交育种。

3.茶树自交育种的方法，其特征在于，所述方法包括：茶树开花前期，在茶园中搭建防虫网大棚，确保大棚内仅有舒茶早一个茶树品种；茶树开花时期，在大棚内放置授粉性蜜蜂，利用蜜蜂进行自花授粉，并利用权利要求1所述SSR引物组合进行自交后代的鉴定。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)田间管理：春茶过后，不再对目标茶树亲本进行修剪，茶园适当增施磷钾肥；在茶树开花前期，对茶树下部老叶烂叶进行清理，并适时修剪；

(2)搭建防虫网大棚：茶树开花前期，在茶园目标茶树品种四周搭建防虫网大棚，大棚内仅保留一个茶树品种；

(3)蜂传授粉：在大棚内，目标亲本茶树开花时期放置特定品种的蜂巢，利用蜜蜂进行自花授粉，并且每隔3天观察大棚的密封性以及蜜蜂状态并及时调整；

(4)自交后代的鉴定：利用所述S SR引物组合对子代进行PCR检测并结合毛细管电泳鉴定自交种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，茶树同排株距为0.4-0.6米，相邻亲本的行距为1.2-1.5米。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，防虫网大棚长10-13米，宽4-6米，高2.2-3米，孔目为60-80目，材质为尼龙纱帐。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中蜂巢放置时间为当年10月中旬，蜂巢中放置特定蜂种蜜蜂6000-8000头；

蜜蜂数量根据目标茶树开花数量合理调整，防止蜜蜂过多或过少对授粉不利。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，蜂巢中配置的蜂种为中华蜜蜂。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括：待茶果发褐成熟时，采摘成熟茶果晾晒并除皮，后期将茶籽播种于育苗圃，待茶籽成苗时移栽至资源圃，并利用所述SSR引物组合对子代进行PCR检测并结合毛细管电泳鉴定自交种。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括如下子步骤：

1)取亲本与子代的茶树叶片并利用改良的CTAB法分别提取基因组DNA；

2)以1)中提取的DNA为模板，利用7对引物进行PCR扩增；

3)利用毛细管电泳对扩增产物进行检测，根据电泳条带判定子代是否为自交种：用于扩增标记Cs-SSR1的引物对应的扩增产物出现246bp和258bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR2的引物对应的扩增产物出现256bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR3的引物对应的扩增产物出现279bp和285bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR4的引物对应的扩增产物出现267bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR5的引物对应的扩增产物出现185bp和193bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR6的引物对应的扩增产物出现184bp的特征条带，用于扩增标记Cs-SSR7的引物对应的扩增产物出现274bp和279bp的特征条带，判定为真实自交种；

优选地，PCR反应体系为10μL：45μg/mLDNA模板1μL，10μM上、下游引物各0.5μL，2×TaqPlus Master Mix 5μL，ddH₂O 3μL；

优选地，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。

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