CN102776257B - 一种基于酶复合改性的大豆多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，在大豆多糖溶液中，边搅拌边加入谷氨酰胺转胺酶，进行糖蛋白交联反应，然后加热灭酶；经冷却，边搅拌边加入氯化钠或氯化钙和去酯化酶，进行去酯化反应，然后加入酸终止反应，加热灭酶；用乙醇沉淀干燥后得到改性大豆多糖。用本发明方法通过酶复合改性改变大豆多糖组分和结构，赋予大豆多糖较高的对蛋白的分散稳定特性，在乳酸清凉饮料的制备中起到较好的稳定效果。

Description

一种基于酶复合改性的大豆多糖及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种改性技术制备大豆多糖的方法，采用的改性技术是酶复合改性，用于稳定乳酸清凉饮料。

背景技术

随着我国居民的消费水平不断提高，人们消费饮料的观念正在从嗜好型饮料向保健型饮料转变，由于消费者对健康体魄和优美身材的追求，使得市场上各种低脂、脱脂、低蛋白酸奶深受欢迎，通过强化各种营养素（维生素、矿物质）和益生素而得到的高附加值酸奶更为深受广大消费者欢迎。因而开发研制酸性乳饮料的市场潜力很大，社会效益显著。乳酸清凉饮料是以脱脂奶粉为主要原料，通过发酵或不发酵，再添加其他配料调制而成的低蛋白含乳饮料，乳蛋白含量一般在0.1-0.3%；在PH值小于4.5的高酸环境下，含乳的基料粘度如水一样低。但是这类饮料最常见的质量问题即沉淀和分层问题，也就是如何解决蛋白质粒子稳定化的问题。开发这种新的功能性饮料，则能填补我国饮料市场上缺乏低蛋白饮料的空白，也因而受到广泛关注。

大豆多糖是从大豆皮和大豆子叶部分所得到的水溶性膳食纤维。在豆制品加工业中，每年都有大量的加工副产物豆渣被直接废弃或者被用作动物饲料，而很少有厂家回收利用。实际上，干豆渣中含有近35%的水溶性大豆多糖。水溶性大豆多糖不仅具有膳食纤维的减肥、通便、调节胃肠中微生物营养的平衡和类胆固醇的代谢以及抑制免疫血清中脂质的氧化的作用，还具有其他优越的食品功能特性，例如乳化及乳化稳定性、抗氧化性、抑菌性、抗黏结性及耐热、耐酸、耐盐的特性等等。基于以上特性，水溶性大豆多糖可以作为乳化剂、分散剂、稳定剂等。

大豆水溶性多糖作为优良的酸乳饮料蛋白稳定剂，不仅能够稳定蛋白颗粒，还因其膳食纤维的多功能性极大提高了酸乳饮料的附加营养价值，因而是一种越来越受到人们的青睐的新型食品添加剂。这些良好的功能性与大豆多糖的组成成分、结构和分子构成有很大的关系。研究表明大豆多糖是一种酸性杂多糖，结构与果胶类似，其含有总量近9%的结合蛋白（肽）和游离蛋白（肽），结合蛋白（肽）约3%和游离蛋白（肽）6%，随着离心分离自由的游离蛋白会被分离出去，连接于大豆多糖上的结合蛋白能够促进大豆多糖主链快速结合到酪蛋白表面，并能在酪蛋白表面形成厚层，提高大豆多糖侧链间的空间排斥力，在某种程度上，大豆多糖上连接的结合蛋白（肽）还能够提高其乳化能力。

另外，大豆多糖含有近20%的半乳糖醛酸的酸性多糖，其分子质量为5 000~1 000 000 u，由半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖醛酸、鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fuc）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Glc）等组成。其主链由聚半乳糖醛酸（GN）和聚鼠李糖半乳糖（RG）组成，在主链上结合有半乳聚糖侧链和阿拉伯糖侧链。其侧链在稳定酸性乳饮料时起着重要的作用。酸性基团缔合到酪蛋白表面上再通过中性糖侧链形成覆盖在蛋白质颗粒表面的厚层所产生的空间位阻来稳定蛋白颗粒。避免了酪蛋白在酸性条件下沉淀，以此稳定酪蛋白颗粒。目前的研究表明，大豆多糖在应用性及功能性上均优于果胶、瓜尔胶、阿拉伯胶等常用胶体。

大豆多糖链上的自由羧基沿着聚合链的分布情况及大豆多糖链上的结合蛋白含量决定其在酸性饮料中的稳定性，且某些半乳糖醛酸的残基会被甲基酯化，酯化发生在半乳糖醛酸残基聚合之后；而大豆多糖稳定酸乳中酪蛋白的能力与其链上自由羧基嵌段的结构和长度有关。自由羧基嵌段太长会使悬吊链太短或者无法产生，使多糖与酪蛋白结合物的空间排斥力减小，同样也会与酸乳饮料中的钙离子反应造成凝胶沉淀；自由羧基嵌段太短会导致多糖无法准确地结合到酪蛋白上。普通商用大豆多糖中，通常结合蛋白（肽）含量约2~3%，酯化程度在40~50%，根据研究发现，高稳定性的大豆多糖的结合蛋白（肽）在4~6%，酯化度通常在20~30%之间。

专利CN1927033研究了果胶酯酶、果胶反排除酶、聚半乳糖酶对大豆碎粒酵素处理形成大豆粉末和大豆浆液，该专利仅仅从解碎的角度使用了果胶酯酶，但并没有深入研究果胶酯酶对大豆浆液中的具体成分造成的影响；已有文献报道了用双酶法处理提取大豆多糖，探讨酶种类、双酶组合、酶解时间、pH、固液比等对提取率的影响以及大豆多糖对氧自由基的清除能力（宋慧，苗敬芝，董玉玮. 双酶法提取大豆多糖及其抗氧化性研究[J]．中国食品添加剂，2011,(5)：89—93.）；另有文献报道了果胶甲酯酶对大豆皮的脱脂影响，考察酶解温度、酶解时间、pH 和酶的加入量对果胶产品酯化度和果胶提取率的影响，提出酯化度对大豆多糖稳定性存在影响，但对于大豆多糖上蛋白质的作用未作研究（刘贺,郭晓飞,刘昊东等.大豆皮果胶酶法脱脂参数研究[J]．食品工业科技,2011,32(5)：273—464.)；另有文献报道了可溶性大豆多糖在功能性低蛋白饮料中的应用，在该研究中从感官和沉淀率对比了以可溶性大豆多糖，CMC、果胶、PGA 为乳化稳定剂，大豆多糖表现出最佳稳定效果的乳化剂（李小林，何莹.可溶性大豆多糖在功能性低蛋白饮料中的应用[J]．现代食品科技，2010,26(3)：303—305.)。目前人们对大豆多糖的提取工艺从不同的方面做了很多的研究，对大豆多糖的化学、物理及生物改性进行了一些研究，但是有关用于稳定乳酸清凉饮料的大豆多糖的作用机理并没有系统的研究，大豆多糖中组分和分子结构对其稳定性的影响也未见报道，因此如何提高大豆多糖在低蛋白饮料中的高稳定性一直是研发热点。本发明在对大豆多糖的现有研究基础上，提出一种对大豆多糖的组分和分子结构进行改性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，所制得的大豆多糖是一种在乳酸清凉饮料中具高稳定性的水溶性大豆多糖，可用于制备稳定的乳酸清凉饮料。本发明中“酶复合改性”方法，是指在大豆多糖溶液中，依次加入谷氨酰胺转胺酶和去酯化酶，分别对大豆多糖进行酶化学反应。

本发明的目的主要通过以下技术方案实现：一种基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，主要包括以下步骤：

在大豆多糖溶液中，首先边搅拌边加入谷氨酰胺转胺酶，在适宜的温度和pH条件下进行糖蛋白交联反应，一段时间后加热灭酶；然后冷却至时宜温度，边搅拌边加入氯化钠或氯化钙和去酯化酶，在适宜的温度和pH条件下对大豆多糖进行去酯化处理，一段时间后加入酸终止反应，加热灭酶；用乙醇沉淀后干燥得到酶改性大豆多糖。

其中，所述大豆多糖溶液的浓度为1%~10%。

其中，所述谷氨酰胺转胺酶的酶活单位为50~200U/g，加酶量0.02~0.1%，酶解pH为5.0~7.0。酶解温度40~70℃，反应时间30~120min。反应结束后加热至100~150℃灭酶。

其中，所述氯化钠或氯化钙的浓度为0.1~0.15mol/L。

其中，所述去酯化酶为黑曲霉果胶甲酯酶，柑橘果胶甲酯酶，大豆果胶甲酯酶，优选黑曲霉果胶甲酯酶。去酯化反应的加酶量10~20mL,酶解pH为5.2~7.0，酶解温度40~70℃，反应时间30~120min。

其中，所述方法中用0.01mol/L氢氧化钠维持反应过程pH，根据添加量监控反应程度。

其中，通过加入0.01mol/L盐酸调节至pH4终止所述去酯化反应，加热至80~120℃灭酶。

本发明方法中，通过采用乙醇沉淀后经干燥得到沉淀物，制备得到改性大豆多糖。

本发明创新之处在于，本发明首次提出对大豆多糖进行酶法复合改性，制备具高稳定性的水溶性大豆多糖。通过向大豆多糖溶液中添加谷氨酰胺转胺酶和去酯化酶，提高结合蛋白（肽）的含量及降低大豆多糖的酯化度，使酸性多糖半乳糖链上的结合蛋白（肽）含量达到5%左右，同时自由羧基半乳糖醛酸上的自由羧基成嵌段均匀分布。使大豆多糖能够准确而稳固地结合在酪蛋白表面，并增加其厚层，提高酪蛋白颗粒的空间排斥力。用本发明方法通过酶复合改性改变大豆多糖组分和结构，赋予大豆多糖较高的对蛋白的分散稳定特性，在乳酸清凉饮料的制备中起到较好的稳定效果。

采用本发明酶法改性得到的大豆多糖的结合蛋白（肽）的含量在4~6%，酯化度通常在20~30%之间，对乳酸清凉饮料的稳定性效果好。

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1

本实施例以市面上普通商用大豆多糖为原料，首先称取10g大豆多糖，然后溶解到490mL蒸馏水中，搅拌均匀，边搅拌边加入100U/g谷氨酰胺转胺酶0.25g(加酶量0.05%)维持反应pH为6，反应温度55℃，反应时间60min。酶反应结束后，加热至100℃灭酶。

冷却至30℃，将0~4℃的乙醇1:1.5添加到多糖溶液中混合均匀后，5000rpm、10min两次离心分离得到沉淀。经真空冷冻干燥（例如：-50℃冷凝，<10pa条件下-10℃一次升华，30℃二次升华），得到改性大豆多糖。测定样品蛋白含量、酯化度和酸乳中沉淀率。

实施例2

本实施例以市面上普通商用大豆多糖为原料，首先称取10g大豆多糖，然后溶解到490mL蒸馏水中，搅拌均匀，边搅拌边添加氯化钠4.39g（0. 15mol/L），和黑曲霉果胶酯酶16mL（酶活单位为0.01U/mL），维持反应pH为5.8，反应温度60℃，反应时间60min。在反应过程中不断加入0.01mol/L氢氧化钠维持反应pH。酶反应结束后，用0.01mol/L盐酸调节pH4终止反应，加热至100℃灭酶。

冷却至30℃，将0~4℃的乙醇1:1.5添加到多糖溶液中混合均匀后，5000rpm、10min两次离心分离得到沉淀。经真空冷冻干燥（例如：-50℃冷凝，<10pa条件下-10℃一次升华，30℃二次升华），得到改性大豆多糖。测定样品蛋白含量、酯化度和酸乳中沉淀率。

实施例3

本实施例以市面上普通商用大豆多糖为原料，首先称取10g大豆多糖，然后溶解到490mL蒸馏水中，搅拌均匀，边搅拌边100U/g谷氨酰胺转胺酶0.25g(0.05%),维持反应pH为6，反应温度55℃，反应时间60min。酶反应结束后，加热至100℃灭酶。

其中，适用的谷氨酰胺转胺酶的酶活单位为50~200U/g，加酶量0.02~0.1%，酶解pH为5.0~7.0，酶解温度40~70℃，反应时间30~120min。进一步优选地，谷氨酰胺转胺酶的加酶量0.04~0.06%，酶解pH为5.5~6.5。酶解温度50~60℃。在本发明制备方法中，随着蛋白含量提高，所制备的改性大豆多糖酯化度含量也升高，导致最终沉淀率升高，乳酸清凉饮料的稳定性下降。经实验获得本发明优选糖蛋白酶促交联反应条件下，所制备的大豆多糖的蛋白含量4.0~4.5%，酯化度67~77%，沉淀率1.9~2.3%。 

冷却至60℃，边搅拌边添加氯化钠4.39g（浓度为0. 15mol/L），和去酯化酶黑曲霉果胶酯酶16mL（酶活单位为0.01U/mL），维持反应pH为5.8，反应温度60℃，反应时间60min。在反应过程中不断加入0.01mol/L氢氧化钠维持反应pH。酶反应结束后，用0.01mol/L盐酸调节pH4终止反应，加热至100℃灭酶。

其中，适用的去酯化酶的加酶量10~20ml，酶活单位0.01U/mL，酶解pH为5.2~7.0，酶解温度40~70℃，反应时间30~120min。进一步优选地，去酯化酶的加酶量12~16mL，酶解pH为5.4~6.2，酶解温度50~60℃。在优选去酯化反应的条件下，所制备的大豆多糖的蛋白含量2.8~3.3%，酯化度29%~32%，沉淀率0.7~1%。在经过本发明实验研究摸索得到的优选条件处理下，产物改性大豆多糖的酯化度明显减低，但是该酶对蛋白含量的影响不大，最终沉淀率主要受到酯化度影响。

冷却至30℃，将0~4℃的乙醇1:1.5添加到多糖溶液中混合均匀后，5000rpm、10min两次离心分离得到沉淀。经真空冷冻干燥（例如：-50℃冷凝，<10pa条件下-10℃一次升华，30℃二次升华），得到改性大豆多糖。测定样品蛋白含量、酯化度和酸乳中沉淀率。

参照国标蛋白含量测定方法，对市售普通大豆多糖和以上实施例1~3制备得到的水溶性大豆多糖蛋的白含量进行测定。

蛋白含量的检测过程为：称取大豆多糖粉末0.20g～2.00g固体试样,移入干燥的消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20ml浓硫酸，置于消化炉上小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全消失后，加大火力，并保持管内液体内微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续0.5h～1h。取下放冷待蒸馏用。

在消化管托盘上换上已消化冷却好的样品，锥形瓶托盘上换上装硼酸（浓度2%，15~20mL）的250ml锥形瓶，调整托盘高度并使氨气回流玻璃嘴浸泡在硼酸液面以下。然后先打开加碱按钮，加到自己所需要的碱的用量后，关闭加碱按钮。然后再打开蒸馏按钮。蒸馏即将完成时，将容量瓶下移，使氨气回流玻璃嘴离开液面，用蒸馏水冲洗玻璃嘴外壁，继续蒸馏半分钟后，关闭蒸馏按钮，取下锥形瓶待滴定用。蒸馏完成。

用0.05mol/LHCL滴定接收瓶内的溶液，滴定至（暗）灰色时为止，记下消耗HCL的毫升数，按下列公式计算蛋白含量：

X=[(V1-V2)* N *0.014*F*100]/m

X——样品中蛋白质的含量，%； 

V₁——样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； 

V₂——试剂空白消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml； 　　

N——硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度； 　　

0.014——1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数； 　　

m——样品的质量(体积)，g(ml)； 　　

F——蛋白质系数，按16%计算乘以6.25即为蛋白质。

将市售普通大豆多糖和以上实施例1~3中的水溶性大豆多糖酯化度测定参照果胶酯化度国家标准测定。

酯化度的检测过程为：精确称取5.00g样品，用少量盐酸与异丙醇混合试剂浸湿后，搅拌10分钟，用混合试剂将样品移至砂芯漏斗中，用6份混合试剂冲洗，再用60%异丙醇洗至滤液不含氯离子为止，移至105℃烘箱中干燥1小时，冷却后称量。

称取1/10冷却后的干燥样品，移入250mL锥形瓶中，用2mL酒精浸湿，加入100mL经煮沸后冷却并除去二氧化碳的水，不断搅动使样品完全溶解。加入5滴1%的酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠滴定，记录消耗氢氧化钠溶液的毫升数(V1),即为样品的原始滴定度。向样液中继续加入20mL0.5mol/L氢氧化钠溶液，经强烈震动后，静置15分钟，加入20mL0.5mol/L盐酸溶液，不断的摇动使溶液中粉红色消失，然后再加入3滴酚酞指示剂，继续用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定至样液显微红色。记录所消耗氢氧化钠的毫升数（V2)，即为样品的皂化滴定度。按下列公式计算酯化度：

酯化度（%）= [V2/(V1+V2)]*100%。

将市售普通大豆多糖和以上实施例1~3中得到的水溶性大豆多糖按照以下配方制备乳酸清凉饮料。配方如下：

糖酸液配制：准确称取16g精制白砂糖和0.35g柠檬酸充分溶解到13g 70℃的蒸馏水中，使其完全溶解，然后在磁力搅拌器上2400rpm搅拌10min。冷却至室温待用。

乳液配制：准确称取2.5g脱脂乳粉和0.5g的普通大豆多糖和以上实施例1~3中水溶性大豆多糖溶解至15g60℃的蒸馏水中，完全溶解后在在磁力搅拌器上2400rpm搅10min，然后在20Mpa的压力下均质，冷却至室温待用。

在磁力搅拌器上一边搅拌糖酸液同时缓慢加入乳液，然后将153g蒸馏水缓慢加入混合液中，2400rpm计时10min。然后将混合液在20mpa压力下均质。90℃、15min灭菌后制备得到乳酸清凉饮料。

沉淀率即根据其值的大小判定稳定性的优劣，沉淀率越高，稳定性越差；测定方法即吸取灭菌后的乳酸清凉饮料10ml于离心管中，3000rmp 15min离心弃去上清液乳酸清凉饮料。

按照以下公式计算沉淀率：沉淀率% = [沉淀物质（g）/10 mL 饮料重量（g）]×100%。

实例1~3所制得的大豆多糖和市面上普通商用大豆多糖的蛋白含量、酯化度及沉淀率测定结果，如下表1所示：

表1

	普通多糖	实施例1	实施例2	实施例3
					蛋白含量%	2.8%	4.26%	3.1%	4.43%
酯化度%	65%	70%	31%	25%
					沉淀率%	1.45%	2.01%	0.89%	0.24%

从以上表1所示实验结果可以看出，以上实施例所得到的经酶连续改性处理的样品的结合蛋白含量、酯化度和沉淀率明显优于市售普通大豆多糖样品，具体的，本发明制备的改性大豆多糖其蛋白含量提高、酯化度降低、沉淀率降低。在实施例中经谷氨酰胺转胺酶处理过的大豆多糖中的结合蛋白含量均高于未经处理的。

实施例1中，由于谷氨酰胺转胺酶可以缓慢促进多糖酯化，所以经添加了谷氨酰胺转胺酶却未添加果胶酯酶制备得到的大豆多糖的酯化度有稍微的增高，沉淀率较大。

实施例2中，经果胶酯酶处理的酯化度明显低于未如此处理的大豆多糖，而且沉淀率也降低。

实施例3中谷氨酰胺转胺酶及果胶酯酶的连续处理的样品具有显著提高的蛋白含量、降低的酯化度以及显著降低的沉淀率，由此可见本发明中经酶连续改性的明显优于未经改性处理的和由谷氨酰胺转胺酶或者果胶酯酶分别单独处理制备的大豆多糖，因此采用本发明方法进行酶连续改性处理得到的改性大豆多糖的品质更优。

    本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (5)

1.一种基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，其特征在于，在大豆多糖溶液中，边搅拌边加入谷氨酰胺转胺酶，进行糖蛋白交联反应，然后加热灭酶；冷却后，边搅拌边加入氯化钠或氯化钙和去酯化酶，进行去酯化反应，然后加入酸终止反应，加热灭酶；用乙醇沉淀后干燥得到改性大豆多糖；

其中，所述谷氨酰胺转胺酶的酶活单位为50～200U/g，加酶量0.02～0.1%，酶解pH为5.0～7.0，酶解温度40～70℃，反应时间30～120min；

所述去酯化酶为黑曲霉果胶甲酯酶；所述去酯化酶的加酶量10～20ml，酶活单位0.01U/mL，酶解pH为5.2～7.0，酶解温度40～70℃，反应时间30～120min。

2.根据权利要求1所述的基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，其特征在于，所述大豆多糖溶液的浓度为1%～10%。

3.根据权利要求1所述的基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，其特征在于，所述谷氨酰胺转胺酶酶促反应后加热至100～150℃灭酶，所述去酯化反应后加热至80～120℃灭酶。

4.根据权利要求1所述的基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，其特征在于，所述氯化钠或氯化钙的浓度为0.1～0.15mol/L。

5.根据权利要求1所述的基于酶复合改性的大豆多糖制备方法，其特征在于，所述方法中用0.01mol/L氢氧化钠维持反应过程pH，根据添加量监控反应程度；反应结束后，用0.01mol/l盐酸调节pH4终止所述的去酯化反应。