CN110100723B - 一种快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法。本发明所述快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，以极早熟资源与极晚熟资源进行杂交，或者，以极早熟资源与不同遗传背景的其他极早熟资源进行杂交选育，经衍生5代即可获得基因型和农业性状稳定的快周期甘蓝型油菜资源，该油菜品种完成一轮从出苗到成熟的生命周期仅需60天，育性正常，株高较矮，可实现室内大规模快周期繁育。
Description
技术领域
本发明属于植物育种技术领域，具体涉及一种快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，并进一步公开其应用。
背景技术
大约在7500年前，甘蓝型油菜(B.napus，AACC，2n＝38)是由二倍体作物白菜(B.rapa,AA，2n＝20)和甘蓝(B.oleracea,CC，2n＝18)自然杂交并通过天然加倍而形成。甘蓝型油菜是我国广泛种植的一种重要的油料作物，其根据春化需求甘蓝型油菜划分为冬性油菜、半冬性油菜和春性油菜，其中，半冬性油菜主要分布在我国长江流域，春油菜主要分布于甘肃、青海、内蒙和西藏等西北地区。
在目前实际大田生产中，长江流域甘蓝型冬油菜和水稻、棉花等作物茬口矛盾日益突出，迫切需要早熟型油菜品种；而西北高海拔二阴山区(如门源、山丹、青海湖周边)则因无霜期特短(90天左右)，导致目前仅白菜型小油菜(高芥酸、高硫苷，产量低)能够种植，这些地区农牧民更是迫切希望用高产双低(低芥酸、低硫苷)的甘蓝型油菜替代本地小油菜。我们认为，解决这些问题的关键就是缩短甘蓝型油菜生育期，选育早熟型品种。
另外，在当前的基础研究领域，与水稻、大豆、玉米、棉花等作物功能基因组学研究相比，油菜功能基因组学的研究相对滞后。主要原因之一即是目前仍未针对油菜体系建立一套相对完整的基因组突变体库，而这其中的重要原因则是因为油菜生育期过长、单株占用面积大而导致其建库成本高。因此，目前对于油菜中克隆获得的基因，通常仍需利用拟南芥(生育期60天左右)来验证其功能和效果。为解决这一问题，也迫切需要选育生育期极短的早熟型快周期甘蓝型油菜(生育期也应为60天左右)以替代拟南芥进而实现对油菜资源进一步的深入研究。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法及其应用。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，所述选育方法包括将至少含有一种极早熟资源的品种进行杂交的步骤，随着F2发生超亲分离，可以选育出比极早熟资源更早的子代样本，并随着超亲子代继续自交4代至F5，可获得性状稳定的快周期甘蓝型油菜资源。
具体的，所述杂交步骤包括以极早熟资源与极晚熟资源进行杂交，或者，以极早熟资源与不同遗传背景的其他极早熟资源进行杂交；
所述极早熟资源亲本筛选步骤的标准为：以长江下游9月下旬田间播种，显蕾期必须在11月20日前；
所述极晚熟资源亲本筛选步骤的标准为：以长江下游9月下旬田间播种，开花期必须于次年4月1日后。
具体的，所述的快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)分别筛选出所需的极早熟资源亲本和极晚熟资源品种亲本，取所述极早熟资源品种的花粉授予所述极晚熟资源品种，进而获得F1种子；
(2)将得到的所述F1种子进行长日照自然条件繁育，经自交收获F2种子；
(3)取得到的F2种子进行点播种植，观察群体单株显蕾期和开花期，根据超亲分离现象，选择比极早熟亲本还早开花的子代，，将其带土移植入培养箱，培养至成熟，并收获F3种子；
(4)将得到的F3种子播种于营养土中，置于标准培养箱中进行培养鉴定，保留开花的F3单株，经自交获得F4种子；
(5)将所得F4种子按照所述步骤(4)中方法进行方法鉴定，收获遗传及农艺性状基本稳定的F5种子，即得所需快周期油菜品种；
或者，
(1)分别筛选出所需的极早熟资源亲本和不同遗传背景的其他极早熟资源品种亲本，取所述极早熟资源品种的花粉授予不同遗传背景的其他极早熟资源品种，进而获得F1种子；
(2)将得到的所述F1种子进行长日照自然条件繁育，经自交收获F2种子；
(3)取得到的F2种子进行点播种植，观察群体单株显蕾期和开花期，根据超亲分离现象，选择比极早熟亲本还早开花的子代，将其带土移植入培养箱，培养至成熟，并收获F3种子；
(4)将得到的F3种子播种于营养土中，置于标准培养箱中进行培养鉴定，保留开花的F3单株，经自交获得F4种子；
(5)将所得F4种子按照所述步骤(4)中方法进行方法鉴定，收获遗传及主要农艺性状基本稳定的F5种子，即得所需快周期油菜品种。
所述步骤(1)中，控制所述极早熟亲本开花后摘花不让其结籽，直到4月1日后再取其花粉。
所述步骤(2)中，控制所述夏繁过程长日照自然条件繁育。
所述步骤(2)中，还包括对收获的F2种子进行超亲F2子代判定的步骤，其技术标准为：以长江下游9月下旬田间播种，开花期必须早于11月20日前。
所述步骤(3)中，控制所述点播步骤的行距为33±2cm，株距10±2cm，行宽2±0.2m，控制行数不少于15行，且为了保证超亲子代出现，控制总苗数不少于300株。
所述步骤(3)中，所述培养箱培养条件包括：控制培育温度22℃，控制光照条件为16小时光/8小时暗，且苗期追肥2次，抽苔后追肥1次。
所述步骤(4)中，所述营养土成分包括：种植介质及底肥，所述种植介质包括体积比为214：70：100的泥炭、蛭石和珍珠岩；其中，所述种植介质选择加拿大进口“发发得”1号种植介质，其泥炭：蛭石：珍珠岩体积比为214：70：100，且所述底肥优选使用“虹越”牌“20-20-20”型园艺专用肥(1g/L)，作为底肥浸透所述种植基质。
所述步骤(4)中，所述培养鉴定步骤具体包括：取发芽纸置培养皿内，浸湿并铺上饱满的待鉴定的油菜种子，置4℃冰箱吸胀48小时后，将露白的种子点于营养土，并放入拟南芥专用培养箱进行培养，控制培养条件为：22℃、16小时光/8小时暗，苗期追肥2次，抽苔后追肥1次；按此标准方法，筛选出播种后23-24天开花、约60天时角果露黄、籽粒开始变黑的快周期油菜。
具体的，上述营养土选用加拿大进口“发发得”1号种植介质，其泥炭：蛭石：珍珠岩体积比为214：70：100，并将所述营养土用“虹越”牌“20-20-20”型园艺专用肥(1g/L)作为底肥浸透。
所述拟南芥专用培养箱选用型号为Percival Scientific公司“Percival AR-41L”型培养箱。
本发明还公开了所述的快周期高油酸甘蓝型油菜作为“桥梁”，通过杂交选育改良现有非高油酸亲本以获得高油酸亲本的方法。
本发明还公开了一种高油酸品种选育的方法，即包括按照所述方法选育得到高油酸、快周期甘蓝型油菜的步骤，以及将获得的高油酸品质导入受体亲本A的步骤，应用此步骤，12个月左右即可获得新的高油酸亲本A’，而传统的大田回交方法则最少需要4个农业季节。具体包括如下步骤：
(a)按照所述方法选育得到高油酸、快周期甘蓝型油菜资源亲本；
(b)将得到的高油酸、快周期甘蓝型油菜资源亲本与亲本A进行杂交，得到种子F1；
(c)将得到的种子F1与亲本A种于培养箱中，于22℃、16小时光/8小时暗进行培养，得到BC1；
(d)将得到的BC1继续于培养箱中进行培养，并将早花株自交并回交，得到BC1F2和BC2；
(e)取BC1F2种子与亲本A进行杂交，得到BC3种子；
(f)将得到的BC3F2种于大田，保留高油酸晚花单株，即得表型与亲本相似的高油酸亲本A’。
本发明所述快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，以极早熟资源与极晚熟资源进行杂交，或者，以极早熟资源与不同遗传背景的其他极早熟资源进行杂交选育，经衍生F5代即可获得基因型和主要农艺性状稳定的快周期甘蓝型油菜资源品种，该油菜品种完成一个从出苗到成熟的生命周期仅需60天左右，可实现快周期繁育。
本发明筛选所得快周期甘蓝型油菜资源品种可替代拟南芥作为模式作物用于油菜基础研究，包括但不限于遗传图谱构建、生物/非生物逆境胁迫研究、肥效试验、组学研究及作为转基因和基因编辑等功能基因组学研究的受体，具有广泛的用途。
本发明筛选所得快周期甘蓝型油菜资源品种还可以作为育种的“桥梁”种，由于选育过程中，极早熟与极晚熟(或极早熟)杂交F1在长日照下，极早熟为显性表型，因此可实现快速将高油酸品质导入受体亲本中，实现新的育种。
本发明筛选所得快周期甘蓝型油菜资源，可在高海拔二阴山区替代地方白菜型小油菜；由于一般甘蓝型春播油菜最适海拔为1900-2600m，目前已知的能适应2600m-3000m海拔区间的品种仅为青杂7号和青杂4号，超过3000m的二阴山区因无霜期太短有不能及时收获的风险。以门源县城以北和山丹军马场二分场场部为例，该区为海拔3000m以上的二阴山区，2018年试验表明，本发明选育的快周期油菜和对照白菜型小油菜浩油11在8月25日霜前成熟，但青杂7号和青杂4号籽粒未能成熟。另外，经本发明方法筛选所得快周期甘蓝型油菜资源也可用于教学及科研，例如中小学生科学实践课观察植物生命周期、科研单位用于遗传图谱构建的亲本、诱变、肥效实验、遗传转化或基因编辑，还可实现太空飞行器内种植、或其它星球种植，可以为航天员提供氧气，并作为蔬菜及食用油来源。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为本发明实施例3所述高油酸品种选育方法的流程图；
图2中(a)为本发明所述快周期油菜花期育性，所述快周期油菜于3月7日种于培养箱，4月8日已经盛花，图示其花器正常；
图2中(b)为本发明所述快周期油菜的结荚期株高，所述快周期油菜进入结荚期，图示其成株期株高仅约50cm。
具体实施方式
本发明下述各实施例中，所涉“快周期”油菜指完成一个生命周期很短的一种甘蓝型油菜(Brassica napus)，该周期从出苗到成熟约60天。
实施例1
油酸是菜籽油脂肪酸的主要成份之一，具有降“三高”(高血脂、高血糖、高血压)及预防肿瘤功能，因此，高油酸(油酸含量>75％)育种是近年油菜品质育种的重要目标之一。本实施例以高油酸快周期油菜乐油17的选育过程为例，从快周期油菜与高油酸油菜乐油16(生育期233.5天，油酸含量76％)杂交子代中选育适合西北二阴山区的高油酸甘蓝型油菜，具体包括如下步骤：
(1)将乐油16于2016年9月28日播种于合肥试验田，2017年2月20日将快周期油菜播种于培养箱(培养条件同上)，3月20日乐油16和HF-1均进入花期，取乐油16花粉与快周期油菜杂交。同时，将乐油16移入培养箱，摘掉所有花，令其始终保持开花状态但不能结籽；
(2)将收获的F1种子播种于培养箱(培养条件同上)，由于长日照条件下早花为显性，因此F1约27天左右即可开花。此时允许乐油16少量开花，取粉与F1大量回交，收获BC1种子；
(3)将BC1种子全部种于培养箱(培养条件同上)，其表型将分离出晚花(纯合)和早花(杂合)两种基因型，拔去晚花表型单株，保留27天左右开花子代。再次允许乐油16少量开花，取乐油16花粉继续与最早的BC1单株杂交，获得BC2种子；
(4)将BC2种子全部种于培养箱(培养条件同上)，其表型将继续分离出晚花(纯合)和早花(杂合)两种基因型，拔去晚花表型单株，保留27天左右开花子代。再次允许乐油16少量开花，取乐油16花粉继续与最早的BC2单株杂交，获得BC3种子；
(5)将BC3种子全部种于培养箱(培养条件同上)，其表型将继续分离出晚花(纯合)和早花(杂合)两种基因型，拔去晚花表型单株，保留27天左右开花的所有子代，自交，获得BC3F2种子；
(6)BC3F2种子经气相色谱测定，确认为高油酸基因型(fad2fad2,油酸含量76％)后，按系种植于培养箱(培养条件同上)，系内不再分离出晚花表型的即为纯合型，选取其中最健壮的一株自交，获得BC3F3种子。
(7)2018年5月将BC3F3种子送山丹军马场二分场鉴定(海拔3000米)，对照为白菜型小油菜浩油11。8月25日对照与BC3F3均能于霜降前收获，试验取得成功，将高油酸BC3F3扩繁，定名为“乐油17”。乐油17可替代二阴山区白菜型油菜，同时也是经新一轮改良的第二代(油酸含量高达76％)快周期油菜。
实施例2
通常油菜转基因试验从下胚轴转化获得试管苗(T 1代)至T2代完成表型鉴定，需要最少两个农业季节(即2年时间)，而采用快周期油菜作为遗传转化的受体，则只需120天左右。本实施例以快周期油菜转GUS报告基因为例，将其作为遗传转化的模式作物，具体包括如下步骤：
(1)外植体的准备：在超净工作台上将快周期油菜种子用吐温20表面消毒十分钟，无菌水洗三次，接种于无任何激素的MS培养基上，置4℃冰箱均一化约48小时；种子露白后，取出培养瓶，置22℃、16小时光/8小时暗的培养箱中培养8～10天，将下胚轴切成长0.5～1.0cm左右，作为感染的初始材料；
(2)农杆菌侵染及抗性苗的筛选：用牙签挑取转入GUS基因植物表达载体的新鲜农杆菌菌落在含Km(卡那霉素)50mg/L及Hgr(潮霉素)50mg/L的YEB液体培养基中28℃振荡培养，至对数分裂中期(OD600＝0.3)。取菌液于12000rpm离心1min，用MS液体培养基离心洗涤一次后稀释10倍，将下胚轴浸入上述菌液放置1min，吸干后平铺于MS固体培养基上暗培养2天，待切口处被农杆菌感染后，在MS液中洗净后培养在含Cb(羧苄霉素)500mg/L的MS固体培养基上。感染后的下胚轴一周后转入含Cb500mg/L及Hgr 10mg/L的MS固体分化培养基(MS+1mg/L BA+0.2mg/LNAA+0.2mg/L GA3+5mg/L AgNO3)上，每2周重复1次，直到抗性愈伤出现乃至芽分化，计算转化频率。切下茎芽转入含Cb 500mg/L及Hgr 10mg/L但激素含量稍低(AgNO3降为0.5mg/L)的MS培养基中继代，每块愈伤可长3～5个芽，待芽长1cm高时，转入含Cb 500mg/L及Hgr 10mg/L的生根培养基(MS+0.2mg/L IAA)诱导生根，2周后长成完整小植株，即可移入土中；
(3)抗性植株的PCR鉴定：对获得的抗性植株幼苗剪取一小片叶片，采用CTAB法提取总DNA，根据载体中GUS基因的序列设计特异引物(GUS-F:GCTATACGCCTTTGAAGCC；GUS-R:TTGACTGCCTCTTCGCTGTA)对所获得的抗性植株叶片DNA进行PCR扩增，扩增出目标条带的对应植株可初步判断为阳性植株，记为T1代，并对获得的阳性单株依次编号；
(4)阳性植株的GUS染色鉴定：取经过PCR鉴定的阳性植株叶片进行GUS染色。叶片能被GUS染色的单株确定为阳性植株，自交留种；
(5)选择染色效果较好的5-6个单株(如T1-1，T1-2，T1-3，T1-4，T1-5，T1-6)各30粒左右种子经表面灭菌后点到含有50mg/L Km的MS培养基，根据幼苗发芽和生根情况判断其抗性，统计抗性苗和非抗性苗的比例，其中分离比例接近3:1的株系即视为单位点插入，选择分离比符合预期的3个不同T1代单株各5株抗性苗进行移栽，自交留种，记为T2-1-1至T2-1-5。下一代继续用上述方法鉴定分离情况，后代没有发生抗性分离的单株即为纯合稳定单株。
实施例3
如图1所示的流程图，本实施例中，以实施例1中选育所得乐油17品种作为育种的“桥梁”种，利用高油酸(基因型为fad2fad2)快周期品种乐油17为例，由于极早熟与极晚熟(或极早熟)杂交F1在长日照下，极早熟为显性表型，因此方便育种人员快速将高油酸品质导入受体亲本A，具体操作步骤包括：
(1)按照上述实施例1中方法选育得到高油酸、快周期甘蓝型油菜资源亲本乐油17(高油酸，fad2fad2)；
(2)将得到的高油酸、快周期甘蓝型油菜资源亲本乐油17(油酸含量高达76％，fad2fad2)与双低亲本亲本A(油酸含量60％Fad2Fad2，开花后去幼果使其保持开花状态，下同)进行杂交，得到种子F1，F1种子(基因型为Fad2fad2采用气相色谱法测定油酸含量为68％，为中亲值；
(3)将得到的种子F1(Fad2fad2)与亲本A种于培养箱中，于22℃、16小时光/8小时暗进行培养，花期取亲本A花粉与F1回交得到BC1；
(4)将得到的BC1种子继续于培养箱中进行培养，群体含Fad2Fad2和Fad2fad2两种基因型，保留早花株自交并回交，得到BC1F2和BC2；气相色谱法分析BC1F2种子油酸含量，只保留Fad2fad2单株对应杂交收获的BC2种子，其油酸含量约为68％；
(5)取BC1F2种子与亲本A进行回交，得到BC3种子；
(6)继续将BC3种子种植于培养箱，保留早花株并自交，得到BC3F2种子，气相色谱法分析各单株油酸含量，只保留油酸含量约为68％的杂合型单株；如图2中(a)所示结果，所述快周期油菜于3月7日种于培养箱，4月8日已经盛花，图示其花器正常；如图2中(b)所示，为本发明所述快周期油菜进入结荚期，图示其成株期株高仅约50cm；
(7)将得到的BC3F2种子于播种季正常播种于大田，保留晚花单株，自交得到BC3F3种子，气相色谱法分析各单株油酸含量，保留76％油酸含量的单株，其基因型为fad2fad2，即得农艺性状与原受体亲本A相似的新高油酸选系A’。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，如转入其它基因，或者采用基因编辑技术对目标基因进行功能验证，或者如利用快周期油菜作为雄性不育、抗根肿病、抗除草剂等性状的“桥梁”，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (6)
1.一种快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，其特征在于，所述选育方法包括将至少含有一种极早熟资源的品种进行杂交的步骤，随着F2发生超亲分离，选育出比极早熟资源更早的子代样本，并随着超亲子代继续自交4代至F5，获得性状稳定的快周期甘蓝型油菜资源；
所述杂交步骤包括以极早熟资源与极晚熟资源进行杂交，或者，以极早熟资源与不同遗传背景的其他极早熟资源进行杂交；
所述极早熟资源亲本筛选步骤的标准为：以长江下游9月下旬田间播种，显蕾期必须在11月20日前；
所述极晚熟资源亲本筛选步骤的标准为：以长江下游9月下旬田间播种，开花期必须于次年4月1日后；
包括如下步骤：
（1）分别筛选出所需的极早熟资源亲本和极晚熟资源品种亲本，取所述极早熟资源品种的花粉授予所述极晚熟资源品种，进而获得F1种子；
（2）将得到的所述F1种子进行长日照自然条件繁育，自交收获F2种子；
（3）取得到的F2种子进行点播种植，观察群体单株显蕾期和开花期，根据超亲分离现象，选择比极早熟亲本还早开花的子代，将其带土移植入培养箱，培养至成熟，并收获F3种子；
（4）将得到的F3种子播种于营养土中，置于标准培养箱中进行培养鉴定，保留开花的F3单株，经自交获得F4种子；
（5）将所得F4种子按照所述步骤（4）中方法进行方法鉴定，收获遗传及主要农艺性状基本稳定的F5种子，即得所需快周期油菜品种；
或者，
（1）分别筛选出所需的极早熟资源亲本和不同遗传背景的其他极早熟资源品种亲本，取所述极早熟资源品种的花粉授予不同遗传背景的其他极早熟资源品种，进而获得F1种子；
（2）将得到的所述F1种子进行长日照自然条件繁育，自交收获F2种子；
（3）取得到的F2种子进行点播种植，观察群体单株显蕾期和开花期，根据超亲分离现象，选择比极早熟亲本还早开花的子代，将其带土移植入培养箱，培养至成熟，并收获F3种子；
（4）将得到的F3种子播种于营养土中，置于标准培养箱中进行培养鉴定，保留开花的F3单株，经自交获得F4种子；
（5）将所得F4种子按照所述步骤（4）中方法进行方法鉴定，收获遗传及主要农艺性状基本稳定的F5种子，即得所需快周期油菜品种；
所述步骤（3）中，所述培养箱培养条件包括：控制培育温度22℃，控制光照条件为16小时光/8小时暗；
所述步骤（4）中，所述培养鉴定步骤具体包括：取发芽纸置培养皿内，浸湿并铺上饱满的待鉴定的油菜种子，置4℃冰箱吸胀48小时后，将露白的种子点于营养土，并放入拟南芥专用培养箱进行培养，控制培养条件为：22℃、16小时光/8小时暗，苗期追肥2次，抽苔后追肥1次；按此标准方法，筛选出播种后23-24天开花、60天时角果露黄、籽粒开始变黑的快周期油菜。
2.根据权利要求1所述的快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，其特征在于，所述步骤（1）中，控制所述极早熟亲本开花后摘花不让其结籽，直到4月1日后再取其花粉。
3.根据权利要求1或2所述的快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，其特征在于，所述步骤（3）中，控制所述点播步骤的行距为33±2cm，株距10±2cm，行宽2±0.2m，控制行数不少于15行，且总苗数不少于300株。
4.根据权利要求2-3任一项所述的快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述培养箱培养条件包括：控制培育温度22℃，控制光照条件为16小时光/8小时暗，且苗期追肥2次，抽苔后追肥1次。
5.根据权利要求2-3任一项所述的快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述营养土成分包括种植介质及底肥，所述种植介质包括体积比为214：70：100的泥炭、蛭石和珍珠岩。
6.权利要求1-5任一项所述的快周期甘蓝型油菜的杂交选育方法在高油酸品种选育领域中的应用；
其中，所述高油酸品种选育的方法，包括按照权利要求1-5任一项所述方法选育得到高油酸、快周期甘蓝型油菜的步骤，以及将获得的高油酸品质导入受体亲本A的步骤，具体包括如下步骤：
（a）按照权利要求1-5任一项所述方法选育得到高油酸、快周期甘蓝型油菜资源亲本；
（b）将得到的高油酸、快周期甘蓝型油菜资源亲本与亲本A进行杂交，得到种子F1；
（c）将得到的种子F1与亲本A种于培养箱中，于22℃、16小时光/8小时暗进行培养，得到BC1；
（d）将得到的BC1继续于培养箱中进行培养，并将早花株自交并回交，得到BC1F2和BC2；
（e）取BC1F2种子与亲本A进行杂交，得到BC3种子；
（f）将得到的BC3继续于培养箱中培养，并将早花株自交，得到的BC3F2；
（g)BC3F2种于大田，保留高油酸晚花单株，即得表型与受体亲本总体农艺性状相似的高油酸新选系A’；
所述培养箱培养条件包括：控制培育温度22℃，控制光照条件为16小时光/8小时暗。
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