CN107881244B - 用于牛黄真伪鉴别的荧光定量pcr检测的探针引物及检测方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方法，能够用于对牛黄类药材、成方制剂及其他相关产品进行真伪鉴定。本发明还提供了探针引物用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的用途，所述探针引物为SEQ ID NO：1‑3、4‑6、7‑9、10‑12、13‑15和/或16‑18所示的探针引物组，其中SEQ ID NO：13‑15和16‑18为新的探针引物组。所述方法采用荧光定量PCR探针法，检测样品中应有的动物源性成分和不应有的动物源性成分。应用于牛黄类药材、成方制剂及其它相关产品的质量控制，所述方法特异性强、灵敏度高、重复性好。

Description

用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方 法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及药物鉴别检测方法，尤其涉及一种用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方法。
背景技术
天然牛黄为牛科动物牛(Bos taurus domesticus Gmelin)的干燥胆结石，主要含有胆红素、胆汁酸、胆固醇、无机元素、蛋白质及氨基酸等成分，具有清心开窍、凉肝解毒、豁痰息风等功效，是名贵中药材之一[1-2]。由于其资源紧缺，价格昂贵，我国于20世纪50年代中期即开始了替代品即培植牛黄、体外培育牛黄与人工牛黄的研究。
培植牛黄是利用活牛体，以外科手术的方法在牛的胆囊内插入致黄因子，使之生成牛黄。体外培育牛黄是根据胆红素钙结石体内形成的原理和生物化学过程，应用现代生物工程技术，在体外牛胆囊胆汁内模拟体内胆结石形成的原理和生物化学过程，培育牛胆红素钙结石。人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成。
由于人工培植牛黄是在与天然牛黄相同的特定生态因素条件下形成的，经测定其理化特性、性味、色泽、药效成分含量等与天然牛黄无明显差异。而体外培育牛黄在性状、结构、成分和主要成分含量方面与天然牛黄类似。人工牛黄则与天然牛黄差异较大[3-7]。
牛黄在成方制剂中应用广泛，资源短缺，特别是天然牛黄和培植牛黄，生产周期长，产量低，属于珍贵稀有的药材，近来市场上屡屡曝出掺伪造假的情况。为了防止此类现象的发生，迫切需要开发新的检测手段，加强监管，对牛黄类药材的质量进行更好的控制。
发明内容
本发明首次建立了一种用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的探针引物及检测方法，其能够用于牛黄类药材及其相关产品的鉴定。
一方面，本发明提供了一种用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测方法，包括下述步骤：
称取牛黄样品及样品前处理；
从所述样品中提取DNA并制备DNA模板；及
选择探针引物；
优化反应条件；
利用所述探针引物对所述DNA模板进行扩增；
针对扩增结果，根据设定的CT值临界点判定阳性结果；
其中，所述方法能够用于检测所述样品中应有的牛源性成分和不应有的包括猪、马、驴、羊等其他动物来源成分。
在一些实施方式中，所述探针引物选自下述组群中的一组或多组：序列号为SEQID NO 1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18的探针引物。其中每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
在另一些实施方式中，所述探针引物为序列号为SEQ ID NO 13-15和/或16-18的探针引物。在另一些实施方式中，所述探针引物为序列号为SEQ ID NO 1-3、4-6、7-9和/或10-12的探针引物。
在本发明的一种实施方式中，所述样品为牛黄类中药材或含有牛黄的成方制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定。
在本发明的一种实施方式中，选择探针引物的步骤通过考察特异性和灵敏度，选择所述探针引物为针对猪的cytb组探针引物，针对马的CO I或ATP探针引物，针对牛的CO I探针引物，或针对驴的LOOP或ND5探针引物。
在本发明的一种实施方式中，所述反应条件包括：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火45s，60℃收集荧光。
在本发明的一种实施方式中，当所述探针引物为cytb组探针引物时，所述设定的CT值临界点为40，即当CT值＜40时判定为阳性结果。
所述检测方法运用的是荧光定量PCR中的TaqMan探针法。TaqMan探针法其主要原理是在探针两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团。当引物探针均与DNA模板特异性结合时，DNA聚合酶的外切酶活性将探针切断，荧光基团游离出来从而检测到荧光信号；当探针或引物无法结合模板时，探针处于完整状态，报告基团的荧光被淬灭基团吸收，因此检测不到荧光信号[8-11]。本发明人通过研究发现TaqMan探针方法由于借助探针和引物的双重作用，较普通PCR法及染料法荧光定量PCR法，特异性更好，由于借助于荧光信号的产生情况判定结果，其灵敏度高。本发明的研究表明，基于以上特点，该方法尤其适用于目的DNA含量较少或可能有多物种混杂的样品，在药品检定中具有很好的应用前景。
另一方面，本发明提供了探针引物用于牛黄真伪鉴别的荧光定量PCR检测的用途，其中所述探针引物为SEQ ID NO：1-3、4-6、7-9、10-12、13-15和/或16-18所示的探针引物组，其中每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
本发明的所述探针引物和所述方法能够用于牛黄类中药材或含有牛黄的成方制剂的检测。另外，本发明的所述探针引物和所述方法还可用于肉类、胶类药材等的马/牛源性成分检测。
再一方面，本发明提供了自行设计的探针引物，其由SEQ ID NO：13-15或16-18所示的DNA序列组成。
本发明人通过研究发现，牛黄类药材中组织细胞含量较少，DNA的丰度较低，用普通PCR方法难以检测，而用TaqMan探针法可以很容易检测到其中各种来源的DNA。除了TaqMan探针，还可采用MGB探针，该类型探针可分辨1个碱基的差异，能够应用于基因分型、病毒变异等检测。
附图说明
图1为根据本发明的一种实施方式描述两组探针引物扩增猪DNA模板情况的曲线，其中：A和B分别对应cytb组(SEQ ID NO：1-3)和ND2组的情况。
图2为根据本发明一种实施方式的中阳性样品(含猪源性成分的培植牛黄伪品)的扩增曲线(SEQ ID NO：1-3)。
图3为描述猪cytb探针引物(SEQ ID NO：1-3)扩增其他常见近缘物种的情形，其中A、B和C分别是对驴、马、牛来源的DNA进行扩增的曲线。
图4描述了根据本发明一种实施方式对同一样品重复3次实验的结果(SEQ ID NO：1-3)。
图5A-5B为自行设计的牛探针引物(SEQ ID NO：16-18)检测牛皮和牛黄样品的结果。其中A、B、C和D分别是对牛皮、天然牛黄、培植牛黄、人工牛黄来源的DNA进行扩增的曲线。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的描述，这些实施例仅仅是说明性的，因此不应将其解释为对本发明范围的限制。
一、仪器与试剂
实时荧光定量PCR仪(AB 7500 FAST)，分析天平(Mettler AB135-S)，纯水仪(Millipore公司)，球磨仪(M400，Retsch)，微量紫外分光光度计，高速离心机，金属加热器。血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304，天根生化科技有限公司)，
Figure BSA0000152789640000041
UniversalMaster Mix II，探针与引物。
二、样品收集
收集培植牛黄伪品广西3批，四川2批，培植牛黄正品、天然牛黄、人工牛黄各1批(表1)。
表1、样品信息表
样品编号 样品名称 产地/来源
PZNH_WP01 培植牛黄伪品 广西
PZNH_WP02 培植牛黄伪品 广西
PZNH_WP03 培植牛黄伪品 四川
PZNH_WP04 培植牛黄伪品 四川
PZNH-HZ 培植牛黄伪品 广西
PZNH_SD 培植牛黄正品 陕西省所提供
NH_SD 天然牛黄 中国食品药品检定研究院 对照药材
RGNH_SD 人工牛黄 中国食品药品检定研究院 对照药材
二、荧光定量PCR检测方法的建立
1、DNA提取
使用普通提取动物组织的试剂盒提取，采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定，本发明人发现一般10mg左右样品，可获得20～100ng左右的DNA；这些DNA溶于50uL体系TE中，取0.5～1uL作为模板，检测结果的CT值一般在30以下或30左右。DNA的纯度OD260/280往往很难达到1.7，但是对于最终的检测结果影响不大。所以该方法对于模板DNA的数量和质量耐受性良好。
2、探针引物的选择
从文献中查到两组针对猪(Sus scrofa breed)的探针引物，分别位于cytochromeb(cytb)和NADH dehydrogenase subunit 2(ND2)。cytb组探针引物可对猪的DNA模板进行有效扩增，呈现典型的S型扩增曲线，CT值在20左右。ND2组无典型S型曲线出现，即不能对猪的DNA模板进行有效扩增(图1)。因此本方法选择cytb组探针引物进行实验。同样对牛、马、驴的特异性探针进行筛选。
根据一种实施方式，本发明涉及荧光定量PCR方法的探针法，包括在探针/引物序列相同情况下的不同荧光信号或非荧光信号标记(如FAM，TAMARA，BQ等)、不同类型探针(如TaqMAN探针，MGB探针等)。
在探针/引物的选择上，既有对已报道探针/引物的筛选，找到适合该检测目的的最优探针/引物(考察特异性和灵敏度)，也有自行设计的新的探针/引物。
在一些实施方式中，本发明的所使用的探针引物如表2所示。
表2、探针引物
Figure BSA0000152789640000051
Figure BSA0000152789640000061
注：(1)每组探针引物包括三个序列，实验中同时使用不可拆分；(2)序列1-3用于检测样品中的猪源性成分，序列4-6用于检测样品中的马源性成分，序列7-9和10-12用于检测样品中的驴源性成分，序列13-15用于检测样品中的马源性成分，序列16-18用于检测样品中的牛源性成分；(3)序列1-3、4-6、7-9、10-12引自文献，序列13-15、16-18为本发明人自行设计；(4)所述序列信息也列于本申请所附的序列表。
3、反应条件的选择
反应条件选用常规TaqMan探针法荧光定量PCR条件，即94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火45s，60℃收集荧光，阳性对照组可得到较为典型S型的扩增曲线(图1)。扩增通常最迟在46～48个达到平台期，故总共收集荧光信号到50个循环(图2)。
4、CT值临界点的确定
以培植牛黄为例，阳性样品的CT值通常小于35，没有发现大于40的情况(如图2所示)，故将阳性结果CT值临界点定在40，即CT值＜40判定为阳性结果，检出猪源性成分。同样方法确定其他探针检测时的阳性结果判定CT值。
5、探针引物的种属特异性考察
用猪特异的探针引物，分别对驴、马、牛来源的DNA进行扩增，均无典型S型曲线出现，即结果全部为阴性(图3)。可见该探针引物的特异性良好。同样对其他探针的特异性进行测试。
6、适用性考察
使用该方法检测了5批培植牛黄伪品、1批培植牛黄正品。5批伪品全部检测出猪源性成分，1批正品未检测出猪源性成分(表3)。可见该方法适用性良好。
表3、牛黄类药材样品的检测结果
Figure BSA0000152789640000071
7、中间精密度
以培植牛黄药材为例，同一次试验中，培植牛黄对照药材的两个重复实验组均为阴性结果；5批培植牛黄伪品，其两个平行试验组CT值之差(ΔCT)在0.14～0.95之间(表2)。
8、重复性
以培植牛黄药材为例，同一阳性样品(含猪源性成分的培植牛黄伪品)使用该方法重复三次实验，得到一致结果，即三次都检出该样品中含有猪源性成分(图4)。可见该方法重复性良好。
9、牛黄类药材中牛源性成分检测
应用自行设计的牛探针引物，检测几种不同的牛黄类药材中含牛源性成分情况。结果天然牛黄、培植牛黄、人工牛黄中都成功检测出了牛源性成分。其中选择牛皮作为阳性对照(图5A-5B)。
三、总结与讨论
天然牛黄是牛在自然条件下形成的胆囊结石，资源有限，培植牛黄虽为人工养殖生产，但由于生产周期长，产量低，市场需求量又很大，所以仍然属于珍贵稀有的药材，掺伪造假现象比较严重，尤其含猪源性成分的伪品比较多见，迫切需要对其加强监管。
真伪鉴别从DNA角度的判断最为准确，而本方法所运用的基于TaqMAN探针的DNA分子鉴别方法，由于探针和引物的双重识别，较普通PCR方法大大提高了特异性，基于荧光信号的检测手段又在很大程度上提高了方法的灵敏度。该类方法特异性强、灵敏度高、重复性好，在中药检定中迄今尚无应用的先例，因此建立该方法迫切而必要。
牛黄类药材样品中组织细胞含量较少，DNA的获取量较小。本方法灵敏度高适用于培植牛黄这类药材的检验，是其优势，然而这要求实验人员受过正规的分子生物学试验技能训练，正确实验操作，并在操作过程中，注意防止外来污染干扰。该方法重复性良好，只要操作严格规范，一般可以较好的杜绝假阴性或假阳性的情况。将该方法应用到实际检验工作中，可严厉打击市场上牛黄类药材的掺伪造假现象，从而为牛黄类药材的质量控制和市场监管提供有力的技术支持。
本文对一些具体的实施例进行了详细的描述，然而这只是作为对发明目的实例说明，而不限制下述权利要求书的范围。应当理解，对本文所述具体方案的不同取代、改变和修饰都不偏离本发明权利要求所定义的内涵和外延，从而应当属于本申请所要求保护的发明范围。
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Figure IDA0001584184070000011
Figure IDA0001584184070000021
Figure IDA0001584184070000031
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Claims (1)

1.一种用于牛黄真伪鉴别的探针引物，其特征在于，所述探针引物包括：针对猪的引物探针如SEQ ID NO:1-3所示、针对马的引物探针如SEQ ID NO:4-6所示或如SEQ ID NO:13-15所示、针对驴的引物探针如SEQ ID NO:7-9所示或如SEQ ID NO:10-12所示和针对牛的引物探针如SEQ ID NO:16-18所示。
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