CN116114593B - 一种混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，以甜瓜商品种“海蜜五号”为母本，以野生种西印度瓜和黄瓜自交系品种“黄瓜PE50”同时作为父本，进行人工混合授粉杂交，获得种间杂交植株后代。本发明过程中获得杂交后代材料，不需要进行组织培养，且获得的材料在种间杂交应用中可简化人工去雄工序，简便方法，为进一步扩大甜瓜的种质资源库奠定良好基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术育种方法，特别是一种混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法。
背景技术
甜瓜（Cucumis melo.L.）属于葫芦科（Cucurbiteace）甜瓜属（Cucumis）作物，为一年生蔓性草本植物。随着人民物质生活水平的提高及甜瓜属育种研究工作的不断深入，人们对甜瓜育种目标提出了更高的要求，但是由于甜瓜的遗传基础相对狭窄，其抗病虫害和抗逆性较差，严重限制了甜瓜产量和品质的提高，种内资源也随着部分品种的大量推广日益枯竭。
利用甜瓜属种间关系研究，通过远缘杂交，将近缘种质资源的优良丰富变异导入到栽培甜瓜品种中创建新型甜瓜材料，是拓宽现有甜瓜遗传育种基因库的重要途径。由于物种之间存在生殖隔离，使得远缘杂交难以成功。混合授粉方法可以改变授粉过程中的生理环境，提高杂交的可孕性，从而提高选种效率，最重要的是能够克服远缘杂交不亲和性以及获取多父本遗传的效果，该技术在木本植物杂交育种中广泛应用。混合授粉法简便易行，不需要复杂的仪器。甜瓜材料杂交种种子生产主要通过人工杂交授粉获得，F1代种子纯度高低受母本自交种子的影响较大，因而我们在杂交授粉过程中要对所使用的甜瓜材料进行人工去雄，但去雄操作很容易损伤雌蕊，造成授粉不良，座果率下降，既费时又难以保证种子的纯度。
发明内容
针对上述现有技术缺陷，本发明的任务在于提供一种混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，不仅解决了现有用于杂种一代制种的完全花雄花异花同株的甜瓜材料，需人工去雄并且种子纯度难以保证的问题，更重要的是有效拓宽了甜瓜的遗传基础。
本发明技术方案如下：一种混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，以甜瓜商品种“海蜜五号”为母本，以野生种西印度瓜和黄瓜自交系品种“黄瓜PE50”同时作为父本，进行人工混合授粉杂交，获得种间杂交植株后代。
进一步地，具体包括以下步骤：
步骤1、父本花粉授粉：分别采集父本野生种西印度瓜与“黄瓜PE50”的雄花，授于母本甜瓜“海蜜五号”的柱头上，母本授粉前对花序去雄并套袋隔离；
步骤2、授粉后对果实子房分别喷施氯吡脲水溶液和噻苯隆溶液。
进一步地，所述步骤1中母本授粉前对子房去雄并套袋隔离是在母本植株开花前一天进行，并将父本雄花套袋隔离。
进一步地，所述步骤1中父本花粉授粉的授粉顺序为：先使用野生种西印度瓜的花粉授粉，然后使用黄瓜PE50的花粉进行授粉，时间间隔为10～15s。
进一步地，所述父本花粉授粉时，野生种西印度瓜的花粉与黄瓜PE50的花粉的使用量为1：2～3。
进一步地，所述父本花粉授粉按连续的2至3日每日一次进行，以提高坐果率。
进一步地，所述氯吡脲水溶液浓度为0.001～0.002%。
进一步地，所述噻苯隆溶液浓度为0.01～0.02mg/L。
本发明与现有技术相比的优点在于：
本发明中首先尝试混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异范围，是一种新奇的种间杂交授粉方式，整个过程不需要进行组织培养，方法简便，对丰富甜瓜品种的遗传基础，优化育种技术发挥重要的积极参考作用。
本发明中F1子代表现出明显的性状变化，且在自然条件下育性正常，获得的雌雄异花同株甜瓜材料，可作为遗传育种的重要研究材料，尤其是在甜瓜的种间杂交育种工作中，简化人工去雄工序，降低制种成本，提高种子纯度方面具有不可替代的作用。
杂种后代通过连续自交构建重组自交系群体，从群体中筛选遗传相对稳定、农艺性状和品质性状优良的材料用于甜瓜的种间杂交遗传育种，为进一步扩大甜瓜的种质资源库奠定良好基础。
附图说明
图1为实施例中三个杂交亲本与子代F1的子房形状照片。
图2为实施例中三个杂交亲本与子代F1的中上部叶片形态照片。
图3为实施例中杂交母本亲本与子代F1的子房柱头照片。
图4为实施例中杂交母本亲本与子代F1的成熟果实形状照片。
图5为实施例中杂交后代F2的子房性状分离照片。
图6为实施例中杂交后代F2的果实性状分离照片。
图7为三个杂交亲本与子代F1的SSR标记电泳图。
图8为三个杂交亲本与子代F2的SSR标记电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明及用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例，一种混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异范围的方法，以甜瓜商品种“海蜜五号”（以购买商品种的形式引进）为母本P，以野生种西印度瓜和优良黄瓜自交系品种“黄瓜PE50”（葫芦科作物遗传与种质创新实验室）分别作为父本P1，P2，进行人工混合授粉杂交，获得具有丰富遗传变异的种间杂交植株后代，具体步骤如下：
步骤1、在开花前一天的傍晚时分，选取生长健壮，状态良好的‘海蜜5号’甜瓜母本植株的雌花，用镊子轻轻剖开花萼及花冠，然后用镊子夹住花丝，将雄蕊全部去掉。并立即对去雄母本的花序进行套袋隔离。在开花当天上午9:00～10:00左右，花粉活力最好时使用1～2朵野生种西印度瓜的雄花和2～4朵黄瓜自交系品种“黄瓜PE50”，按照先使用野生种西印度瓜间隔10～15s后使用黄瓜自交系品种“黄瓜PE50”的顺序对甜瓜的柱头进行授粉，套袋隔离并挂牌标记，为了提高座果率，在第一次授粉之后的次日和第3日早上分别再次进行授粉，共授粉2～3次，并进行套袋隔离挂牌标记。
步骤2、授粉后，对不同实验株的雌花子房分别喷施浓度为0.001%、0.0015%、0.002%的氯吡脲水溶液，再使用浓度为0.01mg/L、0.015mg/L、0.02mg/L噻苯隆溶液连续喷施2d或3d，以促进杂种胚的启动刺激发育；果实成熟后，收集种子，最终共收到36粒饱满的杂交后代种子。
2021年春季将上一年秋季收获的杂交种子进行催芽和播种，定植在南京农业大学白马科研教学基地，在田间的塑料大棚内进行栽培管理，观察子代F1植株的形态、叶、花、果等性状特征；经过栽培和筛选，得到具有丰富变异的F1植株后代。
在花期内对子代F1植株进行人工辅助授粉，完成自交。自交后进行日常栽培管理，产生杂交后代F2的种子；收集F2的种子，继续进行培育，重复上述播种萌发，幼苗生长，田间栽培管理和观察统计。
对上述实施例得到的变异丰富的新型甜瓜杂交后代材料进行鉴定，主要包括：对获得的后代材料同时进行杂种形态学鉴定和杂种分子标记鉴定。
变异丰富的新型甜瓜材料的植物形态学鉴定方法，具体步骤如下：
将杂交父母本及后代材料于2021年3月中旬定植在南京农业大学白马科研教学基地，6月中旬开始对杂交父母本及后代材料的形态学进行观察与统计，性状统计均按照甜瓜种质资源描述规范进行。依据杂交父母本及杂交植株后代的表现型对所得的材料进行鉴定。
通过对杂交父母本及后代材料中随机选取植株进行形态学观察，调查统计中发现双亲在多个性状中具有多样性，但初步观察表明：F1子代植株类型全为雌雄异花同株，而不像甜瓜母本属于完全花雄花植株类型；其子房形状也不同于母本的椭圆形，多表现为细长的椭圆形，子房长度可达3.5cm左右；植株的幼嫩叶片形态和成熟果实形状特征也表现出明显不一样的特征变化（如图1-图4所示）；在对F2植株群体的观察中发现，其子房性型、形状和果实形状等方面产生明显的性状分离现象（如图5，图6所示），对杂交父母本及后代材料的形状统计如下表。
对杂交亲本和杂交F2的果实进行了基本的营养指标检测，发现得到了风味不一样的杂交后代。其中F2代除了未检测出的蔗糖、柠檬酸和苹果酸指标外，其蛋白质、果糖、葡萄糖指标在杂交的影响作用下含量有所降低，但是维生素C的含量有明显的提升，营养指标检测结果如下表。
变异丰富的新型甜瓜材料的分子标记鉴定方法，具体步骤如下：
取母本甜瓜“海蜜5号”、父本之一野生种西印度瓜和父本之二“黄瓜PE50”以及杂交材料F1、F2后代的植株叶片，参照Paterson等（1999）采用改良CTAB法分别提取父母本及其杂交后代材料植株的DNA；
所使用的PCR反应体积为10μL，其中正、反引物各1μL、DNA1μL、Mix 5μL、ddH2O 2μL，将上述成分混合后离心，并盖上硅胶盖，防止水分蒸发；
进行PCR扩增时，所使用的PCR扩増程序为：95℃ 5min；95℃ 15s,50℃ 15s，72℃15s, 35个循环；72℃ 延伸8min；16℃保存；反应结束后向PCR扩增产物中加入5μL的溴酚蓝燃料，混匀；其中Mix、Marker均购自Takara公司。
电泳结果分析表明:在37对SSR引物中筛选出35对多态性比较好的引物，对父母本及杂种后代进行扩增，其中如下表所列的8对引物
在F1杂种中均扩增出父母本的共显性标记，分别表现为父母本的特征带，扩增条带表现为双亲互补型（如图7所示）；杂交后代F2在引物M1-3和M8-1中存在有父母本的共显性标记，扩增条带显示有双亲的杂合等位基因（如图8所示）。
Claims (7)
1.一种混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，其特征在于，以甜瓜商品种“海蜜五号”为母本，以野生种西印度瓜和黄瓜自交系品种“黄瓜PE50”同时作为父本，进行人工混合授粉杂交，获得种间杂交植株后代，所述方法具体包括以下步骤：
步骤1、父本花粉授粉：分别采集父本野生种西印度瓜与“黄瓜PE50”的雄花，授于母本甜瓜“海蜜五号”的柱头上，母本授粉前对花序去雄并套袋隔离；
步骤2、授粉后对果实子房分别喷施氯吡脲水溶液和噻苯隆溶液。
2.根据权利要求1所述的混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，其特征在于，所述步骤1中母本授粉前对子房去雄并套袋隔离是在母本植株开花前一天进行，并将父本雄花套袋隔离。
3.根据权利要求1所述的混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，其特征在于，所述步骤1中父本花粉授粉的授粉顺序为：先使用野生种西印度瓜的花粉授粉，然后使用黄瓜PE50的花粉进行授粉，时间间隔为10～15s。
4.根据权利要求1所述的混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，其特征在于，所述父本花粉授粉时，野生种西印度瓜的花粉与黄瓜PE50的花粉的使用量为1：2～3。
5.根据权利要求1所述的混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，其特征在于，所述父本花粉授粉按连续的2至3日每日一次进行。
6.根据权利要求1所述的混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，其特征在于，所述氯吡脲水溶液浓度为0.001～0.002%。
7.根据权利要求1所述的混合授粉种间杂交拓宽甜瓜遗传变异的方法，其特征在于，所述噻苯隆溶液浓度为0.01～0.02mg/L。
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| 野生种西印度瓜与甜瓜种间杂种的创制;郑莉娜等;《南京农业大学学报》;第46卷(第3期);第464-472页 * |
| 黄瓜种质资源农艺性状多样性分析;陈林等;《广东农业科学》;20210719;第48卷(第6期);第15-22页 * |
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