CN107653328A - 美地绵粉蚧的特异性ss‑coi检测引物及检测方法和试剂盒 - Google Patents
美地绵粉蚧的特异性ss‑coi检测引物及检测方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体的，本发明涉及美地绵粉蚧的特异性SS‑COI检测引物及检测方法和试剂盒。该对引物只对美地绵粉蚧具有扩增能力。提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在美地绵粉蚧检测监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸，水果、蔬菜、木薯和棉花生产基地，鲜切花和苗木生产基地，以及水果、蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体的，本发明涉及美地绵粉蚧的特异性SS-COI检测引物及检测方法和试剂盒。
背景技术
美地绵粉蚧(Madeira mealybug)Phenacoccus madeirensis Green属半翅目、粉蚧科、绵粉蚧属，是近年入侵我国大陆的一种重要入侵粉蚧，寄主范围十分广泛，带来严重经济损失。因此，加强对美地绵粉蚧的检测监测，是保障我国水果、蔬菜、棉花、木薯和花卉等产业健康发展的必要前提。
加强检验检疫和监测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于美地绵粉蚧鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定；2)DNA序列测定法等。但目前国内尚没有针对美地绵粉蚧标准的检测方法。
SS-COI PCR技术检测是在mtDNA COI技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有高灵敏度、特异性强、快速、简便且重现性好和稳定性强等优点。
发明内容
本发明的目的为提供美地绵粉蚧特异性SS-COI检测引物。
本发明的再一目的为提供美地绵粉蚧特异性基因片段。
本发明的另一目的为提供美地绵粉蚧的特异性快速PCR检测方法。
本发明的再一目的为提供美地绵粉蚧的特异性快速PCR检测试剂盒。
本发明根据美地绵粉蚧的线粒体DNA序列，设计筛选出了一对特异性引物，该对引物只对美地绵粉蚧具有扩增能力。是对美地绵粉蚧形态学检测鉴定和mtDNACOI技术检测方法的补充和改进。同时，该方法采用SS-COI技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在美地绵粉蚧检测监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸，水果、蔬菜、木薯和棉花生产基地，鲜切花和苗木生产基地，以及水果、蔬菜、观赏植物、果树种苗/植株调运中推广。
根据本发明的美地绵粉蚧特异性SS-COI引物为：
引物PMZWF1：5’-TTGATTGCTAATACCCTCCC-3’；和
引物PMZWR1：5’-GGTAATTGCTCTAGATAATAC-3’。
根据本发明的美地绵粉蚧特异性基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
根据本发明的美地绵粉蚧特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR扩增的步骤。
根据本发明的美地绵粉蚧特异性检测试剂盒包括上述美地绵粉蚧特异性SS-COI引物。
本发明的美地绵粉蚧种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测美地绵粉蚧。与国际现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
(1)检测准确性高，利用本发明的美地绵粉蚧种特异性SS-COI引物PMZWF1和PMZWR1，在PCR快速检测美地绵粉蚧时，可扩增出307bp的片段，不仅对美地绵粉蚧单头成虫、2龄和3龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准确检测。
(2)操作简便快捷，本发明采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效,一般整个过程可在4小时内完成。
(3)特异性强，本发明设计的引物可特异性检测美地绵粉蚧，在其近缘种、属粉蚧中无扩增产物。
因此本发明的美地绵粉蚧种特异性SS-COI引物实用性强，可满足植物检疫及害虫检测和监测的需要。
附图说明
图1显示美地绵粉蚧的特异性候选引物的反应条件优化，其中，M：分子量标准Trans2KTM；A：PMZWF1/PMZWR1；B：PMZWF1/PMZWR2；C：PMZWF2/PMZWR1；D：PMZWF2/PMZWR2；1-8：退火温度，1：50℃；2：49.6℃；3：49℃；4：48.1℃；5：47℃；6：45.9℃；7：45.3℃；8：45℃。
图2显示美地绵粉蚧特异性引物的筛选，其中，A：PMZWF1/PMZWR1；B：PMZWF1/PMZWR2；C：PMZWF2/PMZWR1；D：PMZWF2/PMZWR2；M：分子量标准Trans2KTM；1：美地绵粉蚧Phenacoccus madeirensis；2：木薯绵粉蚧Phenacoccus manihoti；3：石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani；4：扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis；5：新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes；6：双条拂粉蚧Ferrisia virgata；7：木槿曼粉蚧Maconellicoccus hirsutus；8：木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus；9：大洋臀纹粉蚧Planococcus minor；10：康氏粉蚧Pseudococcus comstocki；11：阴性对照(超纯水)。
图3显示特异性引物PMZWF1/PMZWR1对美地绵粉蚧及其近缘种、属粉蚧的SS-COIPCR扩增结果，其中，M：分子量标准Trans2KTM；1：美地绵粉蚧Phenacoccus madeirensis；2：木薯绵粉蚧Phenacoccus manihoti；3：石蒜绵粉蚧Phenacoccus solani；4：扶桑绵粉蚧Phenacoccus solenopsis；5：菠萝粉蚧Dysmicoccus brevipes；6：新菠萝灰粉蚧Dysmicoccus neobrevipes；7：Ferrisia gilli；8：双条拂粉蚧Ferrisia virgata；9：木槿曼粉蚧Maconellicoccus hirsutus；10：橘鳞粉蚧Nipaecoccus viridis；11：木瓜秀粉蚧Paracoccus marginatus；12：柑橘臀纹粉蚧Planococcus citri；13：日本臀纹粉蚧Planococcus kraunhiae；14：南洋臀纹粉蚧Planococcus lilacinus；15：大洋臀纹粉蚧Planococcus minor；16：榕树粉蚧Pseudococcus baliteus；17：康氏粉蚧Pseudococcuscomstocki；18：桔小粉蚧Pseudococcus cryptus；19：杰克贝尔氏粉蚧Pseudococcusjackbeardsleyi；20：Pseudococcus sp.；21：暗色粉蚧Pseudococcus viburni；22：蔗茎红粉蚧Saccharicoccus sacchari；23：阴性对照(超纯水)。
图4显示特异性引物PMZWF1/PMZWR1对美地绵粉蚧不同虫态、龄期和残体，以及采自不同寄主植物的SS-COI PCR扩增结果，M：分子量标准Trans2KTM；1-4：海南海口-扶桑，1：单粒卵；2：1龄若虫；3：2龄若虫；4：3龄若虫；5-13：雌性成虫，5：福建漳州-紫苏；6：广东汕头-鬼针草；7：广东汕头-扶桑；8：海南海口-扶桑；9：海南海口-木薯；10：海南陵水-扶桑；11：海南乐东-扶桑；12：海南乐东-苘麻；13：卢旺达-扶桑；14-16：卢旺达-扶桑，14：头部；15：胸部；16：腹部；17：阴性对照(超纯水)。
图5显示特异性引物PMZWF1/PMZWR1对美地绵粉蚧检测阈值的测定，其中，M：分子量标准Trans2KTM；1-15分别为，1：1/40；2：1/80；3：1/160；4：1/320；5：1/640；6：1/1280；7：1/2560；8：1/5120；9：1/10240；10：1/20480；11：1/40960；12：1/81920；13：1/163840头雌性成虫；14：阴性对照(超纯水)。
具体实施方式
实施例1：美地绵粉蚧特异性引物的设计与反应条件优化
1)美地绵粉蚧特异性引物的设计与引物合成
以美地绵粉蚧线粒体mtDNA COI基因序列为目标序列，设计美地绵粉蚧候选特异性引物4对(PMZWF1/PMZWR1,PMZWF1/PMZWR2,PMZWF2/PMZWR1,PMZWF2/PMZWR2)，其序列分别为：
Primer PMZWF1：5’-TTGATTGCTAATACCCTCCC-3’
Primer PMZWF2：5’-CTTTTACCTTTAATAATTTCATCTAG-3’
Primer PMZWR1：5’-GGTAATTGCTCTAGATAATAC-3’
Primer PMZWR2：5’-CATGTATATAAAGATAAATTATTTAAGT-3’
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2)美地绵粉蚧模板DNA的制备
将单头美地绵粉蚧置于滴有20μL裂解液(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、50mMEDTA、0.5％SDS、0.2％β-巯基乙醇，pH 8.0)的Parafilm膜上，以0.2mL PCR管底部作为匀浆器，将美地绵粉蚧充分研磨，匀浆液移入1.5mL离心管；用180μL裂解液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀；加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后，于65℃水浴40min(中途混匀1次)；4℃、7500r/min离心10min，取上清液，加入150μL预冷5M NaCl溶液混匀；4℃、12000r/min离心15min，取上清液约200μL到另一新离心管，200μL预冷异丙醇，沉淀DNA，置-20℃冰箱30min以上；4℃、12000r/min，离心15min，弃去上清液，沉淀用400μL预冷75％乙醇洗涤；4℃、12000r/min，离心10min，弃去乙醇；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后，加入40μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。
3)PCR扩增反应体系
反应体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTPs(10mM)0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水19.9μL。
4)PCR扩增程序及其优化
为确定不同引物对的最佳扩增条件，不同引物对的最适退火温度和引物的碱基序列，对各引物组合进行温度梯度PCR，退火温度范围为45℃-50℃。
95℃预变性2min；35个循环，95℃30sec，45-50℃30sec，72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增情况确定引物对的最佳反应条件。
实施结果
以美地绵粉蚧DNA为模板，对各引物组合进行退火温度为45-50℃的温度梯度PCR，以确定各引物对的最佳扩增条件。对于PMZWF1/PMZWR1引物组合，各退火温度下均能得到一307bp的单一条带(见附图1的A图)，且退火温度为49℃时扩增得到的条带最为清晰明亮(见附图1中A图的3泳道)。对于PMZWF1/PMZWR2引物组合，各退火温度下均能得到一243bp的单一条带(见附图1的B图)，且退火温度为45.9℃时扩增得到的条带最为清晰明亮(见附图1中B图的6泳道)。对于PMZWF2/PMZWR1引物组合，各退火温度下均能得到一369bp的单一条带(见附图1的C图)，且退火温度为49℃时扩增得到的条带最为清晰明亮(见附图1中C图的3泳道)。对于PMZWF2/PMZWR2引物组合，各退火温度下均能得到一305bp的单一条带(见附图1的D图)，且退火温度为45℃时扩增得到的条带最为清晰明亮(见附图1的D图的8泳道)。综上，以各引物对反应得到的扩增条带最为清晰明亮的扩增条件进行后续验证。
实施例2：美地绵粉蚧特异性引物的筛选
1)粉蚧模板DNA的制备
将单头粉蚧置于滴有20μL裂解液(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、50mM EDTA、0.5％SDS、0.2％β-巯基乙醇，pH 8.0)的Parafilm膜上，以0.2mL PCR管底部作为匀浆器，将粉蚧充分研磨，匀浆液移入1.5mL离心管；用180μL裂解液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀；加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后，于65℃水浴40min(中途混匀1次)；4℃、7500r/min离心10min，取上清液，加入150μL预冷5M NaCl溶液混匀；4℃、12000r/min离心15min，取上清液约200μL到另一新离心管，200μL预冷异丙醇，沉淀DNA，置-20℃冰箱30min以上；4℃、12000r/min，离心15min，弃去上清液，沉淀用400μL预冷75％乙醇洗涤；4℃、12000r/min，离心10min，弃去乙醇；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后，加入40μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。
2)美地绵粉蚧的特异性候选引物对(PMZWF1/PMZWR1、PMZWF1/PMZWR2、PMZWF2/PMZWR1、PMZWF2/PMZWR2)及其合成
Primer PMZWF1：5’-TTGATTGCTAATACCCTCCC-3’
Primer PMZWF2：5’-CTTTTACCTTTAATAATTTCATCTAG-3’
Primer PMZWR1：5’-GGTAATTGCTCTAGATAATAC-3’
Primer PMZWR2：5’-CATGTATATAAAGATAAATTATTTAAGT-3’
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应体系
反应体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTPs(10mM)0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水19.9μL。
4)PCR扩增程序
95℃预变性2min；35个循环，95℃30sec，49℃30sec(其中，PMZWF1/PMZWR1 49℃、PMZWF1/PMZWR2 45.9℃、PMZWF2/PMZWR1 49℃、PMZWF2/PMZWR2 45℃)，72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增情况判断候选引物对的特异性。
实施结果
以美地绵粉蚧特异性候选引物为靶标，以美地绵粉蚧以及同属近缘种(木薯绵粉蚧、石蒜绵粉蚧、扶桑绵粉蚧)和其他属代表物种(新菠萝灰粉蚧、双条拂粉蚧、木槿曼粉蚧、木瓜秀粉蚧、大洋臀纹粉蚧、康氏粉蚧)等9种常见种类的粉蚧DNA为模板，进行PCR扩增，检测特异性候选引物对美地绵粉蚧的扩增特异性。由图2可见，PMZWF1/PMZWR1引物组合仅在A-1泳道的美地绵粉蚧扩增出307bp的目的条带(见附图2的A图的1泳道)，在其他9种近缘种属的粉蚧和阴性对照中均无扩增产物。PMZWF1/PMZWR2引物组合除在B-1泳道的美地绵粉蚧扩增出目的条带外，泳道3、6也有微弱扩增(243bp)(见附图2中B图的1、3、6泳道)。PMZWF2/PMZWR1引物组合除在C-1泳道的美地绵粉蚧扩增出目的条带外，泳道3、4也有扩增(369bp)(见附图2中C图的1、3、4泳道)。PMZWF2/PMZWR2引物组合除在D-1泳道的美地绵粉蚧扩增出目的条带外，泳道3、4也有微弱扩增(305bp)(见附图2中D图的1、3、4泳道)。
表明4对候选引物中，引物PMZWF1/PMZWR1对美地绵粉蚧的特异性强，可用于进一步的实验验证，而其他引物组合不满足美地绵粉蚧特异性检测的要求。
实施例3：特异性引物PMZWF1/PMZWR1对美地绵粉蚧的扩增效果
1)粉蚧模板DNA的制备
将单头粉蚧置于滴有20μL裂解液(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、50mM EDTA、0.5％SDS、0.2％β-巯基乙醇，pH 8.0)的Parafilm膜上，以0.2mL PCR管底部作为匀浆器，将粉蚧充分研磨，匀浆液移入1.5mL离心管；用180μL裂解液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀；加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后，于65℃水浴40min(中途混匀1次)；4℃、7500r/min离心10min，取上清液，加入150μL预冷5M NaCl溶液混匀；4℃、12000r/min离心15min，取上清液约200μL到另一新离心管，200μL预冷异丙醇，沉淀DNA，置-20℃冰箱30min以上；4℃、12000r/min，离心15min，弃去上清液，沉淀用400μL预冷75％乙醇洗涤；4℃、12000r/min，离心10min，弃去乙醇；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后，加入40μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。
2)检验美地绵粉蚧的特异性引物的合成
Primer PMZWF1：5’-TTGATTGCTAATACCCTCCC-3’
Primer PMZWR1：5’-GGTAATTGCTCTAGATAATAC-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应体系
反应体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTPs(10mM)0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水19.9μL。
4)PCR扩增程序
95℃预变性2min；35个循环，95℃30sec，49℃30sec，72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增产物大小判断结果。
实施结果
利用引物PMZWF1/PMZWR1以美地绵粉蚧DNA为模板，以木薯绵粉蚧、石蒜绵粉蚧、扶桑绵粉蚧、菠萝粉蚧、新菠萝灰粉蚧、Ferrisia gilli、双条拂粉蚧、木槿曼粉蚧、橘鳞粉蚧、木瓜秀粉蚧、柑橘臀纹粉蚧、日本臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧、大洋臀纹粉蚧、榕树粉蚧、康氏粉蚧、桔小粉蚧、杰克贝尔氏粉蚧、Pseudococcus sp.、暗色粉蚧、蔗茎红粉蚧等21种同属/科的其他常见种类的粉蚧为对照进行SS-COIPCR扩增。在1泳道的美地绵粉蚧扩增出307bp的目的条带(见附图3的1泳道)，在其他21种近缘种属粉蚧和阴性对照中均无扩增产物。说明所筛选的来自美地绵粉蚧线粒体DNA的特异性SS-COI PCR扩增引物的特异性强。
特异性片段的序列为SEQ ID No.3：
实施例4：特异性引物PMZWF1/PMZWR1对美地绵粉蚧不同虫态、龄期和残体以及采自不同寄主植物和地理种群的扩增结果
1)美地绵粉蚧模板DNA的制备
将采自海南海口扶桑上的不同虫态(成虫、卵、若虫)和若虫龄期(1龄、2龄、3龄)的单头/单粒美地绵粉蚧，以及单头雌性成虫(分别来自福建漳州-紫苏、广东汕头-鬼针草、广东汕头-扶桑、海南海口-扶桑、海南海口-木薯、海南陵水-扶桑、海南乐东-扶桑、海南乐东-苘麻、卢旺达-扶桑)及其头部、胸部、腹部(均来自卢旺达-扶桑)分别置于滴有20μL裂解液(100mM NaCl、10mM Tris-HCl、50mM EDTA、0.5％SDS、0.2％β-巯基乙醇，pH 8.0)的Parafilm膜上，以0.2mL PCR管底部作为匀浆器，将粉蚧充分研磨，匀浆液移入1.5mL离心管；用180μL裂解液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀；加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后，于65℃水浴40min(中途混匀1次)；4℃、7500r/min离心10min，取上清液，加入150μL预冷5M NaCl溶液混匀；4℃、12000r/min离心15min，取上清液约200μL到另一新离心管，200μL预冷异丙醇，沉淀DNA，置-20℃冰箱30min以上；4℃、12000r/min，离心15min，弃去上清液，沉淀用400μL预冷75％乙醇洗涤；4℃、12000r/min，离心10min，弃去乙醇；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后，加入40μL(其中卵和1龄若虫20μL)超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。
2)检验美地绵粉蚧的特异性引物的合成
Primer PMZWF1：5’-TTGATTGCTAATACCCTCCC-3’
Primer PMZWR1：5’-GGTAATTGCTCTAGATAATAC-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应体系
反应体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTPs(10mM)0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水19.9μL。
4)PCR扩增程序
95℃预变性2min；35个循环，95℃30sec，49℃30sec，72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增产物大小判断结果。
实施结果
利用引物PMZWF1/PMZWR1以不同虫态、龄期和残体以及来自不同寄主植物和地理种群的美地绵粉蚧DNA为模板进行PCR扩增。美地绵粉蚧的雌性成虫(分别采自福建漳州-紫苏、广东汕头-鬼针草、广东汕头-扶桑、海南海口-扶桑、海南海口-木薯、海南陵水-扶桑、海南乐东-扶桑、海南乐东-苘麻、卢旺达-扶桑)扩增出了307bp的目的条带(见附图4的5、6、7、8、9、10、11、12、13泳道)；同时美地绵粉蚧的单粒卵，单头初孵若虫、2龄若虫、3龄若虫，以及雌性成虫的头部、胸部和腹部也扩增出了307bp的目的条带(见附图4的1、2、3、4泳道，以及附图4的14、15、16泳道)；说明所筛选的美地绵粉蚧种特异性SS-COI PCR扩增引物的准确性高。
实施例5：特异性引物PMZWF1/PMZWR1对美地绵粉蚧检测阈值的测定
1)美地绵粉蚧模板DNA的制备
将单头美地绵粉蚧雌性成虫置于滴有20μL裂解液(100mM NaCl、10mMTris-HCl、50mM EDTA、0.5％SDS、0.2％β-巯基乙醇，pH 8.0)的Parafilm膜上，以0.2mL PCR管底部作为匀浆器，将粉蚧充分研磨，匀浆液移入1.5mL离心管；用180μL裂解液分2次清洗匀浆器和Parafilm膜，移入同一离心管，混匀；加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀后，于65℃水浴40min(中途混匀1次)；4℃、7500r/min离心10min，取上清液，加入150μL预冷5M NaCl溶液混匀；4℃、12000r/min离心15min，取上清液约200μL到另一新离心管，200μL预冷异丙醇，沉淀DNA，置-20℃冰箱30min以上；4℃、12000r/min，离心15min，弃去上清液，沉淀用400μL预冷75％乙醇洗涤；4℃、12000r/min，离心10min，弃去乙醇；然后将离心管倒扣于洁净滤纸上，自然干燥20min后，加入40μL超纯水，充分溶解后于-20℃保存备用。将原模板溶液以2倍递减梯度稀释至浓度1/163840头，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
2)检验美地绵粉蚧的特异性引物的合成
Primer PMZWF1：5’-TTGATTGCTAATACCCTCCC-3’
Primer PMZWR1：5’-GGTAATTGCTCTAGATAATAC-3’由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
3)PCR扩增反应体系
反应体系为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL(含Mg2+)、dNTPs(10mM)0.4μL、上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.4μL、模板DNA 1.0μL、超纯水19.9μL。
4)PCR扩增程序
95℃预变性2min；35个循环，95℃30sec，49℃30sec，72℃30sec；最后72℃延伸5min。
5)PCR产物的鉴定
取4μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，后于凝胶成像系统根据扩增产物大小判断结果。
实施结果
利用引物PMZWF1/PMZWR1做检测阈值的测定，以不同稀释倍数的美地绵粉蚧的DNA为模板进行PCR扩增，所有个体都能检测到的最低模板DNA浓度为192.58pg/μL，相当于1/20480头雌性成虫(见附图5)。说明所筛选的美地绵粉蚧的特异性SS-COI PCR扩增引物的灵敏性高。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 美地绵粉蚧的特异性SS-COI 检测引物及检测方法和试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgattgcta ataccctccc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtaattgct ctagataata c 21
<210> 3
<211> 307
<212> DNA
<213> 美地绵粉蚧(Madeira mealybug)
<400> 3
ttgattgcta ataccctccc taatattaat aattttaaac ataatactaa ataataatat 60
taatactgga tgaactcttt atcctccatt aattaatcaa aactttatta ctttaaattt 120
tattattttt tctcttcatt taaatggttt atcatcaatt tttagatcaa tcaattttat 180
ttcatcaatt ataattatta ataataaaaa attttactta aataatttat ctttatatac 240
atgatcaatt ataattacta catttcttct aattatttct attcctgtat tatctagagc 300
aattacc 307
Claims (4)
1.美地绵粉蚧特异性SS-COI引物，其特征在于，所述引物序列为：
引物PMZWF1：5’-TTGATTGCTAATACCCTCCC-3’；和
引物PMZWR1：5’-GGTAATTGCTCTAGATAATAC-3’。
2.美地绵粉蚧特异性基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
3.一种美地绵粉蚧特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述的美地绵粉蚧特异性SS-COI引物进行PCR扩增的步骤。
4.一种美地绵粉蚧检测特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的美地绵粉蚧特异性SS-COI引物。
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