CN102864168B - 一种改进的植物花粉管转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改进的植物花粉管转化方法，分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和Tween20作为外源质粒DNA保护剂，利用植物花粉管通道法转化外源基因，受体烟草和大豆GUS活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为11.1%和3.78%；以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8.89%和2.91%；以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10.0%和1.41%；以1×SSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7.78%和1.97%，解决了植物花粉管通道法转化率低的问题，提高了转化率。

Description

一种改进的植物花粉管转化方法

技术领域

本发明涉及生物技术遗传育种领域，具体涉及一种改进的植物花粉管转化方法。

背景技术

1981年，我国的科学家周光宇首次应用花粉管通道法将外源DNA导入陆地棉中，成功培育出抗枯萎病的转基因品种。近年来，花粉管通道法因其独特的优势，被科学家们广泛的利用，进行植株的转基因操作。该方法有以下几个优点：首先，花粉管通道法适用范围较广，可以应用到任何开花的植物中，并且可以在不同物种之间进行不同的基因转移，因此其放宽了目的基因和受体植株的范围。第二，其不依靠繁琐的植物组织培养和诱导植物再生的漫长过程，花粉管通道法利用的是自然的生殖过程，可直接获得转化过的转基因种子，简捷、快速。第三，该方法应用于植株转化时，大大加快了转化速度。对于大多数植株而言，从其开花到转基因种子的收获平均在3-4个月的时间。即在当年即可收获转基因种子，并进行检测。第四，操作简捷，技术易掌握，同时不需要昂贵的设备，因此可以应用于大面积植株的遗传转化。但是该方法在具体的实际应用中，还有一定的缺陷，即该方法转化效率不高，在转化过程中，外源质粒DNA易降解。

DNA保护剂主要是一类可以保护抗原的物质，特别是DNA、RNA不受体内酶的分解。DNA保护剂包括：氢氧化铝明胶、磷酸钙和乳油保护剂。而在医学中，铝盐佐剂是被允许应用于人类的佐剂。利用这类铝盐胶体，抗原会跟一个不溶的凝胶沉淀剂结合，或者经过相互的电作用形成凝胶粒子。该保护剂的作用原理是因其是一个暂时的储存库，缓释是其非常重要的一个功能。它可以将抗原包裹住，可以避免抗原分子被降解，同时可以避免受体内的清除作用而丧失。乳油保护剂一般是用矿物油、稳定剂及乳化剂（如Tween20、Tween80及Span80）按照一定的比例进行混合，然后与抗原混合制成。这类保护剂是一种油包水的乳剂，它可以作为一个保存库，避免抗原被水相中的机体水解，进而到达抗原被保护的目的。而传统的花粉管通道法，大多用1×SSC溶液作为回溶剂，回溶目的基因或质粒。

发明内容

本发明的目的是为解决花粉管通道法在转化过程中，外源质粒DNA易降解，转化效率不高的问题，而提供一种改进的植物花粉管转化方法。

一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0.8-1.2 μg/μL，然后利用植物花粉管通道法转化到植物中；

所述的外源质粒DNA保护剂，它是氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和Tween20保护剂中的一种；

所述的外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL。

所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）在一支玻璃试管中加入2-4mL 1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；

（2）弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；

（3）将沉淀转入150 mL烧杯中，加入蒸馏水20-80 mL，搅拌并加热煮沸。期间加入0.1-0.2 mL 0.1 mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶；

（4）氢氧化铝溶胶重悬外源质粒DNA。

所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）用灭菌蒸馏水5-15 μL重悬外源质粒DNA，使其浓度为1 μg/μL，再加入50-60 μL 2 mol/L CaCl2溶液混匀；

（2）离心，将上清液取出，加入到400-450 μL灭菌蒸馏水中；得外源质粒DNA-CaCl2溶液；

（3）取一个2 mL灭菌的离心管，向其中加入500 μL， pH6.95-7.05 ，2×HEPES缓冲液，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入外源质粒DNA-CaCl2溶液；

（4）将试管放于37℃水浴中孵育3-5 min，可见乳白色混浊出现；

（5）10000 r/min离心3 min，弃上清；所得的混合物即为磷酸钙-外源质粒DNA。

所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115℃灭菌15-20 min；

（2）取上述蔗糖溶液与Tween20混合，制成浓度为5%的Tween20保护剂；

（3）取5%的Tween20保护剂10-20 μL外源质粒DNA。

本发明提供了一种改进的植物花粉管转化方法，分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和Tween20作为外源质粒DNA保护剂，利用植物花粉管通道法转化外源基因，受体烟草和大豆GUS活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为11.1%和3.76%；以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8.89%和2.91%；以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10.0%和1.41%；以1×SSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7.78%和1.97%，提高了转化率。

附图说明

图1转基因烟草抗性植株；

图2转基因大豆抗性植株；

图3烟草抗性株PCR产物检测结果；

图4大豆抗性株PCR产物检测结果；

图5转基因烟草根部、叶片和种子GUS活性组织的化学染色结果，其中，5-A为根部；5-B为叶片；5-C为种子；

图6转基因大豆种子和叶片GUS活性组织的化学染色结果，其中，6-A为种子；6-B为叶片。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

具体实施方式：

实施例1 植物表达载体pCAMBIA1301质粒DNA的提取

按照质粒DNA常规提取方法-碱裂解法，从含有植物表达载体pCAMBIA1301的大肠杆菌中提取质粒DNA。

实施例2 氢氧化铝溶胶保护剂的制备

（1）在一支玻璃试管中加入2-4mL 1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；

（2）弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；

（3）将沉淀转入150 mL烧杯中，加入蒸馏水20-80 mL，搅拌并加热煮沸。期间加入0.1-0.2 mL 0.1 mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶； 

（4）取少许氢氧化铝溶胶重悬实施例1中所提取的pCAMBIA1301的质粒DNA沉淀，获得的混合物即为氢氧化铝溶胶- pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的质粒DNA的浓度为0.8-1.2 μg/μL。

实施例3 磷酸钙保护剂的制备

（1）用灭菌蒸馏水5-15 μL重悬实施例1所提取的pCAMBI1301的质粒DNA沉淀，使其浓度为1 μg/μL，再加入50-60 μL 2 mol/L CaCl2溶液混匀，此时会有少量混浊物质出现。

（2）12000 r/min离心10 min，将上清液取出，加入到400-450 μL灭菌蒸馏水中，此即称为pCAMBIA1301-CaCl2溶液。

（3）取一个2 mL灭菌的离心管，向其中加入500 μL 2×HEPES缓冲液(pH6.95-7.05)，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入pCAMBIA1301-CaCl2溶液。

（4）将试管放于37℃水浴中孵育3-5 min，可见乳白色混浊出现。

（5）10000 r/min离心3 min，弃上清。所得的混合物即为磷酸钙-pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的质粒DNA的浓度为0.8-1.2 μg/μL。

实施例4 Tween20保护剂的制备

（1）采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115℃灭菌15-20 min。

（2）取上述蔗糖溶液与Tween20混合，制成浓度为5%的Tween20保护剂。

（3）取5%的Tween20保护剂10-20 μL重悬实施例1所提取的pCAMBIA1301的质粒DNA沉淀，使其浓度为0.8-1.2 μg/μL。

实施例5 三种不同DNA保护剂处理的质粒DNA pCAMBIA1301花粉管通道转化方法

分别采用大豆和烟草作为受试材料。

（1）大豆花粉管通道转化法 

①大豆材料种植

将事先准备好的大豆种子在试验田内播种长至盛花期。

②选择大豆自花授粉6 h后进行质粒DNA导入，标志是花冠完全开放后的花。

③使用镊子把一个节点部位的其他花朵去掉，剩余1-2朵完全开放的花。

④用镊子将剩余花朵的萼片和翼瓣出去，用小剪刀把突出的柱头剪去部分。

⑤使用微量注射器将5-10 μL实施例2、3、4制备的质粒DNA溶液滴加到切口处。同时用1×SSC缓冲液重悬的质粒DNA做对照进行同样处理。

⑥挂好记录有质粒DNA样品、导入时间及受体植株品种的标牌。

⑦待20-30 min后，重新滴加一次。

⑧大豆在进行外源基因导入3-7 d后，定期去杂，保证转化的花朵可以结实。每种不同保护剂混合的质粒DNA分别导入大豆100棵。

（2）烟草花粉管通道转化法

①烟草材料种植

由于烟草种子过小，先在MS培养基培育无菌苗，25 d后，待无菌苗根系发育良好，先炼苗5-7 d，然后移栽至小花盆中。待其长至25 cm左右，移栽至温室中。在其盛花期进行目的基因的导入。

②在烟草授粉后10 h，用剪刀在子房上部1 cm处剪去花柱。

③使用微量注射器将5-10 μL实施例2、3、4制备的质粒DNA溶液滴加到切口处。同时用1×SSC缓冲液重悬的质粒DNA做对照进行同样处理。

④挂好记录有质粒DNA样品、导入时间及受体植株品种的标牌，每种DNA保护剂分别转化烟草90棵。

实施例6 转基因植株的检测

（1）转基因植株抗性筛选

将收获的烟草和大豆种子分别放入含有潮霉素浓度为10 mg/L的MS筛选培养基中进行抗性筛选，如图1、2所示。

（2）抗性植株的PCR检测

①根据植物基因DNA的常规提取方法-CTAB法分别提取抗性植株和未转化植株的基因组DNA。

②植物表达载体pCAMBIA1301上含有gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），长度2000 bp，选取其中长度为1007 bp的部分序列设计特异性引物，以提取植株基因组DNA为模板，扩增gus基因，其中抗性植株为实验组，未转化植株为阴性对照组，并以pCAMBIA1301的质粒DNA作为阳性对照组。

③PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，如图3、4所示，随机检测的5株烟草和大豆抗性植株均扩增出了1007 bp的特异性条带，且同阳性对照组的位置相同，而阴性对照组未见1007 bp的特异性条带。结果表明，在转基因阳性植株中含有gus基因，其来源为花粉管通道转化法导入的。

（3）GUS活性组织的化学染色试验

对PCR检出阳性的烟草植株的叶片、根部和大豆植株的种子和叶片进行常规GUS活性组织化学染色。如图5所示，转基因烟草的叶片（5-A）、根部（5-B）种子（5-C）均检测出GUS活性，而未进行转化的烟草各个部位皆未能染色，说明其不具有GUS活性。如图6所示，转基因大豆的种子（6-A）、叶片（6-B）均检测出GUS活性，而未进行转化的烟草各个部位皆未能染色，说明其不具有GUS活性。结果表明，gus基因在烟草和大豆植株内均获得表达，外源DNA成功转入受体植株中。

对实施例2、3、4制备的DNA保护剂转化的受体烟草和大豆GUS活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为11.1%和3.76%；以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8.89%和2.91%；以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10.0%和1.41%；以1×SSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7.78%和1.97%，见表1、2。

表1三种DNA保护剂使质粒DNA转入烟草的转化率

不同佐剂	收获种子数量	检测出阳性植株	转化率（gus阳性率）
				氢氧化铝凝胶佐剂	175	7	3.76%
磷酸钙-DNA共沉物	103	3	2.91%
				Tween20佐剂	142	2	1.40%
1×SSC溶液	152	3	1.97%

表2  三种DNA保护剂使质粒DNA转入大豆的转化率

不同佐剂	收获朵数	成活率	检测出含阳性植株朵数	转化率（gus阳性率）
					氢氧化铝凝胶佐剂	32	35.6%	10	11.1%
磷酸钙-DNA共沉物	39	43.3%	8	8.89%
					Tween20佐剂	33	36.7%	9	10.0%
1×SSC溶液	34	37.8%	7	7.78%

Claims (3)

1.一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0.8-1.2 μg/μL，然后利用植物花粉管通道法转化到植物中；所述的外源质粒DNA保护剂为氢氧化铝溶胶。

2.根据权利要求1所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：所述的外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL。

3.根据权利要求1或2所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：所述的氢氧化铝溶胶是由下述的方法制备的：

（1）在一支玻璃试管中加入2-4mL 1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；

（2）弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；

（3）将沉淀转入150 mL烧杯中，加入蒸馏水20-80 mL，搅拌并加热煮沸；

期间加入0.1-0.2 mL 0.1 mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶。

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