CN105586397A - 一种燕窝制品实时荧光pcr鉴定方法 - Google Patents

一种燕窝制品实时荧光pcr鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学检测技术领域。一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，待检燕窝制品DNA的提取；步骤二，金丝燕成分实时荧光PCR扩增；首先，在PCR反应管中加入2×PCR？Master？Mix？12.5μL，上游引物和下游引物各0.5-1μL，Taqman探针0.5-1μL，50ng/μL待检燕窝制品DNA1-2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；其次，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪完成PCR扩增；步骤三，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。本发明的主要原理是燕窝主要来自金丝燕的唾液，里面含有金丝燕的DNA，通过检测燕窝中的金丝燕12S？rRNA基因来鉴别燕窝的真假。

Description

一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及燕窝的鉴定方法。
背景技术
燕窝是中国自明代以来开始被食用的传统名贵食品之一，是指雨燕目雨燕科金丝燕属的几种金丝燕摄食的昆虫、海藻、银鱼等物经消化后，分泌出来的唾液与绒羽等混合筑成的巢窝。燕巢呈半月形，，直径6～7厘米，基底厚，廓壁薄，重约5～15克。燕巢外围整齐，内部粗糙，有如丝瓜网络。主要产自印尼、马来西亚、泰国和越南等东南亚国家。
中医认为燕窝："养阴润燥、益气补中、治虚损、咳痰喘、咯血、久痢”，适宜于体质虚弱，营养不良，久痢久疟，痰多咳嗽，老年慢性支气管炎、支气管扩张、肺气肿、肺结核、咯血吐血和胃痛病人食用。研究发现燕窝含有丰富的活性蛋白质，以及钙、磷、铁等微量元素。其含有的表皮生长因子和水溶性物质能够刺激细胞分裂、再生和组织重建，促进人体康复。同时能增强人体免疫力，抵抗病毒和感冒。由于燕窝具有较高的营养和保健价值，市场对燕窝制品的需求量日益增加。一些商贩以银耳、猪皮、琼脂、果胶等原料伪造燕窝制品，危害了消费者的利益。
目前燕窝真伪鉴定方法主要是经验鉴别法、显微鉴别法和仪器鉴别法(包括凝胶电泳法、红外光谱法、气相色谱法等)。这些方法中有的准确性不高，灵敏度低；有的提取纯化程序冗长，重现性不好；有的鉴别成本高昂。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，解决以上技术问题。
本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，待检燕窝制品DNA的提取；
步骤二，金丝燕成分实时荧光PCR扩增；
首先，在PCR反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5-1μL，Taqman探针0.5-1μL，50ng/μL待检燕窝制品DNA1-2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；
其次，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
a.94-95℃5min，1个循环，预变性；
b.94-95℃10-20sec；60℃20-40sec，40个循环，PCR扩增；
步骤三，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。
本发明的主要原理是燕窝主要来自金丝燕的唾液，里面含有金丝燕的DNA，通过检测燕窝中的金丝燕12SrRNA基因来鉴别燕窝的真假。如果燕窝制品中能检出金丝燕特异性12SrRNA基因，则待检燕窝制品为真燕窝；如果未检出金丝燕特异性12SrRNA基因，说明待检燕窝制品为假冒燕窝。
本发明特异性好、灵敏度高的特点，简单快速，整个检测过程只需要3～4小时。
步骤一中，待检燕窝制品DNA的提取可以采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
在步骤二与步骤三之间，进行DNA浓度的测定，将DNA浓度调整为50ng/μL，首先使用紫外分光光度计检测提取待检燕窝制品DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：
C＝A*N*50；
其中C—DNA浓度，单位为ng/μL；
A—260nm处的吸光值；
N—DNA稀释倍数；
将DNA浓度稀释到50ng/μL。
步骤二中，通过对金丝燕特异性12SrRNA基因进行扩增。
通过特异性扩增金丝燕的12SrRNA基因序列对燕窝进行鉴定，扩增的DNA片段大小为144bp。
步骤二中，扩增金丝燕12SrRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan探针的序列如下：
上游引物序列:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’
下游引物序列:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’；
TaqMan探针序列：
5’-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3’，
其中5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的浓度为10μmol/L。
本发明根据金丝燕的12SrRNA基因特异性序列设计一对组引物(上游引物SWT-F：5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’和下游引物SWT-R:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’)和一条Taqman探针(探针SWT-P序列为：5’-FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94～95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团，当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’→5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反应模板数量。
本发明对待检燕窝制品进行检测时，每个待检燕窝制品同时做两个平行。
步骤二中，对金丝燕成分实时荧光PCR扩增时，应设立三个对照：阳性对照(金丝燕基因组DNA)、阴性对照(非金丝燕基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)；
并且，同时扩增真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因。
步骤二中，同时检测真核生物18SrRNA基因以判断是否从待检燕窝制品中提取适宜进行实时荧光PCR的DNA或提取的DNA中是否存在PCR反应抑制因子；
步骤二中，分别配置真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman探针。
本发明涉及的真核生物18SrRNA基因引物和探针序列参考标准GB/T25165-2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》:
(1)上游引物18S-F：5’-CCTGAGAAACGGCTACCAC-3’；
(2)下游引物18S-R：5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’；
(3)TaqMan探针18S-P：5’-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
步骤三，分析扩增结果时，应设置的各种对照实时PCR检测结果应全部符合以下情况，否则应重做实验：
a.阳性对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都出现扩增曲线，Ct值小于30；
b.阴性对照的真核生物18SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值小于30，金丝燕12SrRNA基因未出现扩增曲线，Ct值≥40；
c.空白对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都未出现扩增曲线，Ct值Ct值≥40。
此外，待检燕窝制品的真核生物18SrRNA基因实时PCR检测结果Ct值应小于30，否则重新提取DNA。
只有在满足以上两种情况下，判断待检燕窝制品是否含有燕窝成品，判断方法如下：
a.如待检燕窝制品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即阳性待检燕窝制品出现典型阳性扩增曲线，阴性待检燕窝制品盒空白对照无扩增)，则可判定该待检燕窝制品检测出燕窝成分；
b.如待检燕窝制品未出现扩增曲线，无Ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该待检燕窝制品未检出燕窝成分。
c.如待测待检燕窝制品Ct值在35-40之间，应重作实时荧光PCR扩增，再次扩增后的结果Ct值仍小于35，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该待检燕窝制品检出燕窝成分；再次扩增后的结果为无扩增曲线无Ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该待检燕窝制品未检出燕窝成分。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明具体实施1中真核生物18SrRNA基因的扩增图谱；
图3为本发明具体实施1中金丝燕12SrRNA基因的扩增图谱；
图4为本发明具体实施2中真核生物18SrRNA基因的扩增图谱；
图5为本发明具体实施2中金丝燕12SrRNA基因的扩增图谱；
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本发明。
参见图1、图2、图3、图4、图5，一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，包括如下步骤：步骤一，待检燕窝制品DNA的提取；步骤二，金丝燕成分实时荧光PCR扩增；首先，在PCR反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5-1μL，Taqman探针0.5-1μL，50ng/μL待检燕窝制品DNA1-2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；其次，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：a.94-95℃5min，1个循环，预变性；b.94-95℃10-20sec；60℃20-40sec，40个循环，PCR扩增；步骤三，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。本发明的主要原理是燕窝主要来自金丝燕的唾液，里面含有金丝燕的DNA，通过检测燕窝中的金丝燕12SrRNA基因来鉴别燕窝的真假。如果燕窝制品中能检出金丝燕特异性12SrRNA基因，则待检燕窝制品为真燕窝；如果未检出金丝燕特异性12SrRNA基因，说明待检燕窝制品为假冒燕窝。本发明特异性好、灵敏度高的特点，简单快速，整个检测过程只需要3～4小时。
步骤一中，待检燕窝制品DNA的提取可以采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。在步骤二与步骤三之间，进行DNA浓度的测定，将DNA浓度调整为50ng/μL，首先使用紫外分光光度计检测提取待检燕窝制品DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：C＝A*N*50；其中C—DNA浓度，单位为ng/μL；A—260nm处的吸光值；N—DNA稀释倍数；将DNA浓度稀释到50ng/μL。通过特异性扩增金丝燕的12SrRNA基因序列对燕窝进行鉴定，扩增的DNA片段大小为144bp。
步骤二中，扩增金丝燕的特异性12SrRNA序列的引物，序列如下：
上游引物:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’；
下游引物:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’；
TaqMan探针序列：5’-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3’，其中5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的浓度为10μmol/L。
本发明根据金丝燕的12SrRNA基因特异性序列设计一对组引物(上游引物SWT-F：5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’和下游引物SWT-R:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’)和一条Taqman探针(探针SWT-P序列为：5’-FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94～95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团，当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’→5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反应模板数量。
本发明对待检燕窝制品进行检测时，每个待检燕窝制品同时做两个平行。
步骤二中，对金丝燕成分实时荧光PCR扩增时，应设立三个对照：阳性对照(金丝燕基因组DNA)、阴性对照(非金丝燕基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)；并且，同时扩增真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因。步骤二中，同时检测真核生物18SrRNA基因以判断是否从待检燕窝制品中提取适宜进行实时荧光PCR的DNA或提取的DNA中是否存在PCR反应抑制因子；步骤二中，分别配置真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman探针。本发明涉及的真核生物18SrRNA基因引物和探针序列参考标准GB/T25165-2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》:
(1)上游引物18S-F：5’-CCTGAGAAACGGCTACCAC-3’；
(2)下游引物18S-R：5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’；
(3)TaqMan探针18S-P：5’-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-3’，其5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
步骤三，分析扩增结果时，应设置的各种对照实时PCR检测结果应全部符合以下情况，否则应重做实验：
a.阳性对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都出现扩增曲线，Ct值小于30；
b.阴性对照的真核生物18SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值小于30，金丝燕12SrRNA基因未出现扩增曲线，Ct值≥40；
c.空白对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都未出现扩增曲线，Ct值Ct值≥40。
此外，待检燕窝制品的真核生物18SrRNA基因实时PCR检测结果Ct值应小于30，否则重新提取DNA。
只有在满足以上两种情况下，判断待检燕窝制品是否含有燕窝成品，判断方法如下：
a.如待检燕窝制品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即阳性待检燕窝制品出现典型阳性扩增曲线，阴性待检燕窝制品盒空白对照无扩增)，则可判定该待检燕窝制品检测出燕窝成分；
b.如待检燕窝制品未出现扩增曲线，无Ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该待检燕窝制品未检出燕窝成分。
c.如待测待检燕窝制品Ct值在35-40之间，应重作实时荧光PCR扩增，再次扩增后的结果Ct值仍小于35，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该待检燕窝制品检出燕窝成分；再次扩增后的结果为无扩增曲线无Ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该待检燕窝制品未检出燕窝成分。
具体实施1：
待检燕窝制品为某品牌燕窝，购于大型超市
步骤一，DNA提取；
A.称取待检燕窝制品，粉碎后取0.3g，加至2ml离心管中，加入900μL预热的CTAB裂解缓冲液和40μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水域保温60min，加入5μLRNA酶溶液，37℃30min；
B.2000g离心5min，取上清于另一干净的2ml离心管中，加入等体积的酚，三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；
C.12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(24:1)，颠倒混匀；
D.12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
E.12000g离心10min，弃去上清液，用4℃预冷的70％乙醇500μL，涡旋清洗沉淀；
F.12000g离心10min，弃去上清液，倒置晒干后加100μLTE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。
步骤二，DNA浓度和纯度的测定
提取到DNA的A260/A280比值为1.84，DNA浓度为154ng/μL，稀释到50ng/μL。
步骤三，待检燕窝制品中金丝燕成分实时荧光PCR扩增；
A.配置真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因引物和探针：
a.真核生物18SrRNA基因
上游引物18S-F：5’-CCTGAGAAACGGCTACCAC-3’，浓度10μmol/L；
下游引物18S-R：5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’，浓度10μmol/L；
TaqMan探针18S-P：5’-FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA-3’，浓度10μmol/L。
b.金丝燕12SrRNA基因
上游引物SWT-F：5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’，浓度10μmol/L；
下游引物SWT-R：5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’，浓度10μmol/L；
Taqman探针SWT-P：5’-FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’，浓度10μmol/L。
B.在PCR反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，Taqman探针0.5μL，50ng/μL待测待检燕窝制品的DNA2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；
C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃2min，1个循环，预变性；
95℃15sec；60℃40sec，45个循环，PCR扩增。
(4)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果：参见图2和图3，
A.阳性对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值分别为15.45和16.15，满足要求；
B.阴性对照的真核生物18SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值为18.09(见图1)；金丝燕12SrRNA基因未出现扩增曲线，Ct值≥40，满足要求；
C.空白对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都未出现扩增曲线，Ct值Ct值≥40，满足要求；
D.待检燕窝制品的真核生物18SrRNA基因实时PCR检测结果出现扩增曲线，Ct值为17.75和16.93，满足要求；
E.待检燕窝制品的金丝燕12SrRNA基因实时PCR检测结果出现扩增曲线，Ct值15.25和15.10，据此可判定该待检燕窝制品检出燕窝成分。
具体实施2
待检燕窝制品为某品牌冰糖燕窝，购于大型超市
步骤一，DNA提取；
A.取待检燕窝制品(冰糖燕窝)5g至50mL离心管中，12000g离心10min，弃去上清，加入10mL预热的CTAB裂解缓冲液和40μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温45min；
B.12000g离心5min，取上清于另一干净的50ml离心管中，加入等体积的酚，三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；
C.12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(24:1)，颠倒混匀；
D.12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇，颠倒混匀；
E.4℃下12000g离心10min，弃去上清液，用4℃预冷的70％乙醇800μL，清洗沉淀；
F.12000g离心5min，弃去上清液，加入20μLRNA酶溶液，37℃温育30min；
G.加入600μL氯化钠溶液，65℃温浴10min；加入600μL的的三氯甲烷和异戊醇的混合液(24:1)，震荡混匀；12000g离心5min，取上清至干净的1.5ml离心管中，加入等体积预冷异丙醇，颠倒混匀；
H.4℃下12000g离心10min，弃去上清液，用4℃预冷的70％乙醇500μL，清洗沉淀；
I.12000g离心5min，小心弃去上清，用4℃预冷的70％乙醇重复洗一遍；
J.室温下挥发剩余液体；加入50μL的TE缓冲液溶解DNA，4℃保存备用。
步骤二，DNA浓度和纯度的测定；
提取到DNA的A260/A280比值为1.75，DNA浓度为63ng/μL，稀释到50ng/μL。
步骤三，待检燕窝制品中金丝燕成分实时荧光PCR扩增
A.配置真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因引物和探针：
a.真核生物18SrRNA基因
上游引物18S-F：5’-CCTGAGAAACGGCTACCAC-3’，浓度10μmol/L；
下游引物18S-R：5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’，浓度10μmol/L；
TaqMan探针18S-P：5’-FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA-3’，浓度10μmol/L。
b.金丝燕12SrRNA基因
上游引物SWT-F：5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’，浓度10μmol/L；
下游引物SWT-R：5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’，浓度10μmol/L；
Taqman探针SWT-P：5’-FAM-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-TAMRA-3’，浓度10μmol/L。
B.在PCR反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5μL，Taqman探针0.5μL，50ng/μL待测待检燕窝制品的DNA2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；
C.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
95℃2min，1个循环，预变性；
95℃15sec；60℃40sec，45个循环，PCR扩增。
(4)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果：参见图4和图5，
A.阳性对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值分别为16.83和17.67，满足要求；
B.阴性对照的真核生物18SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值为16.74；金丝燕12SrRNA基因未出现扩增曲线，Ct值≥40，满足要求；
C.空白对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都未出现扩增曲线，Ct值Ct值≥40，满足要求；
D.待检燕窝制品的真核生物18SrRNA基因实时PCR检测结果出现扩增曲线，Ct值为16.78和16.82，满足要求；
E.待检燕窝制品的金丝燕12SrRNA基因实时PCR检测结果出现扩增曲线，Ct值17.76和17.70，据此可判定该待检燕窝制品检出燕窝成分。
步骤二中混匀采用的装置可以是一震动装置，震动装置包括一壳体，壳体内设有一中空腔体，中空腔体的下方设有至少一个超声波发生器，超声波发生器的发射方向朝向中空腔体，壳体内还设有一搅拌装置。
搅拌装置连接一微型处理器系统，微型处理器系统连接一时钟模块，微型处理器系统还连接一超声波发生器。
壳体的下端部设有一腔室，腔室的下端面上设有超声波发生器，腔室的上端面固定连接中空腔体的下端面。腔室的侧壁上设有透气孔，透气孔均匀分布于腔室的侧壁上。本发明通过超声波发生器通过腔室实现超声波震动的传递，从而提高了对中空腔体下端面的震动均匀性。
步骤二中，混匀时，首先搅拌装置工作3分钟后，进行超声波发生器工作1分钟，最后搅拌装置与超声波发生器共同工作2分钟。通过搅拌装置与超声波发生器的结合，从而提高溶质的溶解度，提高待测溶液的测试精度。首先进行搅拌后，通过超声波发生器消除因搅拌而产生的气泡。
步骤一，DNA提取时，称取待检燕窝制品，粉碎后取0.3g，加至2ml试管中，加入900μL预热的CTAB裂解缓冲液和40μL蛋白酶K，采用震动装置混匀后，65℃水域保温60min，加入5μLRNA酶溶液，37℃30min。
步骤一中，混匀时，首先搅拌装置工作2分钟后，进行超声波发生器工作2分钟，最后搅拌装置与超声波发生器共同工作1分钟。通过搅拌装置与超声波发生器的结合，从而提高溶质的溶解度，提高待测溶液的测试精度。首先进行搅拌后，通过超声波发生器消除因搅拌而产生的气泡。
搅拌装置包括两个相互啮合的齿轮，齿轮包括双层，分别为内层与外层，内层的硬度大于外层的硬度。本发明通过两个相互啮合的齿轮进行联动，从而提高搅拌效果。齿轮同步转动的转速不小于3000转/分钟。从而保证搅拌效果。外层包覆在内层的外壁上。
震动装置包括一进料端、一出料端，进料端与两个所述齿轮的连接处的上端联通，出料端与所述两个齿轮的连接处的下端联通，出料端位于中空腔体的底部。
壳体的内壁上设有与齿轮相啮合的弧状突起。从而提高搅拌效果，消除壳体内的搅拌死角。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，待检燕窝制品DNA的提取；
步骤二，金丝燕成分实时荧光PCR扩增；
首先，在PCR反应管中加入2×PCRMasterMix12.5μL，上游引物和下游引物各0.5-1μL，Taqman探针0.5-1μL，50ng/μL待检燕窝制品DNA1-2μL，补充双蒸水至25μL，混匀；
其次，将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：
a.94-95℃5min，1个循环，预变性；
b.94-95℃10-20sec；60℃20-40sec，40个循环，PCR扩增；
步骤三，使用实时荧光PCR仪分析软件分析扩增结果。
2.根据权利要求1所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，通过特异性扩增金丝燕的12SrRNA基因序列对燕窝进行鉴定，扩增的DNA片段大小为144bp。
3.根据权利要求2所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，步骤二中，扩增金丝燕12SrRNA基因的上游引物、下游引物、TaqMan探针的序列如下：
上游引物序列:5’-GTCGCCAGTTCACCTCCCC-3’
下游引物序列:5’-ATCGRTTMTAGAACAGGCTCCTCTAG-3’；
TaqMan探针序列：
5’-CCYACCCGCTAACAAGACAGGTCAAGGTAT-3’，
其中5’端标记FAM报告荧光集团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，步骤二中，对金丝燕成分实时荧光PCR扩增时，应设立三个对照：阳性对照：金丝燕基因组DNA、阴性对照：非金丝燕基因组DNA、空白对照：不含DNA模板；
并且，同时扩增真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因。
5.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，步骤二中，分别配置真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因的上游引物、下游引物和Taqman探针。
6.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，步骤三，分析扩增结果时，应设置的各种对照实时PCR检测结果应全部符合以下情况，否则应重做实验：
a.阳性对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都出现扩增曲线，Ct值小于30；
b.阴性对照的真核生物18SrRNA基因出现扩增曲线，Ct值小于30，金丝燕12SrRNA基因未出现扩增曲线，Ct值≥40；
c.空白对照的真核生物18SrRNA基因和金丝燕12SrRNA基因都未出现扩增曲线，Ct值Ct值≥40。
7.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，待检燕窝制品的真核生物18SrRNA基因实时PCR检测结果Ct值应小于30，否则重新提取DNA。
8.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，判断待检燕窝制品是否含有燕窝成品，判断方法如下：
a.如待检燕窝制品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即阳性待检燕窝制品出现典型阳性扩增曲线，阴性待检燕窝制品盒空白对照无扩增)，则判定该待检燕窝制品检测出燕窝成分；
b.如待检燕窝制品未出现扩增曲线，无Ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则判定该待检燕窝制品未检出燕窝成分；
c.如待测待检燕窝制品Ct值在35-40之间，应重作实时荧光PCR扩增，再次扩增后的结果Ct值仍小于35，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该待检燕窝制品检出燕窝成分；再次扩增后的结果为无扩增曲线无Ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该待检燕窝制品未检出燕窝成分。
9.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，步骤一中，待检燕窝制品DNA的提取采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
10.根据权利要求4所述的一种燕窝制品实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，在步骤二与步骤三之间，进行DNA浓度的测定，将DNA浓度调整为50ng/μL，首先使用紫外分光光度计检测提取待检燕窝制品DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：
C＝A*N*50；
其中C—DNA浓度，单位为ng/μL；
A—260nm处的吸光值；
N—DNA稀释倍数；
将DNA浓度稀释到50ng/μL。
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