CN111647678B

CN111647678B - 一种基于rbip标记鉴定甘薯品种的方法

Info

Publication number: CN111647678B
Application number: CN202010419792.1A
Authority: CN
Inventors: 孟羽莎; 王寅; 赖齐贤; 黄超
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2040-05-18
Also published as: CN111647678A

Abstract

本发明公开了6对甘薯RBIP引物对组合及其在品种鉴定中的应用。本发明提供了甘薯品种RBIP标记引物对组合及其在品种鉴定中的应用。本发明是基于RBIP标记鉴定方法，利用6对引物对不同甘薯品种进行鉴定的技术体系。该技术体系不仅能够快速、准确地对不同甘薯品种进行鉴定，还有利于甘薯品种的保护。

Description

一种基于RBIP标记鉴定甘薯品种的方法

技术领域

本发明属于分子生物学分子标记领域，尤其涉及甘薯RBIP引物对的开发及其在品种鉴定中的应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)，旋花科，甘薯属，起源于中南美洲热带地区，目前广泛种植于世界上多个国家和地区，是重要的粮食、饲料等作物，同时也是新型的能源作物，年总产量11283.5万吨(Food and Agriculture Organization of the UnitedNations,FAO，2017)。中国是世界上最大的甘薯生产国，年种植面积达337.3万hm²，占世界总种植面积的36.7％，年总产量为7203.1万吨，占世界年总产量的63.8％(FAO，2017)。

甘薯品种数量繁多，多数国内品种都是高频率地利用少数骨干亲本来进行杂交选育的，造成了国内甘薯的遗传基础狭隘，使得通过表型性状来鉴定、区别不同甘薯品种难上加难。随着分子生物学技术的发展，利用DNA分子标记在DNA水平上对不同品种进行鉴定逐渐成为一种快速有效的方法，此方法较表型性状鉴定法更为便捷，为甘薯品种鉴定提供了新的途径。

RAPD、AFLP、SSR、RBIP等DNA分子标记均可用于甘薯遗传多样性分析，其中RBIP分子标记较其它标记相比具有以下优点：(1)基因组中含量多、覆盖率广；(2)应用点杂交检测可使其分析完全自动化，能够同时实现对多个样品的快速、高通量标记分析，且为共显性标记；(3)具有高多态性和高稳定性等特征，已广泛应用于遗传多样性分析、品种及亲缘关系鉴定和遗传连锁图谱构建等方面。因此，RBIP分子标记可以准确快速地应用于甘薯指纹图谱的构建。

目前已公布的甘薯RBIP分子标记还比较少，高效、多态的RBIP标记更为缺乏，盲目地使用未进行多态性鉴定的分子标记进行品种鉴定不仅费时费力，也难以得到准确地鉴定结果。因此，本发明为甘薯及其近缘种提供了6对高效、多态的RBIP引物，以期能够有效地应用于甘薯分子育种中。

发明内容

本发明的第一目的是提供甘薯RBIP引物组。

本发明提供鉴定甘薯品种的成套RBIP引物组，包括LTR-10、LTR-11、LTR-13、LTR-20、LTR-37和LTR-38引物对。

所述引物对LTR-10包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列和如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列。

所述引物对LTR-11包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列和如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列。

所述引物对LTR-13包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列和如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列。

所述引物对LTR-20包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列和如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列。

所述引物对LTR-37包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列和如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列。

所述引物对LTR-38包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列和如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列或与之具有75％同源性的核苷酸序列。

进一步地，至少具有75％同源性为大于95％同源性或大于98％同源性。

本发明第2个目的是提供鉴定甘薯品种的成套PCR试剂盒。

本发明提供的成套PCR试剂盒，包括上述6个引物对，各个引物对中各条引物的摩尔比为1:1；

或每个PCR试剂中各个引物对中各条引物的浓度为10μmol/L。

含有上述的引物或上述的PCR试剂的试剂盒也是本发明保护的范围。

作为优选，6对引物对均独立包装。该试剂盒中还包括7.5μL2*Tsingke Mastermix(green)、ddH₂o 4.5μL。

本发明第3个目的是提供制备上述成套引物的方法。

本发明提供的方法，包括将所述引物对组中的所述6个引物对分别单独包装的步骤。

各条引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

本发明第4个目的是提供制备上述成套PCR试剂盒的方法。

本发明提供的方法，包括将所述成套PCR试剂中的所述6种PCR试剂分别单独包装的步骤。

上述的引物或上述的PCR试剂或上述的试剂盒在鉴定甘薯品种中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第5个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定甘薯品种的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：(1)分别使用LTR-10、LTR-11、LTR-13、LTR-20、LTR-37和LTR-38引物对对不同已知甘薯品种的DNA进行RBIP-PCR引物扩增得到不同甘薯品种的6对RBIP引物扩增产物；

(2)电泳检测步骤(1)中得到的待检测甘薯的6对RBIP-PCR引物扩增产物，根据电泳结果确定有效位点，在相同迁移位置上，扩增带型以“1”、“0”分别表示条带的有和无，构建每个甘薯品种中6对RBIP-PCR引物扩增产物的“1”、“0”数字指纹图谱。每个甘薯品种包含6个数字指纹图谱，所有甘薯品种的数字指纹图谱构成甘薯品种数字指纹图谱库。

(3)将待鉴定甘薯样品依照步骤(1)和步骤(2)进行RBIP-PCR引物扩增并电泳得到待鉴定甘薯样品的数字指纹图谱。将待鉴定甘薯样品的数字指纹图谱与甘薯品种数字指纹图谱库进行比对：

若待鉴定甘薯样品的数字指纹图谱与图谱库中某一品种甘薯数字指纹图谱中至少有2个带型不同，则待鉴定甘薯样品与该品种甘薯为或候选为不同品种；若甘薯样品中某两个甘薯品种的数字指纹图谱中最多有1个带型不同，则该两个品种为或候选为相同品种。

上述方法中，所述RBIP-PCR扩增的退火温度为54.31℃-59.07℃。

本发明的有益效果是：本发明的实验证明，本发明利用6对多态性丰富的RBIP引物对甘薯品种进行遗传多样性分析，与表型鉴定方法相比更加准确。而且本方法采用的是荧光标记引物的毛细管电泳检测，此方法相比传统的丙烯酰胺凝胶电泳检测更准确、高效且易操作。

附图说明

图1位点分析原理图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用6对RBIP引物鉴定甘薯品种的方法的建立。

一、引物对组合的设计

1、使用LTR harvest软件分析甘薯基因组

(http://public-genomes-ngs.molgen.mpg.de/SweetPotato/)，找到LTR全长

2、找出的LTR比对到repbase，划分为coipa和gypsy两个家族

3、在划分两大家族的基础上，用BLASTCLUST划分亚家族

4、在亚家族划分的基础上使用clustalw找出LTR保守区，使用BLAST将保守区比对到基因组，再利用Primer3软件在LTR保守区设计上游引物，在保守区下游的基因组区域设计下游引物。

二、6对RBIP引物对组合

选择表1所示的6对RBIP引物进行鉴定实验。

表1 6对RBIP引物

人工合成上述引物对1-引物对6。其中，LTR-10的正向引物对应序列表中的1号序列，反向引物对应序列表中的2号序列；LTR-11的正向引物对应序列表中的3号序列，反向引物对应序列表中的4号序列；LTR-13的正向引物对应序列表中的5号序列，反向引物对应序列表中的6号序列；LTR-20的正向引物对应序列表中的7号序列，反向引物对应序列表中的8号序列；LTR-37的正向引物对应序列表中的9号序列，反向引物对应序列表中的10号序列；LTR-38的正向引物对应序列表中的11号序列，反向引物对应序列表中的12号序列。

二、用于鉴定甘薯品种的方法建立

1、甘薯品种的DNA提取

采用改良的CTAB法，操作流程如下：

①选取不同甘薯品种新鲜、幼嫩叶片4-6片，迅速用液氮冷冻处理，置于-80℃冷冻保存。

②将冷冻的叶片放入装有液氮的预冷的研钵中，同时加入少量聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，在液氮冷冻条件下，利用研棒迅速将叶片研磨成粉末(期间需叶片一直保持冷冻状态)，随后迅速将粉末转入10mL的离心管中(一定要液氮都蒸发掉以后再盖上盖子)，每管装约为离心管容量的1/3，用于DNA提取或暂存于-80℃保存。

③将3mL已预热好的CTAB提取液(65℃)【CTAB(20g/L)，EDTA(2.9225g/L，10mmol/L)，三羟甲基氨基甲烷(12.114g/L，100mmol/L)，NaCl(81.816g/L，1.4mol/L)，β-巯基乙醇(20ml/L)，pH 8.0】加入到步骤②得到的装有粉末的离心管中，随后放入65℃水浴锅中进行预热，预热30-60min，每隔10-15min将试管上下轻晃数次，直至所有粉末都溶解在溶液中。

④继续向离心管加入3-4mL氯仿：异戊醇(24:1的体积比)混合液(即用即配，在通风厨中操作)，上下颠倒200-300次混匀直至乳白色，15-17℃，11000rpm离心15min。

⑤将步骤④离心得到的上清液转移至新的10ml离心管中，并加入0.6倍上清液体积的异丙醇(提前置于-20℃预冷)，轻轻颠倒摇均，放于4℃冰箱静置30min，待有白色DNA絮状物析出，用毛细玻璃管将其挑出置新的10ml离心管中，随后用70％(体积分数)乙醇漂洗2-3次，转入1.5mL离心管中，置于通风橱中自然干燥。

⑥将干燥的DNA溶于300μL 0.1XTE缓冲液中【EDTA(0.029225g/L，0.1mmol/L)、Tris(0.12114g/L，1mmol/L)，pH 8.0】，一周内可置于4℃保存，-20℃环境可保存一年，-80℃环境可保存三年。

⑦取少量DNA用1％琼脂糖胶电泳检测其纯度，以1XTBE【Tris(10.8g/L)、硼酸(5.5g/L)、EDTA(0.744g/L)，pH 8.3】为电泳缓冲液，100V恒压电泳30min；利用紫外分光光度计测定DNA溶液浓度及OD₂₆₀/OD₂₈₀，并将DNA稀释到50ng/μL待用。

根据上述方法得到不同甘薯品种的基因组DNA。

2、甘薯材料的RBIP-PCR扩增

利用上述表1的6对RBIP引物对甘薯品种的基因组DNA进行PCR扩增，反应体系和程序如下：

1)PCR扩增体反应体系参照表2进行配置，可以根据实验条件不同做出相应调整。试剂由北京擎科生物技术有限公司提供。

表2 PCR扩增反应体系

2)反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，54.31℃-59.07℃(根据不同引物的退火温度调整)退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

根据上述方法得到不同甘薯品种的6对RBIP引物扩增产物。

3、电泳并构建指纹图谱

1)电泳

将上述不同甘薯品种的6种RBIP扩增产物进行毛细管电泳，具体如下：

使用3730测序仪，操作步骤如下：

①mix的配置：将高浓度(98％)去离子甲酰胺(HiDi)与LIZ-500的分子量内标按130：1的体积比混合，配置成mix，将mix溶液分装至96孔反应板中，每孔加入10ul mix。

②上机样品的处理：对应着在96孔板中加入0.5ul样品模板(扩增产物)，离心到4000rpm即停，用金属浴加热器将混合板95℃加热预变性5分钟，拿出后立即放入-20℃冷却(或置于冰水混合物中，将样品完全包裹至冷却)，冷却后拿出，4000rpm离心、混匀。

③上机测序：利用ABI 3730xl遗传分析仪对样品进行毛细管电泳检测。

④结果获取：下机获取毛细管电泳结果。

⑤位点分析：利用软件Gene mapper 4.1对毛细管电泳结果进行分析，按照引物对应关系的核心碱基重复数来确定位点准确大小从而进行准确位点的分析，(例：(AG)₆)片段大小263(因加了M13F的18个碱基，所以大小实际为281)。原理如图1所示。

⑥多态性位点的筛选：根据分析出来的位点信息(峰图.PDF和数据.excel)来判断检测引物在每个甘薯品种中扩增的多态性条带情况，选取高特异性、高多态性的位点作为后续研究的重点。

⑦数据整理：分析每对引物毛细管电泳的结果，根据每一个片段的位置和峰值判断该条带的有效性。

2)构建RBIP指纹图谱

将甘薯品种每一对RBIP引物扩增位点的迁移位置和峰值进行比较，确定有效位点，GenRuler^TM100bp DNA Ladder标准下，条带的近似大小依次为：

LTR 10：518，525，535，541，634和657bp；

LTR 11：184，186，188，190，192，194，195，196和198bp；

LTR 13：125，131，139，232，262，386，390，392和407bp；

LTR 20：178，202，204，207，211和222bp；

LTR 37：124，135，154，159，167，174，190，250，259和266bp；

LTR 38：152，159，164，166，171，173，176，182，184，186和188bp。

在相同迁移位置上，扩增带型以“1”、“0”分别表示条带的有和无，构建“1”、“0”数字矩阵。

对每对引物的扩增结果进行统计分析，构建甘薯品种的RBIP分子指纹图谱，即可进行甘薯品种的鉴定。

若两个甘薯品种的6对RBIP扩增产物中不少于2个扩增带型不同，则判定该两个品种为或候选为不同品种；若两个甘薯品种的6对RBIP扩增产物中最多有1个扩增带型不同，则该两个品种为或候选为相同品种。

实施例2 6对RBIP引物对在鉴定甘薯品种中的应用

1、甘薯品种的DNA提取

采用实施例1中DNA提取方法提取表3所示的99个甘薯品种的基因组DNA；

2、甘薯材料RBIP-PCR扩增

以上述99个甘薯品种基因组DNA为模板，利用实施例1中的6对RBIP引物进行PCR扩增，得到99个甘薯品种的6对RBIP引物的扩增产物。

3、电泳并构建指纹图谱

将上述99个甘薯品种的6对RBIP引物扩增产物按照实施例1中电泳方法进行电泳并构建RBIP数字指纹图谱，结果如表3所示：

表3 99个甘薯品种的数字指纹图谱库

*数字(1：有，0：无)表示甘薯不同品种基因组DNA利用6对RBIP引物扩增产生的条带。

RBIP指纹图谱结果表明上述任意甘薯品种的6对RBIP引物扩增产物中有不少于2个扩增带型不同，故判定上述任意品种为或候选为不同品种。由表3可知，通过本发明的方法可以将这99个甘薯品种区别鉴定。

需要说明的是，上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种基于RBIP标记鉴定甘薯品种的方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 1

tagctctact ctcctgtaca t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 2

cgttgcatgg gtagtgatcg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 3

tagctctact ctcctgtaca t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 4

catcgaatgg gcgtgaactt 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 5

tagctctact ctcctgtaca t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 6

ttatccttgg tcggcttggt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 7

tagctctact ctcctgtaca t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 8

gaagagttac aaggcgcagg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 9

catcatgcca catctaggta 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 10

tgtgttttcc aggttcgcag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 11

catcatgcca catctaggta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 甘薯(Ipomoea batatas)

<400> 12

gacttgtgtt ttgggcctgt 20

Claims

1.一种用于鉴定或辅助鉴定甘薯品种的RBIP引物组，其特征在于，由LTR-10、LTR-11、LTR-13、LTR-20、LTR-37和LTR-38引物对组成；

所述引物对 LTR-10包括如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

所述引物对 LTR-11包括如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

所述引物对 LTR-13包括如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；

所述引物对 LTR-20包括如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；

所述引物对 LTR-37包括如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；

所述引物对 LTR-38包括如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

2.一种权利要求1所述RBIP引物组在鉴定或辅助鉴定甘薯品种中的应用。

3.一种PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RBIP引物组，其中，各对引物对中各条引物的摩尔比为1:1；各对引物对中各条引物的浓度为10 μmol/L。

4.一种应用权利要求1 RBIP引物组鉴定甘薯品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分别使用LTR-10、LTR-11、LTR-13、LTR-20、LTR-37和LTR-38引物对对不同已知甘薯品种的DNA进行RBIP-PCR引物扩增得到不同甘薯品种的6对RBIP引物扩增产物；

（2）电泳检测步骤（1）中得到的待检测甘薯的6对RBIP-PCR引物扩增产物，根据电泳结果确定有效位点，在相同迁移位置上，扩增带型以“1”、“0”分别表示条带的有和无，构建每个甘薯品种中6对RBIP-PCR引物扩增产物的“1”、“0” 数字指纹图谱；每个甘薯品种包含6个数字指纹图谱，所有甘薯品种的数字指纹图谱构成甘薯品种数字指纹图谱库；

（3）将待鉴定甘薯样品依照步骤（1）和步骤（2）进行RBIP-PCR引物扩增并电泳得到待鉴定甘薯样品的数字指纹图谱；将待鉴定甘薯样品的数字指纹图谱与甘薯品种数字指纹图谱库进行比对：