CN103045727B

CN103045727B - 一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的snp标记及其应用

Info

Publication number: CN103045727B
Application number: CN201210480570.6A
Authority: CN
Inventors: 刘剑锋; 王海飞; 赵红梅; 张勤; 张胜利
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-11-22
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-11-22
Also published as: CN103045727A

Abstract

本发明涉及一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记及其应用。所述SNP标记的位点位于中国荷斯坦奶牛HAL基因如SEQ ID NO.1所示序列的197bp位点处，此处位点的碱基为G或A，此处碱基为G的中国荷斯坦奶牛的乳蛋白含量显著高于此处碱基为A的中国荷斯坦奶牛，而体细胞评分前者显著低于后者。本发明还提供了用于检测所述SNP标记的引物及含有该引物的试剂盒。本发明还提供了所述SNP标记在鉴定乳蛋白量高、体细胞评分低的中国荷斯坦奶牛优势品种中的应用。本发明还提供了所述SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用。本发明的SNP标记为中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分的标记辅助选择提供了科学依据。

Description

一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记及其应用

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记及其应用。

背景技术

奶业发展是一个国家畜牧业现代化的重要标志。近几年，经过奶牛产业工作者的不懈努力，我国奶牛产业的发展迅速，对于促进农民增收，改善国民身体素质，优化农业结构有重要意义。人均占有量少、奶牛单产量低、以扩充奶牛数量提高产奶总量的传统发展模式，仍是我国奶业发展面临的主要问题。因此，培育高产奶牛群体，奶牛养殖向数量与质量并重转变已成为我国奶牛产业发展的关键。只有提升我国奶牛群体的遗传水平，改善奶牛健康状况，提高奶牛产奶水平，才能使我国奶牛产业实现持续健康发展。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类遗传标记，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现形式有转换、颠换、插入和缺失等。

测序、单链构象多态性聚合酶链式反应（PCR-single-strandconformation polymorphism,PCR-SSCP）、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（PCR-restriction fragment lengthpolymorphism,PCR-RFLP）及飞行时间质谱等技术可以实现SNP的检测。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。

飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Timeof Flight，MALDI-TOF）是一种准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短的检测技术。其原理是利用样品分子在电场中的飞行时间与分子的荷质比成正比的原理，通过检测样品分子的飞行时间，测得分子量，实现区分、鉴别物质的目的。SNP位点两个等位基因间分子量存在差异，因此运用该技术即可实现基因分型。飞行时间质谱（MALDI-TOF）平台已被广泛应用于生物技术领域，有统计显示超过95%的已验证SNP都能使用该平台进行分析和研究。

分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择，综合改良畜禽重要经济性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。分子育种为家畜育种开辟了一条新的途径，随着现代生物技术的发展，分子标记在家畜育种中的作用将日益突出。在奶牛的育种中，人们希望通过对与产奶性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，以实现早期选种和提高育种准确性的目标，从而取得更大的遗传进展。

组氨酸解氨酶（Histidine Ammonia-lyase,HAL)是一种胞质溶胶酶，催化组氨酸代谢过程的第一步，即L-组氨酸的非氧化脱氨形成反式利尿酸。组氨酸解氨酶是催化哺乳动物组氨酸代谢的第一步限速酶，HAL基因的多态性变异可能改变组氨酸解氨酶的催化效率，影响动物体内组氨酸代谢。在中国荷斯坦奶牛群体中进行全基因组关联分析，发现HAL基因对产奶量和乳蛋白量的影响达到显著水平。HAL基因的多态性变异可能影响奶牛体内组氨酸的消化吸收，从而影响其产奶量、乳蛋白量等产奶性状。

发明内容

本发明的目的是提供一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记及其应用。

本发明的目的是提供一种用于检测中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分的核酸片段，该核酸片段的序列如SEQ ID NO.1所示，第197bp位点处的碱基为G或A。

本发明的目的是提供一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记,所述SNP标记位于中国荷斯坦奶牛HAL基因如SEQ ID NO.1所示序列的197bp位点处，在SEQ ID NO.1序列中用n表示该处位点，且此处位点的碱基为G或A。197bp位点处碱基为G的中国荷斯坦奶牛的乳蛋白含量显著高于此处碱基为A的中国荷斯坦奶牛，而体细胞评分前者显著低于后者。

本发明的另一目的是提供用于检测与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记的引物。

本发明的用于检测所述SNP标记的引物，包括正向引物F：5’–GGCAACTACCTGAACCAA-3’和反向引物R：5’–CACCACCCTGTCAATCAA-3’，分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

本发明的另一目的是提供用于检测与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记的试剂盒，该试剂盒含有前述正向引物F和反向引物R。

所述试剂盒包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明的另一目的是提供所述SNP标记在鉴定乳蛋白量高、体细胞评分低的中国荷斯坦奶牛优势品种中的应用。所述应用为利用单核苷酸多态性来检测中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分。

所述SNP标记在鉴定乳蛋白量高、体细胞评分低的中国荷斯坦奶牛优势品种的应用，包括以下步骤：

（1）提取待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA；

（2）以待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA为模版，利用引物F和R，通过PCR反应扩增出中国荷斯坦奶牛HAL基因307bp片段，其中，

F：5’–GGCAACTACCTGAACCAA-3’

R：5’–CACCACCCTGTCAATCAA-3’；

（3）检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中197bp处的碱基为G，则待测中国荷斯坦奶牛属于乳蛋白量高、体细胞评分低的中国荷斯坦奶牛优势品种。

其中，步骤（2）中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/LdNTP mix2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；

F：5’-GGCAACTACCTGAACCAA-3’

R：5’-CACCACCCTGTCAATCAA-3’。

其中，步骤（2）中PCR反应的条件为：94℃5分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃35秒，34个循环；72℃10分钟。

本发明的另一目的是提供所述SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用，该应用能够加快中国荷斯坦奶牛的育种进程。

所述SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用，包括以下步骤：

（1）采用聚合酶链式反应（PCR）和测序技术筛选到与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记；

（2）通过飞行时间质谱方法来检测待测中国荷斯坦奶牛的基因型；

（3）根据基因型进行乳蛋白量高、体细胞评分低的中国荷斯坦奶牛优势品种的选育。

本发明对中国荷斯坦奶牛的HAL基因的SNP位点进行基因分型，并对该基因的G197A与奶牛的产奶性状及体细胞评分进行关联分析，通过SAS9.0软件Mixed过程进行线性模拟分析发现，GG基因型个体的乳蛋白量显著高于AA基因型个体（P<0.05），GG基因型个体的体细胞评分极显著低于AA基因型个体（P<0.01）。该多态位点的检出，为中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分的标记辅助选择提供了科学依据。

检测中国荷斯坦奶牛HAL基因单核苷酸多态性，以与产奶性状及体细胞评分相关的SNP作为分子标记，为中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分的标记辅助选择提供了科学依据。

本发明的与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记及其应用具有如下优点：

（1）本发明提供的分子遗传标记不受中国荷斯坦奶牛的年龄、性别等限制，可用于中国荷斯坦奶牛的早期选育，甚至在刚出生时就可准确地进行筛选，可显著促进中国荷斯坦奶牛的育种进程。

（2）检测中国荷斯坦奶牛HAL基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便。

（3）中国荷斯坦奶牛的HAL基因的SNP位点的检出，为中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分的标记辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1为三种基因型测序峰图；

其中，（a）为GG型；（b）为AA型；（c）为GA型；

图2为三种基因型飞行时间质谱SNP分型聚类分析图；

其中，横轴区域表示GG基因型个体；纵轴区域表示AA基因型个体；中间区域表示GA基因型个体；No call表示个别个体基因型缺失；Low Mass Height表示低分子量位点；High Mass Height表示高分子量位点。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.1提取待测中国荷斯坦奶牛血液中的基因组DNA

将采自北京地区不同奶牛养殖场的14个公牛家系共638头中国荷斯坦奶牛的牛血样保存于-20℃，该牛血样为凝结牛全血，全血分为血凝块和血清，血凝块为黯红色，血清呈清亮黄色，血液中只有白细胞内含有DNA，白细胞主要存在于血凝块部分。

本试验采用天根血液DNA提取试剂盒从血凝块中提取基因组DNA，具体步骤如下：

1)预备2mL已灭菌的圆底离心管，每个管内放置一颗洁净钢珠（直径约5mm-6mm）；

2)取出血液样品，融化后，用手术剪刀剪取约200μl-300μl血凝块于离心管中。加入600μl细胞裂解液CL，放入组织研磨器中，以30次/秒的频率研磨5分钟，放置在55℃烘箱中处理2-3分钟，其间颠倒混匀数次，取出钢珠丢弃；

3)10,000rpm离心1min,弃去暗红色上清；

4)再次加入600μl细胞裂解液CL，振荡器振荡使沉淀物散开悬浮，10,000rpm离心1min,弃去上清；

5)加入200μl缓冲液GS，用涡旋仪充分悬浮血块颗粒；

6)加入20μl蛋白酶K，220μl缓冲液GB，充分晃动混匀；

7)55℃转炉中过夜消化，消化初始阶段，要颠倒混匀数次以促进消化过程，直至溶液变澄清透明，一般为浅棕色；

8)加入200μl冰镇无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，5000转/分离心2分钟，将杂质如牛毛等沉淀至管底。将离心管中液体转移到吸附柱中，12,000rpm离心30s,弃去收集管中的废液，未离心完全的再次离心；

9)向吸附柱中加入500μl去蛋白液GD，静置2分钟，12000rpm离心30s,弃去收集管中废液；

10)向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，静置2分钟，12,000rpm离心30s,弃去废液；

11)重复上一步；

12)12,000rpm离心2min；

13)将吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，开口在55℃烘箱中晾置2分钟，至乙醇挥发完全；

14)加入100μl预热的洗脱缓冲液TB，盖盖，在55℃烘箱中静置2min；

15)12,000rpm离心2min，弃吸附柱。

牛血液中的基因组DNA存在于离心管溶液中，4℃保存备用或-20℃长期保存。

1.2扩增含SNP位点的核苷酸片段

根据Ensembl数据库收录的HAL基因（ENSBTAG00000016276)序列设计引物，包括正向引物F：5’-GGCAACTACCTGAACCAA-3’和反向引物R：5’-CACCACCCTGTCAATCAA-3’，以1.1中的基因组DNA为模板，扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，如SEQ IDNO.1所示。该SNP位点位于PCR扩增片段的197bp处，此处碱基可以为G或A。

其中，PCR反应体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix 2.0μl，5U/μL TaqDNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水。

PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃35秒，34个循环；72℃10分钟。

1.3检测PCR扩增片段，获得SNP标记

对1.2中的PCR扩增产物进行测序检测，如果扩增产物序列中197bp处的碱基为G，则待测中国荷斯坦奶牛属于乳蛋白量高、体细胞评分低的中国荷斯坦奶牛优势品种。三种基因型的测序峰图如图1所示。

1.4基因型判定

通过飞行时间质谱方法来检测待测中国荷斯坦奶牛的基因型；根据飞行时间质谱的结果判定SNP位点在检测群体中的基因型。根据样品的信号的分布位置，基因型可分为GG型、GA型和AA型。三种基因型的分型结果如图2所示。

1.5上述SNP标记在中国荷斯坦奶牛优势品种选育中的应用

该SNP可作为分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响乳蛋白量及体细胞评分的数量性状基因座，以对奶牛直接进行基因型选择或标记辅助选择，从而加快中国荷斯坦奶牛优势品种的选育。

实施例2中国荷斯坦奶牛不同基因型与产奶性状及体细胞评分的关联分析与检测应用

按照实施例1的方法，对采自北京地区不同奶牛养殖场的14个公牛家系共638头中国荷斯坦奶牛进行飞行时间质谱检测，HAL基因如SEQ ID NO.1所示序列197bp位点的分析结果如表1所示。

运用SAS9.0软件Mixed程序进行线性模拟分析SNP多态位点的基因型与产奶性状及体细胞评分的关联关系，分析时以个体育种值(EBV，由中国奶牛数据中心提供)代表表型值，采用的模型如下：

Y_ijk=μ+G_i+a_j+e_ijk

其中，Y_ijk为个体育种值向量，μ为育种值群体均值，G_i为基因型效应向量，a_j为微效多基因效应向量，e_ijk为随机残差效应向量。分析结果如表2所示。

表1SNP位点在中国荷斯坦奶牛群体中的基因型频率及等位基因频率

由表1可知，GG纯合型个体数显著高于AA型，G等位基因为优势基因。进行卡方适合性检验，

（1）=3.84，可知该位点在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。

表2中国荷斯坦奶牛HAL基因SNP位点与产奶性状及体细胞评分进行关联分析

	乳蛋白量	体细胞评分
			P值	0.0447*	<.0001**
AA	6.9854±4.7116^b	303.23±1.7988^Aa
			GA	11.1322±4.3397^ab	301.07±1.6597^Ab
GG	12.5897±4.2881^a	298.69±1.6404^B

表2中的数值表示为最小二乘均值±标准误差；表中相同的字母表示差异不显著，不同的字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著（P<0.01），小写字母表示差异显著（P<0.05），*表示显著相关（P<0.05），**表示极显著相关(P<0.01)。

由表2可知，基因型对乳蛋白量的影响达到了显著水平（P<0.05），对体细胞评分的影响达到极显著水平(P<0.01)。GG基因型乳蛋白量显著高于AA型，GA基因型与两种基因型间差异不显著；而GG基因型的体细胞评分极显著低于GA型和AA型，GA基因型显著低于AA型。

实施例3试剂盒

试剂盒中各成分组成如下：

50-100ng/μl牛血液DNA；

引物F；

引物R；

dNTP mix；

5U/μl Taq DNA聚合酶；

10×PCR反应缓冲液；

双蒸水。

试剂盒中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl牛血液DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；

F：5’-GGCAACTACCTGAACCAA-3’

R：5’-CACCACCCTGTCAATCAA-3’。

其中，PCR反应的条件为：94℃5分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃35秒，34个循环；72℃10分钟。

反应所得产物即为目的核苷酸片段,序列如SEQ ID NO.1所示，检测该序列197bp位点上的碱基，从而判断样本的基因型，对产奶性状及体细胞评分做出判断。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于检测中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有正向引物F：5’-GGCAACTACCTGAACCAA-3’和反向引物R：5’-CACCACCCTGTCAATCAA-3’，扩增的核酸片段的序列如SEQ IDNO.1所示，第197bp位点处的碱基为G或A。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺和PCR反应缓冲液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

4.一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记在鉴定乳蛋白量高、体细胞评分低的中国荷斯坦奶牛优势品种中的应用,其特征在于，所述SNP标记位于中国荷斯坦奶牛HAL基因如SEQ ID NO.1所示序列的197bp位点处，此处位点的碱基为G或A。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测中国荷斯坦奶牛的基因组DNA；

F:5’-GGCAACTACCTGAACCAA-3’

R:5’-CACCACCCTGTCAATCAA-3’；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，10mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；

F：5’-GGCAACTACCTGAACCAA-3’

R：5’-CACCACCCTGTCAATCAA-3’；

PCR反应的条件为：94℃5分钟；94℃30秒，52℃30秒，72℃35秒，34个循环；72℃10分钟。

7.一种与中国荷斯坦奶牛产奶性状相关的SNP标记在中国荷斯坦奶牛分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，所述SNP标记位于中国荷斯坦奶牛HAL基因如SEQ ID NO.1所示序列的197bp位点处，此处位点的碱基为G或A。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用聚合酶链式反应和测序技术筛选到与中国荷斯坦奶牛产奶性状及体细胞评分相关的SNP标记；