CN110367517B - 一种酪蛋白-大豆多糖交联产物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质改性技术领域,具体公开了一种酪蛋白‑大豆多糖交联产物及其制备方法与应用,本发明用转谷氨酰胺酶催化大豆多糖与酪蛋白,发生美拉德反应,制备得到酪蛋白‑大豆多糖交联产物,大豆多糖具有较好的生理活性,通过加入转谷氨酰胺酶使得美拉德反应能在温和的条件下快速形成交联产物,从而使得酪蛋白带上大豆多糖,改善酪蛋白两亲性,提高酪蛋白的水包油乳液的物理稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质改性领域,特别是涉及一种酪蛋白-大豆多糖交联产物及其制备方法与应用。
背景技术
我国是世界上加工大豆的主要国家之一,大豆种皮中含有大量的果胶类多糖。可溶性大豆多糖(Soluble Soybean Polysaccharides,SSPS)就是一种从大豆种皮或者豆渣中提取的水溶性果胶类多糖。其分子结构是以鼠李糖半乳糖醛酸和高聚半乳糖酸为主链、半乳聚糖和阿拉伯糖为侧链形成的近似球状体结构。可溶性大豆多糖是一种酸性多糖,其水溶液的粘度较低,受温度、盐类影响较小。在乳制品中,可溶性大豆多糖主要依靠多糖侧链形成的空间位阻作用使蛋白质稳定,是一种低粘度的酸乳饮料稳定剂。与乳制品中其他常用的以增加粘度来提高稳定性的稳定剂相比,以可溶性大豆多糖为稳定剂的酸乳饮料口感清爽、风味自然、粘度较低。但单独使用可溶性大豆多糖为稳定剂时,体系中有沉淀产生,饮料的稳定性欠佳。
酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质,是重要食品原料,由4种成分组成:αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白,其比例大约为3∶0.8∶3∶0.8。酪蛋白在水溶液中的溶解性与pH有关,在等电点(pH4.6)附近溶解度最小。酪蛋白在水溶液中的行为与两亲性的嵌段聚合物相似,具有疏水和亲水相互作用,它能吸附至油水界面形成稳定的乳状液,并能有效减少柔性结构、聚集状态、pH、离子强度(持别是钙离子)、温度等因素对乳状液的影响。但在很多情况下,由于酪蛋白的溶解性与其他性质不兼容,使得酪蛋白乳液不能保持长期稳定,导致酪蛋白在食品领域的发展受到了限制。
谷氨酰胺转胺酶(transglutaminase,TGase)是一种能交联蛋白质分子的酶。该酶能催化肽键中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基与伯胺化合物(酰基受体)之间进行酰基转移,当肽链中的赖氨酸残基的ε氨基为氨基受体时,以蛋白质分子内和分子间形成ε-(γ-谷氨酸)赖氨酸异肽键使蛋白质发生交联;当无伯胺存在时,水充当酰基受体,谷氨酰胺残基发生水解,进行脱酰胺。经谷氨酰胺转胺酶改性后的乳蛋白乳化性、热稳定性有明显的提高,其质量和贮存性能均有所改善。
公布号为CN 102776257A的中国发明专利《一种基于酶复合改性的大豆多糖及其制备方法》中提到,在大豆多糖溶液中,边搅拌边加入谷氨酰胺转胺酶,进行糖蛋白交联反应,通过酶复合改性改变大豆多糖组分和结构,能够赋予大豆多糖较高的对蛋白的分散稳定特性,使大豆多糖能够准确而稳固地结合在酪蛋白表面,并增加其厚层,提高酪蛋白颗粒的空间排斥力。但是该专利仅仅是通过谷氨酰胺转胺酶对大豆多糖进行改性,并没有深入研究大豆多糖和酪蛋白的交联产物的相关性能及其在乳液中的应用。公布号为CN105663039B的中国发明专利《负载疏水药物和营养物的酪蛋白/多糖复合乳液及其制备方法》中公开了利用酪蛋白和多糖复合物作为乳化剂和稳定剂来制备负载疏水药物和营养物的水包油乳液体系,但是其并没有提及采用酶催化制备。
目前也未见其他酶催化制备酪蛋白-大豆多糖交联产物及其相关性能分析的研究报道。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种酪蛋白-大豆多糖交联产物及其制备方法与应用,用于解决现有技术中以酪蛋白和大豆多糖为稳定剂的乳液物理稳定性不高的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种酪蛋白-大豆多糖交联产物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将酪蛋白溶液和大豆多糖溶液混合均匀后,加入转谷氨酰胺酶,进行美拉德反应,然后加热使酶失活;冷却至室温后,用酸调节溶液pH至4.6,离心收集沉淀,沉淀干燥后得到酪蛋白-大豆多糖交联产物。其中,用酸调节溶液pH至4.6,可以使溶液中生成的交联产物沉淀下来,以便于除去未复合的大豆多糖。
可选地,所述酪蛋白溶液中的酪蛋白浓度为50-100g/L,所述大豆多糖溶液的浓度为50-100g/L。优选地,所述酪蛋白溶液中的酪蛋白浓度与所述大豆多糖溶液的浓度相等。
可选地,所述酪蛋白溶液的制备方法为:将酪蛋白加入去离子水中,用碱调节溶液pH至6.0;室温下搅拌8-12h后,检查pH值并再次调节至6.0,得到酪蛋白溶液。可选地,所述大豆多糖溶液的制备方法为:将大豆多糖溶解在去离子水中,然后将溶液pH调节至6.0,得到大豆多糖溶液。转谷氨酰胺酶的最适酶活在6.0-5.0之间,考虑酪蛋白的等电点,以及大豆多糖是酸性糖,故酪蛋白溶液和大豆多糖溶液的pH为6.0时有利于美拉德反应的进行。
可选地,所述酪蛋白溶液与大豆多糖溶液的体积比例为(2-1)∶(1-3),优选为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。
可选地,所述转谷氨酰胺酶的添加量为2-25U/g,优选为2、5、10、15、20、25U/g。
可选地,将酪蛋白溶液与大豆多糖溶液按照2∶1、1∶1、1∶2、1∶3(v/v)的体积比例混合后,然后用碱调节pH至6.0,室温下搅拌均匀;再加入转谷氨酰胺酶,在37-50℃下搅拌3h及以上,然后加热使酶失活;冷却至室温后,用酸调节溶液pH至4.6,离心,弃去上清液,再用pH=4.6的水清洗沉淀,再次离心弃去上清液,此水洗过程重复2-3次,最后将沉淀pH调至中性6.7-7.0,然后冷冻干燥得到酪蛋白-大豆多糖交联产物。
本发明还提供由上述制备方法得到的酪蛋白-大豆多糖交联产物。
本发明还提供由上述酪蛋白-大豆多糖交联产物的应用,所述酪蛋白-大豆多糖交联产物在乳液中作为稳定剂使用,可以提高乳液的稳定性。
本发明还提供由上述酪蛋白-大豆多糖交联产物制成的酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液。
可选地,所述酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液的pH值为3-7。
本发明还提供上述酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液在由离子组成的食品中的用途。
如上所述,本发明的酪蛋白-大豆多糖交联产物及其制备方法与应用,具有以下有益效果:本发明主要用转谷氨酰胺酶催化大豆多糖与酪蛋白,发生美拉德反应,制备得到酪蛋白-大豆多糖交联产物,所得的酪蛋白-大豆多糖交联产物在大豆油水包油乳液中作为稳定剂使用,可以提高乳液的物理稳定性。
本发明中,水溶性大豆多糖具有较好的生理活性,通过加入转谷氨酰胺酶使得美拉德反应能在较温和的条件下快速形成交联产物,从而使得酪蛋白带上大豆多糖,一方面酪蛋白交联大豆多糖后,多糖分子在复杂的空间结构上保护酪蛋白,使得蛋白分子的形貌和二级结构的改变,从而使得蛋白聚集减少,另一方面由于引入了羟基,从而增加了蛋白质分子中的亲水基团,促进蛋白水合作用,使得蛋白溶解性增加,改善了蛋白的两亲性,提高酪蛋白的水包油乳液的物理稳定性。
同时,由于酪蛋白-大豆多糖的交联使得静电斥力和空间位阻的增强,有效提高了乳液的耐盐性,解决了酪蛋白对盐敏感的问题,因此,本发明的制备方法制得酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液可以应用在具有不同离子组成的食品中。
附图说明
图1显示为本发明实施例中不同比例的酪蛋白和大豆多糖对反应接枝度的影响结果图。
图2显示为本发明实施例中不同比例的酪蛋白和大豆多糖对反应褐变指数和中间产物含量的影响结果图。
图3显示为本发明实施例中不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物的溶解性的变化结果图。
图4显示为本发明实施例中不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物的乳化性能的变化结果图。
图5显示为本发明实施例中不同酶量的酪蛋白和大豆多糖对反应接枝度的影响结果图。
图6显示为本发明实施例中不同酶量对反应褐变指数和中间产物含量的影响结果图。
图7显示为本发明实施例中不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物的溶解性变化结果图。
图8显示为本发明实施例中不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物的乳化活性和乳化稳定性的变化结果图。
图9显示为本发明实施例中不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物红外光谱图。
图10显示为本发明实施例中不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物内源荧光光谱图。
图11显示为本发明实施例中酪蛋白及其不同比例交联产物的SDS-PAGE电泳图。
图12显示为本发明实施例中不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物红外光谱图。
图13显示为本发明实施例中不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物内源荧光光谱图。
图14显示为本发明实施例中酪蛋白与大豆多糖不同酶量交联产物的SDS-PAGE电泳图。
图15-1、图15-2、图15-3和图15-4分别显示为本发明实施例中酪蛋白、大豆多糖、酪蛋白和大豆多糖混合物、酪蛋白-大豆多糖交联产物的扫描电镜图。
图16-1和图16-2分别显示为本发明实施例中不同pH下乳液的粒径和ζ电位的变化结果图。
图17-1和图17-2分别显示为本发明实施例中不同温度下乳液的粒径和ζ电位的变化结果图。
图18-1和图18-2分别显示为本发明实施例中不同Na+浓度下乳液的粒径和ζ电位的变化结果图。
图19-1和图19-2分别显示为本发明实施例中不同Ca2+浓度下乳液的粒径和ζ电位的变化结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明提供一种酪蛋白-大豆多糖交联产物及其制备方法与应用。
目前尚未见酶催化制备酪蛋白-大豆多糖交联产物及其相关性能分析的研究报道。本发明主要用转谷氨酰胺酶(商品酶)催化大豆多糖与酪蛋白,发生美拉德反应,制备得到酪蛋白-大豆多交联产物,大豆多糖具有较好的生理活性,通过加入转谷氨酰胺酶使得美拉德反应能在温和的条件下快速形成交联产物,从而使得酪蛋白带上大豆多糖,改善蛋白两亲性,提高酪蛋白的水包油乳液的稳定性;并探究了酪蛋白-大豆多糖交联产物的相关性能及由其制备的乳液的稳定性在不同pH、温度和离子强度(Na+、Ca2+)下的变化情况,探讨酪蛋白-大豆多糖交联产物的应用范围,为酪蛋白-大豆多糖交联产物在食品领域中的应用提供一定借鉴。
本发明的具体实施过程如下:
1材料与方法
1.1材料与试剂
酪蛋白(CAS#9000-71-9,纯度为High Purity Grade),合肥博美生物科技有限责任公司;大豆多糖(纯度之80%),合肥博美生物科技有限责任公司;大豆油,益海嘉里食品营销有限公司;超纯水,YSL-RO-T10L/H超纯水系统(Ashland公司)制备;转谷酰胺酶(酶活100U/g蛋白质),北京索莱宝科技有限公司。
1.2仪器与设备
DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司;T18ULTRA-TURRAX型高速均质机,德国IKA公司;ZEN3690马尔文激光粒度分析仪,英国马尔文仪器公司;FD-1A-50型冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司;M-110EH-30型高压微射流,加拿大Microfluidics公司;T6新世纪型紫外分光分度计,北京谱析通用仪器有限责任公司;Spectrun100型傅里叶红外光谱仪,美国PerkinElmer公司;DYCZ-24DN型电泳仪,北京六一生物科技有限公司;Zetasizer NS90型激光粒径仪,英国Malvern公司;PhenomPro10102型扫描电镜,荷兰Phenom World公司。
1.3试验方法
1.3.1交联产物的制备
(1)酪蛋白和大豆多糖溶液的制备:将酪蛋白加入去离子水中,用1MNaOH将溶液调节至pH6.0;室温下搅拌过夜后,检查pH值并再次调节至pH 6.0,原液中的最终蛋白质浓度为50g/L;将大豆多糖溶解在去离子水中,然后将溶液pH调节至6.0,制备浓度为50g/L的大豆多糖溶液。加入终浓度为0.02%的叠氮化钠以抑制微生物生长。
(2)酪蛋白-大豆多糖交联产物的制备:将酪蛋白溶液(50g/L,pH=6)与大豆多糖溶液(50g/L,pH=6)按照一定的体积比例(体积比例为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)混合,然后用2MNaOH调节pH至6.0,室温下磁力搅拌30min,加入转谷酰胺酶(其添加量为2、5、10、15、20、25U/g蛋白质),于40℃下反应3h;反应结束后,立即在85℃下保存10-15min以使酶失活,冷却至室温后,用1mol/l HCl调节溶液pH至4.6(酪蛋白等电点为4.6),8000g离心15min,弃去上清液,再用pH=4.6的水清洗沉淀,再次离心弃去上清液,此水洗过程重复2-3次,最后将沉淀pH调至中性6.7-7.0,然后冷冻干燥得到酪蛋白-大豆多糖交联产物,并保存在干燥箱中。
1.3.2接枝度的测定
采用OPA法测定接枝度。
(1)OPA试剂配制:称取80mg的OPA溶解于2mL甲醇中,再加入5mL20%(W/W)的SDS溶液、50mL0.1mol/L的四硼酸钠溶液及200μL的β-巯基乙醇,最后用超纯水定容到100mL,得到OPA试剂。
(2)赖氨酸标准曲线的制作:
称取赖氨酸50mg,用超纯水定容至100mL,配成浓度为500μg/mL的溶液。在此基础上分别取6、4、2、1、0.5、0mL稀释至10mL,稀释成以下对应浓度:300、200、100、50、25、0μg/mL。再按照样品处理步骤加入OPA试剂,混合均匀后在35℃水浴2min,在340nm下测吸光值,以OPA试剂为空白对照。
(y=0.0035x-0.0095R2=0.9963)(X-赖氨酸浓度μg/ml Y-吸光度)
(3)接枝度测定:测定时,在200μL 5mg/mL的样品溶液里加入4mL OPA试剂,混合均匀,在35℃水浴2min,用T6新世纪紫外可见分光分度计在340mn下测吸光值。以OPA试剂为空白对照。根据赖氨酸标准曲线计算样品中游离氨基含量(Y=0.0035X-0.0095 R2=0.9963)(X-赖氨酸浓度μg/ml Y-吸光度),并用下式计算接枝度:
GD(%)=(C0-C1)×100/C0
式中:C0为反应前混合体系中游离氨基酸的含量,μg/mL;C1为反应后糖反应体系中游离氨基酸含量μg/mL。
1.3.3褐变指数和中间产物含量的测定
取酪蛋白糖基化反应产物溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,并使其充分溶解,配置浓度为5mg/ml的样品溶液。通过测定不同酪蛋白和大豆多糖的比例下的糖基化产物在420nm处吸光度,以吸光度的大小反映其反应的褐变指数(BI)。
取交联产物溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液中,配置浓度为5mg/ml的样品溶液,用0.1%SDS溶液稀释一倍,在并294nm下测定吸光值,用此吸光值表示中间产物的含量(intermediate content)。其中,A294的数值越大,表示反应生成的中间产物含量越多。
1.3.4溶解性的测定
准确称取一定量的交联产物溶解在pH7.4的磷酸盐缓冲液中,在室温中搅拌1h,配置浓度为10mg/ml的蛋白溶液,10000r/min离心10min,取上层清液,用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白含量,以纯的酪蛋白作为对比组。溶解度表示为上清中蛋白的含量比上总蛋白的含量。
1.3.5乳化性的测定
取交联产物配置成浓度为0.1%的溶液,于室温加入25%的大豆油,在10000rpm高速均质1min后,分别在0min和10min时取样50μL,用0.1%SDS溶液稀释100倍,震荡均匀后,以0.1%SDS溶液为空白对照,于500nm处测定吸光度A。测定乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)的公式为:
式中:V-稀释倍数
C-样品浓度(g/mL)
Φ-比色池光径(cm)
θ-乳状液中油相体积分数(0.25)
A0-0min吸光值
A10-10min吸光值
1.3.6傅里叶红外光谱(FTIR)分析
采用溴化钾压片法,取一定量的交联产物和光谱级溴化钾,其中两者质量比为1∶100,迅速混合均匀后研磨压片,在傅里叶红外扫描仪下进行检测。扫描区间为400-4000cm-1,扫描次数32次,分辨率4cm-1。
1.3.7内源荧光光谱测定
将样品分散于磷酸盐缓冲液(0.01mol/L pH=7.0)中,配置浓度为1mg/ml的溶液,采用F4500型荧光分光光度计在激发波长280nm条件下得到300-500nm之间的发射光谱,狭缝5nm。
1.3.9聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)
(1)样品的处理
SDS-PAGE是根据Laemmli(Laemmli,1970)的方法进行的。配置3mg/mL的酪蛋白溶液,与5X上样缓冲液混合,5000rmp离心1min,沸水浴煮沸2min后取上清进样。
(2)凝胶的配置
分离胶和浓缩胶的浓度分别为12%和5%,配置方法如表1所示。
表1 凝胶配置方法
5%浓缩胶(6mL) | 添加量(mL) | 12%分离胶(10mL) | 添加量(mL) |
超纯水 | 4.130 | 超纯水 | 3.300 |
30%Acr-Bis | 1.000 | 30%Acr-Bis | 4.000 |
1.0M Tris-HCL | 0.750 | 1.5M Tris-HCL | 2.500 |
10%SDS | 0.060 | 10%SDS | 0.100 |
10%APS | 0.060 | 10%APS | 0.100 |
TEMED | 0.006 | TEMED | 0.004 |
(3)电泳
取10μL上清液加到凝胶电泳槽中,采用垂直电泳槽,开始在80V的恒压下电泳至溴酚蓝跑到浓缩胶和分离胶的分界处,之后再在120V恒压的条件下进行电泳,直至溴酚蓝指示带到达距电泳槽底部1cm处停止电泳。
(4)蛋白质染色与脱色
小心分离电泳凝胶。首先进行蛋白质震荡染色2小时,再利用脱色液进行漂洗,直至背景清晰。
(4)结果分析
利用凝胶成像系统进行照胶或者利用相机拍照。
1.3.10扫描电镜
将酪蛋白-大豆多糖交联产物干粉样品直接安装于双面碳素磁带上的圆柱形铝片,然后在样品上涂上一层金。用扫描电子显微镜对样品进行了表面形貌分析,加速电压为10kV。
1.3.11乳液稳定性分析
1.3.11.1乳液制备
在磷酸盐缓冲液(10mM,pH=7.0)中分散1%(w/v)酪蛋白交联产物,添加0.02%叠氮化钠,防止微生物生长,并在室温下搅拌至完全溶解。将10%的玉米油与90%的乳化剂溶液在高速搅拌器20000rpm,3min中共混制得粗乳液。这种粗乳剂随后通过七次高压阀均化器,压力为50MPA.,得到最终稳定的细乳液。用相同剂量的酪蛋白稳定乳剂作为对照。
1.3.11.2粒径电位测定
将稳定乳液稀释1000倍后,使用ZetasizerNS90型激光粒径仪测定纳米乳液的粒径和电位,测定温度为25℃,平衡时间为120s。
1.3.11.3乳液对环境应力的物理稳定性
(1)为评价乳液对pH变化的稳定性,采用1MHCl或NaOH将乳剂调至不同的pH值(3.0~7.0),室温静置24h。记录乳液粒径和ζ电位的变化。
(2)评价乳液对热处理的稳定性,将乳液样品(10mL,pH=7.0)转移到玻璃试管中,然后在不同温度(25℃、60℃、80℃、90℃)下水浴孵化30min。孵育后,乳剂在室温下立即冷却。记录乳液粒径和ζ电位的变化。
(3)评价乳液对离子胁迫的稳定性,将10mL,pH=7的乳液调节到不同的盐浓度,其中Na+浓度为0、200、600和1000mmol/L,Ca2+浓度为0、5、10、20mmol/L,在室温下静置24h。记录乳液粒径和ζ电位的变化。
1.4数据处理
每个样品各指标平行测定三次,样品平行测定两次,结果以平均±标准差表示。数据用统计软件SSPS 18.0进行统计分析(p<0.05时,组间差异显著)。
2结果与分析
2.1酪蛋白与大豆多糖美拉德反应
2.1.1不同比例的酪蛋白和大豆多糖的美拉德反应
2.1.1.1接枝度的测定
利用0PA法测定反应体系前后酪蛋白自由氨基的变化来表示反映进行的程度。
图1显示为不同比例的酪蛋白和大豆多糖对反应接枝度的影响结果图。
由图1可知,当大豆多糖添加量逐渐降增高时,接枝度由17.904%增大到了20.719%,且在比例为1∶1时接枝度达到最高。这是因为在含有一定酪蛋白的情况下,多糖含量的增加,大量氨基被糖基化,从而接枝度上升。但随着多糖量的继续增加,接枝度呈下降趋势,当比例为1∶3时接枝度仅有17.055%。这可能是过多的多糖会和酪蛋白相互作用,影响酪蛋白胶束结构,抑制胶束解离或当多糖比例过高时,会产生空间位阻,使得反应不易发生。
2.1.1.2褐变指数和中间产物的测定
美拉德反应分为初级、中级和高级三个阶段,随着反应的进行通常伴随着褐变现象,这主要是因为在美拉德反应的高级阶段会产生一类统称为类黑精的含氮的棕色聚合物。这类物质能在420nm处吸收紫外光。反应体系的颜色会随着美拉德反应的持续进行变得越来越深,因此蛋白质的糖基化反应程度可以通过反应体系的颜色的变化反映出来。一般情况下测定反应体系在420nm下的吸光度值就可以体现颜色变化,从而得知美拉德反应体系的褐变程度,它是检测美拉德反应速率的方法之一,褐变增加通常表明美拉德反应加快。
同时,在反应中级阶段,糖类会裂解生成酮类、醛类等没有颜色的小分子物质,统称为Schiff-碱。这些物质能在紫外分光光度计的294nm处吸收紫外光。因此一般会把294nm处的吸光度值(A294nm)作为评价美拉德反应中间产物含量多少的指标之一。一般地,吸光度值越大,反应越快,中间产物越多。
故在美拉德反应过程中,A420和A294是监测反应褐色化程度的特征吸收值。图2显示为不同比例的酪蛋白和大豆多糖对反应褐变指数和中间产物含量的影响结果图。
由图2可以看出,当比例为1∶1时,产物的褐变指数和中间产物含量最大,在420nm和294nm处的吸光度分别为0.543和0.915,表明生成的褐色交联产物和中间产物增多。随着糖的比例的增加到一定程度,褐变指数和中间产物的含量开始下降。当糖的添加比例最高(1∶3)时,褐变指数和中间产物的量的吸光度分别为0.534和0.890,这是由于多余的糖造成空间位阻,使得反应进程减慢。
2.1.1.3溶解度测定
溶解度是蛋白质变性和聚集的最有效指标。
图3显示为不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物的溶解性的变化结果图。
由图3可知,在比例为1∶1的时候,产物的溶解性最高,为63.861%,较单纯的酪蛋白溶解度增加了16.656%。综合看来,本结果与褐变指数、中间产物的结果一致。其主要原理在于:在酪蛋白的糖基化反应中,一方面,酪蛋白交联大豆多糖后,多糖分子在复杂的空间结构上保护酪蛋白,使得蛋白分子的聚集减少;另一方面,糖的引入使蛋白质分子增加了许多羟基,羟基是亲水基团,促进蛋白水合作用,使得蛋白溶解性增加。
2.1.1.4乳化性能
图4显示为不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物的乳化性能的变化结果图。
由图4可知,随着大豆多糖添加量的增加,产物的乳化活性和乳化稳定性都呈先增后减的趋势。单纯的酪蛋白的乳化活性为115.518m2/g,乳化稳定性为16.908min,并在酪蛋白:大豆多糖为1∶2时,活性最大,为138.433m2/g;酪蛋白:大豆多糖为1∶1时,乳化稳定性最大,为33.785min。
这是因为在油水界面,糖的接入,增加了空间位阻,产生对蛋白表面的保护,利于形成亲-疏水平衡,使得交联产物吸附在油水界面形成紧密的保护层,从而阻止了油滴的聚集。但当大豆多糖继续增加时,交联产物的乳化活性和稳定性都有一定程度的下降,其中当酪蛋白:大豆多糖比例为1∶3的时候,乳化活性下降至124.201m2/g,乳化稳定性为19.934min。这一方面可能是因为多余的多糖增加了体系发生絮凝的倾向;另一方面是因为多糖分子的链长太长或多糖结合在蛋白分子上数量过多时,因为交联产物过于亲水或者是空间阻碍,让交联产物在油-水界面的吸附能力下降,导致其作为乳化剂的功能减弱。
2.1.2不同酶量下的酪蛋白和大豆多糖的美拉德反应
2.1.2.1接枝度的测定
图5显示为不同酶量的酪蛋白和大豆多糖对反应接枝度的影响结果图。在美拉德反应中,蛋白分子的氨基酸侧链自由氨基和糖分子的羰基之间交联,通过测定反应前后酪蛋白自由氨基的变化即可反映出反应的进行程度。反应加入的TG酶量不同,糖基化反应的程度也不同。由图5可知,反应的接枝度随着TG酶量的增加而增加;当酶量为25U/g时,反应的接枝度达到最大为27.204%。
2.1.2.2褐变指数和中间产物的测定
美拉德反应的高级阶段会产生一类叫为类黑精的棕色物质,这些物质在紫外分光分度计的420nm处有吸光值。同时在反应中级阶段,糖类会裂解生成Schiff-碱,这是一类酮类、醛类等没有颜色的小分子物质。这些物质能在紫外分光光度计的294nm处吸收紫外光。故在美拉德反应过程中,A420和A294是监测反应褐色化程度的特征吸收值。
图6反映了不同酶量对反应褐变指数和中间产物含量的影响。由图6可以看出,当添加的酶量为20U/g时,产物的褐变指数和中间产物含量最大,其中褐变指数为0.560,中间产物的含量为0.928。同时根据接枝度的结果可知,接枝度是随着添加酶量的增加而增加的,而当酶量高于一定值后褐变指数和中间产物含量会降低,可能是过量的TG酶促进酪蛋白进一步自身交联,使得酪蛋白的自由氨基降低,从而产生这样的结果。
2.1.2.3溶解度测定
图7反映了不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物的溶解性变化。
由图7可以看出,随着反应中酶量的增加,蛋白的溶解度呈先增后减的趋势;在酶量为5U/g的时候,产物的溶解度最高为67.048%,较单纯的酪蛋白溶解度提升了19.843%。
因为在糖基化反应中,一方面酪蛋白交联大豆多糖后,多糖分子在复杂的空间结构上保护酪蛋白,使得蛋白分子的聚集减少。另一方面由于引入了羟基,从而也增加了蛋白质分子中的亲水基团,从而促进蛋白水合作用,使得溶解度升高。随着酶量的进一步增加,溶解性会有降低。当添加酶量为25U/g时,溶解度下降至53.804%。由于蛋白质的溶解性可以被理解为蛋白-溶剂(亲水性)与蛋白-蛋白(疏水性)的相互平衡,因此,酪蛋白经过过量的TG酶进一步酶解作用后,使得酪蛋白自身交联,并且使得疏水基团暴露过多,从而让蛋白和蛋白自身相互作用增加,产生聚集和沉淀作用,导致其溶解度下降。
2.1.2.4乳化性能的测定
图8反映了不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物的乳化活性和乳化稳定性的变化。
由图8可以看出,随着反应中酶量的增加,乳化活性呈逐渐增加的趋势,乳化稳定性呈先增后减的趋势,并在酶量25U/g时活性最大,为134.334m2/g,在酶量5U/g时,乳化稳定性最大,为37.605min,较单纯的酪蛋白乳化活性增加了18.816m2/g,乳化稳定性增加了20.697min。这是因为在油水界面,糖的接入,增加了空间位阻,产生对蛋白表面的保护,利于形成亲-疏水平衡,使得交联产物吸附在油水界面形成紧密的保护层,从而阻止了油滴的聚集。但当酶量继续增加时,交联产物的乳化稳定性有一定程度的下降,较最优的乳化稳定性下降了9.822min;这可能是由于酶解物虽然有良好的乳化活性,但是它的短肽不能形成紧密的聚合物保护膜,不能有效的防止油滴聚集以及相的分离。
2.2美拉德交联产物结构性能分析
2.2.1不同比例的酪蛋白和大豆多糖的美拉德反应
2.2.1.1傅里叶红外光谱分析
酪蛋白糖基化反应过程中蛋白质结构的变化,可以依靠红外光谱法检测得到,同时也可进一步说明交联产物的生成。
图9显示为不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物红外光谱图,糖基化产物的红外光谱中出现糖类物质的特征吸收峰。酪蛋白分别在1648cm-1、1531cm-1、1237cm-1处有C=0键伸缩振动(酰胺I带),C-N键伸缩(酰胺II带),N-H键振动(酰胺III),基酸残基变化可引起蛋白质结构的变化。波数3600-3000cm-1吸收峰是糖分子内或分子间-OH的伸缩振动所引起,同时相较于SSPS和MIX来说,所有交联产物的红外图谱在3600-3000cm-1处吸收峰变宽,说明酪蛋白和大豆多糖有发生交联。1070em-1左右糖分子中C-O-C官能团的伸缩振动的糖环存在的典型特征。在图9中,我们发现交联产物在1077cm-1处有强烈的吸收峰,但是CAS在此处无吸收峰,这说明美拉德改性引入了大豆多糖,导致酪蛋白侧链产生振动。811cm-1和922cm-1处的吸收峰,前者在交联产物中消失;后者在交联产物中吸收强度增大,充分说明了蛋白质的二级结构发生改变,间接说明大豆多糖接枝到了酪蛋白上。
2.2.1.2内源荧光光谱
内源荧光光谱可以表征蛋白的结构的变化,在糖基化反应的过程中可以产生具有荧光特性的化合物,因此一般会用荧光强度来反映糖基化的程度。
图10显示为不同比例的酪蛋白和大豆多糖交联产物内源荧光光谱图。
一般蛋白质在270-340nm处有吸收,其中酪氨酸和色氨酸的荧光峰为在303nm和348nm处。由图10可以看出,反应的初期,随着美拉德反应中糖量的增加,产物的荧光强度不断降低。其中,当比例为1∶1时,荧光强度最低,且荧光强度的变化趋势与接枝度、褐变指数和中间产物含量相同。这是由于多糖链的接枝对蛋白造成了屏蔽作用,从而使得荧光强度变低。该结果也可以对酪蛋白和大豆多糖之间美拉德反应的SDS-PAGE分析结果进行支持。
2.2.1.3聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE凝胶电泳通常用来反映美拉德反应中多糖-蛋白质共聚物的形成,同时可以说明共聚物的分子量的变化。
图11显示为酪蛋白及其不同比例交联产物的SDS-PAGE电泳图,图中Lane1-10分别为标准蛋白marker、酪蛋白、酪蛋白与大豆多糖交联产物(比例为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、酪蛋白与大豆多糖单纯混合物(比例为2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)。
酪蛋白不是单一的蛋白质,含有αs、β、κ、γ四种类型,其中αs-酪蛋白、β-酪蛋白分别占50%、35%,分子量分别在27KD、24KD,并且在图11中观察到酪蛋白谱的特征带(Lane2)。当蛋白-多糖共聚物形成时,在蛋白染色的SDS-PAGE电泳的浓缩胶中显示染色带或者在分离胶中显示拖尾条带。
由图11中可以看出,所有经过TG酶处理的酪蛋白-大豆多糖交联产物均在浓缩胶和分离胶的交界处有染色条带,酪蛋白经过糖基化交联修饰后,酪蛋白-大豆多糖有大分子聚合物形成,该大分子聚合物不能进入分离胶(Lane3-6),美拉德反应后的交联产物由于分离量大而无法进入分离胶,停留在分离、浓缩胶的分界处。而单纯混合的酪蛋白和大豆多糖在染色结果中可以看到,在浓缩胶和分离胶的交界处未出现大分子产物,只出现酪蛋白的特征亚基条带(Lane7-10)。
2.2.2不同酶量下的酪蛋白和大豆多糖的美拉德反应
2.2.2.1傅里叶红外光谱
酪蛋白糖基化反应过程中蛋白质结构的变化,可以依靠红外光谱法检测得到,同时也可进一步说明交联产物的生成。
图12显示为不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物红外光谱图。
图12显示了糖基化产物的红外光谱,并出现糖类物质的特征吸收峰。酪蛋白分别在1659cm-1、1529cm-1、1247cm-1处有C=0键伸缩振动(酰胺I带),C-N键伸缩(酰胺II带),N-H键振动(酰胺III),氨基酸残基变化可引起蛋白质结构的变化。波数3600-3000cm-1吸收峰是糖分子内或分子间-OH的伸缩振动所引起,同时相较于SSPS和MIX来说,所有交联产物的红外图谱在3600-3000cm-1处吸收峰变宽,说明酪蛋白和大豆多糖有发生交联。1070cm-1左右糖分子中C-O-C官能团的伸缩振动的糖环存在的典型特征。在谱图中,我们发现交联产物在1072cm-1处有强烈的吸收峰,但是CAS在此处无吸收峰,这说明美拉德改性引入了大豆多糖,导致酪蛋白侧链产生振动。875cm-1和918cm-1处的吸收峰,前者在交联产物中消失;后者在交联产物中吸收强度增大,充分说明了蛋白质的二级结构发生改变,间接说明大豆多糖接枝到了酪蛋白上。
2.2.2.2内源荧光光谱
图13显示为不同酶量处理的酪蛋白和大豆多糖交联产物内源荧光光谱图。
通常,在蛋白质分子中,只有三种氨基酸残基,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸会产生荧光性,其中相对于苯丙氨酸和酪氨酸来讲,色氨酸残基荧光量子产率较高,所以在荧光光谱中,主要由色氨酸残基产生荧光占。同时在糖基化后,蛋白质荧光强度会下降与蛋白质三级结构改变有关。根据这个原理内源荧光光谱的测定可以用来准确描述蛋白质结构的改变以及氨基酸的损失。
如图13所示,随着反应中酶量的增加,荧光强度呈先降低后增加的趋势。可以看到当酶量小于10U/g时,荧光强度是呈降低趋势的。这可能是由于当酶量较少时,多糖链接枝在酪蛋白上,从而对蛋白产生了屏蔽作用,且酶同时无法进一步催化酪蛋白,因而荧光强度降低。当酶量高于10U/g后,荧光强度有略微的升高,这是由于过量的酶可以进一步催化酪蛋白进行自身的酰基转移的反应,导致色氨酸进一步的暴露出来,使得荧光强度变高。同时,从图13中可知,酪蛋白-大豆多糖交联产物的最大发射波长(λmax)都有微小的红移,说明色氨酸残基的相对位置发生了移动,表明蛋白质三级结构发生了变化,进而产生荧光强度的变化;同时,红移现象也说明氨基酸亲水性增大,交联产物的溶解性变大。
2.2.2.3聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)
图14显示为酪蛋白与大豆多糖不同酶量交联产物的SDS-PAGE电泳图,图中Lane1-9分别为标准蛋白marker、酪蛋白与大豆多糖不同酶量反应下的交联产物(比例1∶1情况下,酶量为2U/g、5U/g、10U/g、15U/g、20U/g、25U/g)、酪蛋白、酪蛋白与大豆多糖单纯混合物(比例1∶1)。
SDS-PAGE凝胶电泳通常用来反映美拉德反应中多糖-蛋白质共聚物的形成。当多糖-蛋白共聚物形成时,在蛋白染色的SDS-PAGE电泳的浓缩胶中显示染色带后者在分离胶中显示拖尾条带。
由图14可以看出,所有经过TG酶处理的酪蛋白-大豆多糖交联物均在浓缩胶和分离胶的交界处有染色条带。酪蛋白经过糖基化交联后,酪蛋白-大豆多糖有大分子聚合物形成,该大分子聚合物不能进入分离胶(泳道2-7)。并且当酶量升高时,浓缩胶底部的染色条带变得更加清晰,表明接枝程度得到提高。单纯酪蛋白以及混合的酪蛋白和大豆多糖在染色结果中可以看到,在浓缩胶和分离胶的交界处未出现大分子产物,只出现酪蛋白的特征亚基条带(泳道8、9)。
2.2.3酪蛋白-大豆多糖交联产物的扫描电镜
图15-1、图15-2、图15-3和图15-4分别显示为酪蛋白、大豆多糖、酪蛋白和大豆多糖混合物、酪蛋白-大豆多糖交联产物的扫描电镜图,左图放大倍数为300倍,右图为左图的局部图,放大倍数为2000倍。
从上述几个图可以看出,光滑球状结构(图15-1)和不规则多角片层形(图15-2)主要表现在酪蛋白和大豆多糖中,且由图15-1的局部图所示,由于其凹陷的表面结构,酪蛋白质倾向于在水性模型系统中聚集,导致溶解度降低。对于酪蛋白和大豆多糖的混合物(图15-3),结构多呈现出球状和多角形的共存,且有众多多层蜂窝状的片层结构。交联产物如图15-4及其图15-4的放大图所示,交联产物的表面结构变得比单纯的酪蛋白更松散和更多孔,这是一种非均匀的混合网络结构,一方面,它表明酪蛋白与大豆多糖分子牢固结合,导致形成不均匀和累积的结构,这可以用大豆多糖在酪蛋白表面的紧密附着来解释,另一方面,该结构有利于提高美拉德反应的效率,这种表面形态可以促进共轭物的水的相互作用,从而增加酪蛋白的溶解度。
2.3酪蛋白-大豆多糖美拉德反应产物的水包油乳液稳定性
2.3.1 pH值对乳液物理稳定性的影响
本发明研究了酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液的耐pH值(pH3-7),并与酪蛋白进行了比较,结果如图16-1和16-2所示。
图16-1和16-2显示为不同pH下酪蛋白乳液和酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液的粒径和ζ电位的变化结果图。
从16-1中可以看出,单独的酪蛋白不能对pH提供足够的乳液稳定性,特别是在酸性条件下。在pH为4的酪蛋白稳定乳液中,出现了透明层相分离。但在那些由酪蛋白-大豆多糖交联产物稳定乳液中,都未出现层相分离。这一点得到了颗粒尺寸分析的进一步支持,在这些分析中,pH近等电点处,酪蛋白稳定乳液的粒径比酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液大得多。用酪蛋白-大豆多糖共轭法制备的乳液保持良好的小粒径,而不受pH的影响,表明乳液耐pH性的提高是由于酪蛋白与大豆多糖共价键的存在所致,酪蛋白和大豆多糖的结合可以建立更好的两亲性平衡,具有较高的乳化性能,可能是由于未折叠的蛋白质-蛋白质相互作用和结合多糖的聚集受到抑制。
为了了解乳化液稳定性的来源,测量了油滴的电荷随pH值的变化。由图16-2可以看出,在酪蛋白稳定乳液中,在等电点以上,电荷为负。在pH值为4时,酪蛋白稳定的乳化液液滴的静电斥力较强,不能保持良好的物理稳定性,说明酪蛋白的功能性较差。当pH值低于6时,酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液的液滴电荷增加,这归因于大豆多糖上的去质子化羧酸基团(COO-),它作为缓冲液来补偿pH下降时H+的增加。酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液在较低pH(3-4)下制备的乳液稳定性的提高,可能是由于液滴间存在更大的空间位阻,抵消了范德华力的吸引作用,从而防止混凝。
2.3.2热加工对乳液物理稳定性的影响
通过测定粒径和ζ-电位,研究了热处理(25℃、60℃、80℃和90℃)对酪蛋白和酪蛋白-大豆蛋白交联产物在pH7.0条件下制备的乳液稳定性的影响,结果如图17-1和17-2所示。
从图17-1可以看出,不同温度(25~90℃)处理下,酪蛋白纳米乳液的粒径无显著变化,且由图17-1中的乳液图片可以看到酪蛋白乳液并没有层相分离,这表明仅通过酪蛋白稳定的纳米乳液具有良好的热稳定性,这可能是因为纳米乳液中的液滴之间的强静电排斥,避免了高温下液滴表面上蛋白质分子间的相互作用。交联产物的纳米乳液在经过高温处理后,粒径有些微增大,但不至于层相分离,仍然是稳定均匀的,这可能是由于加热过程中部分蛋白质变性而从乳滴中解吸出来。
从图17-2可以看出,交联产物的稳定乳液的净ζ-电位远高于单纯酪蛋白乳液。因为交联产物可以在pH 7下阻断电离的胺基团,其将阳离子氨基转化为阴离子残基。蛋白质分子周围的电荷以及较厚的交联物层的增加将促进液滴之间的静电和空间排斥,导致热处理时乳液稳定性的改善。
2.3.3离子强度对乳液物理稳定性的影响
乳液的递送系统会广泛用于具有不同离子组成的食品中,因此,离子对乳液稳定性的影响十分重要的。本发明主要研究了NaCl和CaCl2对乳化性能的影响,具体研究了不同盐浓度(0、200、600和1000mMNaCl)(0、5、10、20mM CaCl2)对酪蛋白-大豆蛋白交联产物在pH7.0下稳定的乳剂粒径和ζ-电位的影响,结果如图18-18-2、19-1和19-2所示。
与酪蛋白结合后,未做任何处理的交联产物的乳液的液滴尺寸增加。这可能是由于具有高结合亲和力和表面活性的蛋白质可以在水-油界面处锚定更多大豆多糖分子。在形成共价缀合物后,随着Cas与侧链连接,平均回转半径将增加。
从图18-1和18-2可以看出,在NaCl存在下,酪蛋白纳米乳液和酪蛋白-大豆多糖交联产物纳米乳液都未体现出层相分离,乳液相对稳定,这一点可以用粒径佐证。当Na+浓度大于600mM时,ζ-电位绝对值降低,交联产物的电位趋势较酪蛋白的平缓。在且Na+浓度从200-1000mM时,酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液粒径没有显著性差异,乳液稳定,粒径较小。
从图19-1和19-2可以看出,在CaCl2存在的情况下,酪蛋白纳米乳液在Ca2+浓度为10-20mM时,乳液出现层相分离,这一点从粒径上可以佐证。相反的是,酪蛋白-大豆多糖交联产物的纳米乳液,相对稳定,未出现层相分离现象,粒径没有显著性差异。和加入Na+一样,交联产物的纳米乳液ζ-电位变化较酪蛋白乳液的平缓。这些结果表明酪蛋白-大豆多糖的交联使得静电斥力和空间位阻的增强,有效地提高了乳液的耐盐性。在这种情况下,静电斥力是稳定乳液的主导力量,它是通过盐的加入来筛选的,这种盐增加了液滴之间的范德华尔吸引的相互作用。
添加盐对乳液稳定性的影响,通常包括两种方式:首先,静电筛选可能导致多糖/蛋白质分子之间分子内静电排斥的增加,最终有助于分子链的扩展;其次,分子间静电排斥可能会减少,从而导致液滴聚集。一方面,酪蛋白对盐敏感,这表明一些蛋白质会从液滴表面解吸,最终导致液滴聚集。从另一方面来看,酪蛋白-大豆多糖交联产物显示出更好的稳定性可归因于多糖的厚吸附层,这将增加空间排斥并降低不同液滴之间的范德华吸引力。二价阳离子(Ca2+)显著影响蛋白质的乳化性质,这可能归因于Ca2+在油-水界面上诱导更严重的蛋白质聚集。
综上所述,本发明通过用转谷氨酰胺酶在较温和条件下催化大豆多糖与酪蛋白,发生美拉德反应,制备得到酪蛋白-大豆多糖交联产物,采用上述方法采用不同比例的酪蛋白和大豆多糖及不同酶量制备了一系列不同的酪蛋白-大豆多糖交联产物,并测定了他们的相关性能,通过与单纯的酪蛋白相比较,确定了酪蛋白和大豆多糖的最佳比例和酶量的最佳使用范围。同时发现,相较于单纯的酪蛋白乳液,酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液受pH、温度、离子强度等环境应力变化的影响更小,物理稳定性更高。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种酪蛋白-大豆多糖交联产物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将酪蛋白溶液和大豆多糖溶液按照2:1、1:1、1:2或1:3的体积比例混合后,然后用碱调节pH至6.0,室温下搅拌均匀;再加入转谷氨酰胺酶,在37-50℃下搅拌3h及以上,进行美拉德反应,然后加热使酶失活;冷却至室温后,用酸调节溶液pH至4.6,离心,弃去上清液,再用pH=4.6的水清洗沉淀,再次离心弃去上清液,此水洗过程重复2-3次,最后将沉淀pH调至中性6.7-7.0,然后冷冻干燥得到酪蛋白-大豆多糖交联产物;
所述酪蛋白溶液的制备方法为:将酪蛋白加入去离子水中,用碱调节溶液pH至6.0;室温下搅拌8-12h后,检查pH值并再次调节至6.0,得到酪蛋白浓度为50-100g/L的酪蛋白溶液;
所述大豆多糖溶液的制备方法为:将大豆多糖溶解在去离子水中,然后将溶液pH调节至6.0,得到浓度为50-100g/L的大豆多糖溶液;
所述酪蛋白溶液与大豆多糖溶液的体积比例为2:1、1:1、1:2或1:3,所述转谷氨酰胺酶的添加量为2-25U/g。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述转谷氨酰胺酶的添加量为2、5、10、15、20或25U/g。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的制备方法制得的酪蛋白-大豆多糖交联产物。
4.根据权利要求3所述的酪蛋白-大豆多糖交联产物在乳液中作为稳定剂的用途。
5.一种由权利要求3所述的酪蛋白-大豆多糖交联产物制成的酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液,其特征在于:所述酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液的pH值为3-7。
6.根据权利要求5述的酪蛋白-大豆多糖交联产物乳液在由离子组成的食品中的用途。
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Families Citing this family (4)
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---|---|---|---|---|
CN112971110A (zh) * | 2021-04-14 | 2021-06-18 | 吉林大学 | 一种糖基化酪蛋白天然大分子乳化剂的制备方法 |
CN114128886A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-03-04 | 许昌学院 | 一种提高玉米肽对姜黄素荷载率的方法 |
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CN115251362B (zh) * | 2022-08-03 | 2023-06-09 | 南京工业大学 | 一种玉米蛋白-大豆多糖接枝偶联物及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012135254A (ja) * | 2010-12-27 | 2012-07-19 | Miyoshi Oil & Fat Co Ltd | ケーキ呈味用水中油型乳化物及びケーキ |
CN102776257A (zh) * | 2012-07-13 | 2012-11-14 | 华东师范大学 | 一种基于酶复合改性的大豆多糖及其制备方法 |
CN105663039A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-06-15 | 复旦大学 | 负载疏水药物和营养物的酪蛋白/多糖复合乳液及其制备方法 |
CN108976305A (zh) * | 2017-05-31 | 2018-12-11 | 宋鸣宇 | 一种可溶性酰胺化大豆多糖及其制备方法 |
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2019
- 2019-08-26 CN CN201910793333.7A patent/CN110367517B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2012135254A (ja) * | 2010-12-27 | 2012-07-19 | Miyoshi Oil & Fat Co Ltd | ケーキ呈味用水中油型乳化物及びケーキ |
CN102776257A (zh) * | 2012-07-13 | 2012-11-14 | 华东师范大学 | 一种基于酶复合改性的大豆多糖及其制备方法 |
CN105663039A (zh) * | 2015-12-31 | 2016-06-15 | 复旦大学 | 负载疏水药物和营养物的酪蛋白/多糖复合乳液及其制备方法 |
CN108976305A (zh) * | 2017-05-31 | 2018-12-11 | 宋鸣宇 | 一种可溶性酰胺化大豆多糖及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
大豆多糖对乳清分离蛋白―乳状液稳定性与流变特性的影响;王旭,等;《食品工业科技》;20171231;第38卷(第19期);第1-6页 * |
糖基化交联反应对酪蛋白胶凝和乳化性质的影响;宋春丽,等;《中国油脂》;20171231;第42卷(第02期);第98-101段 * |
糖基化酪蛋白乳液的流变性质及稳定性研究;宋春丽,等;《中国油脂》;20160920;第41卷(第09期);第28-30页 * |
酪蛋白的转谷氨酰胺酶酶促糖基化交联条件及产物性质;姜淑娟,等;《中国乳品工业》;20110725;第39卷(第07期);第25-28页 * |
Also Published As
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CN110367517A (zh) | 2019-10-25 |
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