CN107058495A - 探针法qPCR检测熊胆胶囊中熊源性成分的检测方法 - Google Patents

探针法qPCR检测熊胆胶囊中熊源性成分的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种探针法qPCR检测熊胆胶囊中熊源性成分的方法，包括黑熊引物：5’‑CTGACTGCTGCCACCATCTTT‑3’/5’‑CAGTTCCTGCACCTGCTTCTACTATAG‑3’；探针：5’‑(FAM)TGTTGCTTCTAGCTTCT(MGB)‑3’。棕熊引物：5’‑TGGTTGCTGCCACCATCTT‑3’/5’‑CCCTGCACCTGCTTCTACCA‑3’；探针：5’‑(VIC)TACTGCTTCTGGCCTCC(MGB)‑3’。本发明特异性好、灵敏度高、效率高，可以实现准确、快捷地鉴定。

Description

探针法qPCR检测熊胆胶囊中熊源性成分的检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于MGB探针的qPCR检测熊胆胶囊中熊源性成分的检测方法，涉及分子生物学领域。本发明检测方法特异性好、灵敏度高、重复性好。
背景技术
亚洲传统医学认为，熊胆汁有清热解毒、平肝明目、杀虫止血的功效。黑熊胆和棕熊胆是制作熊胆胶囊制品的主要原材料。在巨大的经济利益刺激下，许多不法商贩用其他动物源性的胆来冒充熊胆。所以，迫切需要一种高效准确的检测方法。
传统的熊胆胶囊制品分子检测手段，首先提取熊胆胶囊制品中的DNA，再利用引物扩增目的片段，最后通过测序比对的方法来鉴定熊胆胶囊的真伪。但是由于熊胆胶囊制品中DNA降解和片段化较为严重，很难扩增出能够满足测序分析的长序列，同时当待测样品为掺假样品时，也很难有效的鉴定。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定性定量分析的方法。该方法通过荧光信号的分析，对PCR进程进行实时检测。探针法是qPCR中的一种常见方法，在反应体系中加入化学修饰的寡聚核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，无法检测到荧光信号。而当PCR扩增时，Taq DNA酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。MGB探针是在传统Taqman水解探针基础上的改进，通过在探针的3’端加入MGB基团，从而提高探针的退火温度，缩短探针的长度，提高探针的特异性和灵敏度。
本发明建立了一种对于熊胆胶囊制品的实时荧光定量PCR检测方法，利用MGB探针，能够高效、准确和更快速的检测熊胆胶囊制品中是否含有黑熊和棕熊源性的成分，还可以对熊胆胶囊制品DNA提取液中的熊源性成分进行定量分析。同时能对常用于在熊胆胶囊中掺假的牛、猪源性成分进行分析鉴定。COI基因是目前国内外广泛认可的DNA条码，本发明针对COI基因设计引物和MGB探针。
发明内容
本发明的第一个目的是设计针对黑熊、棕熊以及常见掺伪物牛和猪的引物和探针。
本发明的第二个目的是为了克服现有分子生物学检测技术的不足之处，建立一种使用方便、快捷、准确的熊胆胶囊中熊源性成分的检测方法。
本发明的第三个目的是利用以上的引物探针和构建的检测方法，对熊胆胶囊制品进行定性定量检测。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
1、DNA的提取体系
样品的DNA提取参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，取半个熊胆胶囊内容物、20mg棕熊、黑熊、猪和牛等肌肉组织，放置于2ml离心管中，加入350μl PBS和0.9μlRNase A，用剪刀温和的剪碎组织30s。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶K，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管至于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，空管离心一分钟。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Tris-HCl洗脱液100μl洗脱制备管中DNA，-20℃冷冻备用。
2、引物和探针的设计
选取Genbank上已发表的黑熊(EF667005)、棕熊(AP012593)、牛(KU891849)和猪(KT279758)的线粒体COI序列，利用Blast进行比对后，选择物种特异的DNA序列，利用ABIprimer express 3.0设计引物与MGB探针，Primer 6.0分析引物二级结构，将所设计的引物和探针利用Blast再次进行比对分析，确保引物与探针的特异性。
引物探针设计结果：
3、本发明中单重qPCR检测方法的建立
在Taq-HS Probe qPCR Premix的基础上，建立20μl反应体系，其中上下游引物和MGB探针的量从0.3μl到1.5μl，以0.1μl为梯度递加。反应体系中加入模板2μl其余用水补足。根据荧光定量PCR的结果，选择最大的荧光增量和最好的曲线走势作为判定标准，选择引物和探针的最适量。
最优反应体系：
PCR反应程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
判图原则：Ct值小于等于30并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于35判为阴性；Ct值介于30～35之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值小于等于30并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
4、本发明中单重qPCR特异性实验
利用四种单重引物和探针，分别加入棕熊、黑熊、牛、猪、豹、狐狸、狗、金丝猴、马鹿、猞猁、驼鹿、小灵猫、豹猫、梅花鹿、雪豹、马来熊、漠猫的DNA模板进行单重荧光特异性的实验，反应体系按照单重荧光定量PCR检测方法所确定的最佳反应体系建立。
5、本发明中单重qPCR的灵敏度实验
将黑熊和棕熊的DNA提取液原液按照10倍的梯度倍比稀释，得到100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的DNA原液。依次用相应的黑熊和棕熊引物和探针进行检测。
6、本发明中双重qPCR的特异性实验
将黑熊、棕熊的引物探针，牛和猪的引物探针分别混合。各自分别加入黑熊、棕熊、牛、猪、豹、狐狸、狗、金丝猴、马鹿、猞猁、驼鹿、小灵猫、豹猫、梅花鹿、雪豹、马来熊、漠猫的DNA模板。检测双重荧光体系的特异性情况。
7、混合DNA样品实验
分别将黑熊和棕熊、黑熊和牛、棕熊和猪、牛和猪的DNA样品按照1：1、1：10、10：1的比例混合。利用与混合模板相对应的引物和探针进行荧光定量PCR检测实验，验证混合样品的检测效果。
8、重复性实验
将黑熊和棕熊的DNA模板稀释到1ng/μl，利用相应的引物和探针进行重复检测，用于验证浓度下的重复性。取黑熊、棕熊样品各10个，分别用黑熊、棕熊相应的引物和探针进行检测，检测结果进行回判率分析。
9、定量分析
利用黑熊和棕熊的引物，对黑熊和棕熊DNA模板进行PCR扩增，体系建立和PCR条件如下：
反应体系：
PCR反应程序：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环
对黑熊和棕熊PCR扩增产物切胶回收，利用微量紫外分光光度计进行浓度测定。对切胶回收的黑熊和棕熊PCR产物进行10倍的倍比稀释，共设置5个浓度点。参照以上所述的qPCR反应体系和程序进行qPCR，每个浓度点设置三个重复样，绘制标准曲线，利用标准曲线对未知样品中的黑熊和棕熊DNA模板浓度进行测定。
附图说明
图1黑熊引物探针特异性实验结果
图2棕熊引物探针特异性实验结果
图3牛引物探针特异性实验结果
图4猪引物探针特异性实验结果
图5黑熊的梯度灵敏度实验
图6棕熊的梯度灵敏度实验
图7黑熊、棕熊模板1：1混合检测结果
图8棕熊、黑熊模板10：1混合检测结果
图9棕熊、黑熊模板1：10混合检测结果
图10棕熊、猪模板10：1混合检测结果
图11 1ng/μl黑熊、棕熊模板检测结果
图12 20个样品回判率实验结果
图13黑熊标准曲线
图14棕熊标准曲线
具体实施方式
实施例1
未知成分熊胆胶囊制品的检测
1、DNA的提取体系
样品的提取参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，取半个熊胆胶囊内容物，放置于2ml离心管中，加入350μl PBS和0.9μl RNase A。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶K，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管至于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，空管离心一分钟。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Tris-HCl洗脱液100μl洗脱制备管中DNA，-20℃冷冻备用。
2、体系和程序
对于待测样品，分别用20μl混合有棕熊和黑熊探针引物的反应体系和20μl混合有牛和猪探针引物的反应体系进行检测分析。
20μl反应体系：
PCR反应程序如下：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环，循环在退火时收集荧光信号。
判图原则：Ct值小于等于30并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于35判为阴性；Ct值介于30～35之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值小于等于30并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。
3、定量分析
利用黑熊和棕熊的引物，对黑熊和棕熊DNA模板进行PCR扩增，体系建立和PCR条件如下：
反应体系：
PCR条件：94℃2min；94℃10s；60℃30s；60℃1min；40个循环
对黑熊和棕熊PCR扩增产物切胶回收，利用微量紫外分光光度计进行浓度测定。对切胶回收的黑熊和棕熊PCR产物进行10倍的倍比稀释，共设置5个浓度点。参照以上所述的qPCR反应体系和程序进行qPCR扩增，每个浓度点设置三个重复样，绘制标准曲线，利用标准曲线对未知样品中的黑熊或棕熊DNA模板浓度进行测定。
4、检测结果
结果表明，未知熊胆胶囊制品的DNA提取液，经过qPCR扩增，出现明显的黑熊扩增曲线且Ct值小于30，说明为黑熊。通过黑熊标准曲线进行浓度测定，结果为23.7ng/μl。检测结果显示，本方法对于鉴定熊胆胶囊中的熊源性成分是准确、可靠、有效的。
>1
CTGACTGCTGCCACCATCTTT
>2
CAGTTCCTGCACCTGCTTCTACTATAG
>3
TGTTGCTTCTAGCTTCT
>4
TGGTTGCTGCCACCATCTT
>5
CCCTGCACCTGCTTCTACCA
>6
TACTGCTTCTGGCCTCC
>7
GGTGCTTGGGCCGGTATAGT
>8
GGCCTAATTCAGCGCGAAT
>9
AACAGCTCTAAGCCTTC
>10
TGACTATACTCAACAAACCACAAAGACA
>11
TTCCTGCTCAGGCACCAAAT
>12
CGGCACCCTGTACCTA

Claims (6)

1.一种利用MGB探针法qPCR检测熊胆胶囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于包括特异性引物和探针的序列如下：
。
2.根据权利1所述的利用MGB探针法qPCR检测熊胆胶囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于构建20μl单重荧光反应体系由以下组分组成：
。
3.根据权利1和权利2所述的利用MGB探针法qPCR检测熊胆胶囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于构建20μl双重荧光反应体系由以下组分组成：
。
4.一种采用如权利1、权利2和权利3所述的利用MGB探针法qPCR检测熊胆胶囊制品中熊源性成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、提取样品DNA
B、对步骤A中的样品DNA进行2次qPCR扩增，其中反应体系由以下组分组成：
所述的引物和探针：
C、利用普通PCR对每个模板分别进行扩增和琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目标条带，微量紫外分光光度计测量浓度并进行10倍倍比稀释，获得5个浓度点。每个浓度点设置3个重复样品，绘制标准曲线计算未知样品浓度。
所述的引物：
所述的反应体系：
D、对扩增后的曲线情况进行结果判定，按照以下判定原则：
Ct值小于等于30并有明显扩增曲线判为阳性；Ct值大于等于35判为阴性；Ct值介于30～35之间判为可疑，DNA模板加倍重复实验，如果Ct值小于等于30并拥有明显扩增曲线判为阳性，否则判为阴性。E、将胶回收产物按照10倍的比例倍比稀释，共设置5个浓度点，每个浓度点设置3个重复样。qPCR后绘制标准曲线，并利用标准曲线计算未知样品的浓度。
5.根据权利4所述的检测方法，其特征在于步骤B和步骤C所述的qPCR扩增按照以下步骤进行：
94℃2min；94℃10s，60℃30s 40个循环；60℃1min，循环在退火时收集荧光信号。
6.根据权利4所述的检测方法，其特征在于步骤A所述的样品DNA提取按照以下步骤进行：
取半个熊胆胶囊内容物放置于2ml离心管中，加入350μl PBS和0.9μl RNase A。加入150μl裂解液和20μl蛋白酶K，立即涡旋振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管至于2ml离心管中，将离心后的混合液上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，空管离心一分钟。将DNA制备管转移到新的1.5ml离心管中，加入65℃预热的Tris-HCl洗脱液100μl洗脱制备管中DNA，-20℃冷冻备用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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