CN103484555B - 用issr分子标记法对甘薯品种真实性进行鉴别的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用ISSR分子标记法对甘薯品种真实性进行鉴别的方法。本发明公开的一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的引物组，由HBAAS-001引物、HBAAS-815引物和HBAAS-825引物组成；HBAAS-001引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；HBAAS-815引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；HBAAS-825引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明利用ISSR分子标记成功构建的甘薯品种单一引物的ISSR指纹图谱，使得甘薯品种真实性的鉴定简便、快捷、重复性和稳定性好，为ISSR分子标记技术更广泛地用于甘薯品种真实性鉴定打下良好的基础。

Description

用ISSR分子标记法对甘薯品种真实性进行鉴别的方法
技术领域
本发明涉及一种用ISSR分子标记法对甘薯品种真实性进行鉴别的方法。
背景技术
甘薯是一种重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。近些年，随着全球石油供给形势的日益严重，生物质能源的开发和利用日益重要。甘薯单位面积淀粉产量高，被认为是生产燃料乙醇的理想原料。甘薯作为新型的能源用植物，其市场潜力巨大，它将在我国能源安全中扮演重要的角色。
甘薯种薯的真实性和纯度是衡量种薯质量的重要指标，直接影响甘薯的产量和品质。生产上如何快速、准确鉴定甘薯种薯真实性是一个突出的问题。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，稳定性差，误鉴率较高。
分子标记技术具有丰富的多态性和环境稳定性，且操作简便，已开始广泛应用于作物品种鉴定与纯度检测中。ISSR分子标记是在SSR标记基础上发展起来的一种新技术,其基本原理是在SSR的5’或3’端加锚1-4个嘌呤或嘧啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列SSR的一段基因组DNA序列进行扩增。ISSR兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点。目前，ISSR标记技术在植物种质资源遗传多样性和亲缘关系、基因定位、分子标记辅助选择等研究中已广泛的应用。在甘薯中，应用ISSR分子标记分析甘薯种质资源遗传多样性已有报道，但应用ISSR分子标记技术进行甘薯品种真实性鉴定的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用ISSR分子标记法对甘薯品种真实性进行快速鉴别的方法。
本发明提供的一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的引物组，由HBAAS-001引物、HBAAS-815引物和HBAAS-825引物组成；
HBAAS-001引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
HBAAS-815引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
HBAAS-825引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒由上述引物组、PCR扩增缓冲液，dNTP，DNA聚合酶和ddH2O组成。
一种指纹图谱也属于本发明的保护范围，分别以所述引物组的三条引物对16种甘薯品种的叶片的DNA分别进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，得到每条引物针对每个甘薯品种的谱带，即为所述引物HBAAS-001对16种甘薯品种构建的指纹图谱、引物HBAAS-815对16种甘薯品种构建的指纹图谱和引物HBAAS-825对16种甘薯品种构建的指纹图谱；
所述16种甘薯品种为广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66；
所述PCR的体系如下：
模板DNA1μL，浓度为10μM的引物2μL，10×PCR扩增缓冲液5μL，浓度为2.5mM的dNTPs4μL，DNA聚合酶0.5μL，dd H2O补充体系至50μL；
DNA聚合酶的商品名称为Easy Taq DNA Polymerase，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AP111；
所述模板DNA为下述16种甘薯品种的叶片的DNA：广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66；
所述引物分别为所述引物组的三种引物；
所述PCR的程序如下：
94℃变性5min；94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸10min，10℃保存；
所述16种甘薯品种为广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66；
所述琼脂糖凝胶的浓度为4%，琼脂糖与电泳缓冲液的比例为4g：100ml。
一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的方法也属于本发明的保护范围，分别以上述引物组的三条引物对待测甘薯种薯进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到PCR产物条带；
PCR产物条带X由如下（1）-（3）所示的PCR产物条带组成：
（1）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用上述HBAAS-001引物扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xa；
（2）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用上述HBAAS-815引物扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xb；
（3）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用上述HBAAS-825引物扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xc；
若PCR产物条带Xa与以所述的HBAAS-001为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则所述待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xb与以所述的HBAAS-815为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则所述待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xc与以所述的HBAAS-825为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则所述待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xa与以所述的HBAAS-001为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，PCR产物条带Xb与以所述的HBAAS-815为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，PCR产物条带Xc与以所述的HBAAS-825为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，则所述待测甘薯种薯为A种甘薯；
所述PCR的体系如下：
模板DNA1μL，浓度为10μM的引物2μL，10×PCR扩增缓冲液5μL，浓度为2.5mM的dNTPs4μL，DNA聚合酶0.5μL，dd H2O补充体系至50μL；
DNA聚合酶的商品名称为Easy Taq DNA Polymerase，购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AP111；
所述PCR的程序如下：
94℃变性5min；94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸10min，10℃保存；
所述模板DNA为下述16种甘薯品种的叶片的DNA：广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66；
所述琼脂糖凝胶的浓度为4%，琼脂糖与电泳缓冲液的比例为4g：100ml；
所述16种甘薯品种为广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5和台农66。
上述引物组在辅助鉴定甘薯种薯真实性中的应用或在辅助鉴定甘薯品种真实性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述试剂盒在辅助鉴定甘薯种薯真实性中的应用或在辅助鉴定甘薯品种真实性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述指纹图谱在辅助鉴定甘薯种薯真实性中的应用或在辅助鉴定甘薯品种真实性中的应用也属于本发明的保护范围。
上述方法在辅助鉴定甘薯种薯真实性中的应用或在辅助鉴定甘薯品种真实性中的应用也属于本发明的保护范围。
所述甘薯种薯是留下来做种用的甘薯。
本发明利用ISSR分子标记成功构建了甘薯品种单一引物的ISSR指纹图谱表，使得甘薯品种真实性的鉴定简便、快捷、重复性和稳定性好，为ISSR分子标记技术更广泛地用于甘薯品种真实性鉴定打下良好的基础。
附图说明
图1为引物HBAAS-001对16个甘薯品种的扩增产物电泳图。
图2为引物HBAAS-815对16个甘薯品种的扩增产物电泳图。
图3为引物HBAAS-825对16个甘薯品种的扩增产物电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
Easy Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为AP111。
16种甘薯，广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5、台农66，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
广薯菜2号在文献“宋付平，黄洁，刘国道，等.2008.8份叶菜型甘薯种质在海南的试验评价.中国农学通报,24（9）,421-424.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
商薯19在文献“杨爱梅，王家才，记允安，等.2008.高淀粉甘薯新品种商薯19高产栽培措施研究.河南农业科学,7,41-42.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
尚志12在文献“甘学德，黄洁.2009.菜用型甘薯的研究概况及发展对策.热带农业科学,29（9）,29-33.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
徐紫薯1号在文献“马代夫，李秀英，李洪民，等.2004.甘薯新品种徐紫薯1号的特征特性及栽培要点.江苏农业科学,6,53-54.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
鲁薯3号在文献“史新敏，唐君，张允刚，等.2008.叶柄菜用甘薯品种资源的筛选与应用.安徽农业科学,36（6）,2299-2300.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
徐薯26在文献“李强，李秀英，谢逸萍，等.2010.抗病高淀粉甘薯品种徐薯26的选育及产量形成特点.植物遗传资源学报,11（5）,654-658.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
徐薯43-14在文献“周忠，王欣，马代夫，等.2005.甘薯抗茎线虫病基因的RAPD标记.农业生物技术学报,13（5）,549-522.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
苏薯3号在文献“纵瑞收.1990.苏薯3号的特征特性和栽培技术.江苏农业科学,6,21-22.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
苏薯11号在文献“谢一芝，郭小丁，尹晴红，等.2007.甘薯新品种苏薯11号的选育和栽培技术.江苏农业科学,5,62-63.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
徐薯55-2在文献“周开芳，左明玉，郑明强，等.2011.不同脱毒红薯品种对产量及其品质的影响.新品种选育与推广,30（1）,115-117.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
莆薯53在文献“刘文滔，刘金文，郑光武，等.2004.菜用甘薯“莆薯53”的生物学特性及其栽培技术.福建农业科技,2,18-19.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
台农71在文献“周杰，曹清河，周志林，等.2012.菜用型甘薯不同品种组织培养差异研究.江苏农业科学,40（1）,60-62.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
徐22-5在文献“马代夫，李强，李秀英，等.2009.甘薯高胡萝卜素食用品种的亲本筛选.中国农业科学,42（3）,789-808.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
台农66在文献“吴文明，苏秋芹.2004.甘薯新品种丰产性和稳产性分析.杂粮作物,24（6）,326-328.”中公开过，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
实施例1、用于甘薯品种鉴定的ISSR指纹图谱表的构建
一、DNA提取
以表1所示的16种不同甘薯品种生长出来的叶片为材料，分别采用SDS法提取DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测各品种甘薯的总DNA纯度、质量以及完整性。用紫外分光光度计测定提取的DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度。将各品种甘薯的DNA稀释至50-100ng/μL，于-20℃保存备用。
二、引物合成
合成如下3种引物：
HBAAS-001：序列为5’-ACACACACACACACACCG-3’（SEQ ID No.1）
HBAAS-815：序列为5’-CTCTCTCTCTCTCTCTG-3’（SEQ ID No.2）
HBAAS-825：序列为5’-ACACACACACACACACT-3’（SEQ ID No.3）
三、ISSR-PCR扩增及电泳检测
(一)以提取的各品种甘薯的DNA为模板，分别进行PCR扩增。
PCR采用50μL反应体系：
模板DNA1μL，引物2μL（10μM），10×Easy Taq Buffer，dNTPs4μL（2.5mM），Easy Taq DNA Polymerase0.5μL，dd H2O补充体系至50μL。
其中模板DNA为步骤一得到的16种不同甘薯品种的DNA，引物为HBAAS-001。
PCR程序：
94℃变性5min；94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸10min，10℃保存。
用4%琼脂糖凝胶电泳检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照。
结果如图1所示，图1中1-16代表甘薯的编号，M为Marker。
表1甘薯品种
（二）以提取的DNA为模板，分别进行PCR扩增。
PCR采用50μL反应体系：
模板DNA1μL，引物2μL（10μM），10×Easy Taq Buffer，dNTPs4μL（2.5mM），Easy Taq DNA Polymerase0.5μL，dd H2O补充体系至50μL。
其中模板DNA为步骤一得到的16种不同甘薯品种的DNA，引物为HBAAS-815。
PCR程序：
94℃变性5min；94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸10min，10℃保存。
用4%琼脂糖凝胶电泳检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照。
结果如图2所示，图2中1-16代表甘薯的编号，M为Marker。
（三）以提取的DNA为模板，分别进行PCR扩增。
PCR采用50μL反应体系：
模板DNA1μL，引物2μL（10μM），10×Easy Taq Buffer，dNTPs4μL（2.5mM），Easy Taq DNA Polymerase0.5μL，dd H2O补充体系至50μL。
其中模板DNA为步骤一得到的16种不同甘薯品种的DNA，引物为HBAAS-825。
PCR程序：
94℃变性5min；94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸10min，10℃保存。
用4%琼脂糖凝胶电泳检测ISSR-PCR扩增产物，在紫外灯下拍照。
结果如图3所示，图3中1-16代表甘薯的编号，M为Marker。
四、根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱：以甘薯品种编号为纵列，以每条谱带的位点编号为横列，在每一纵横交结处，有扩增谱带用“1”表示，没有扩增谱带用“0”表示，分别制得每条引物对不同甘薯品种的DNA指纹图谱表。
各引物构建的指纹图谱表如表2-表4所示。
表2引物HBAAS-001对16个甘薯品种构建的指纹图谱表
表3引物HBAAS-815对16个甘薯品种构建的指纹图谱表
表4引物HBAAS-825对16个甘薯品种构建的指纹图谱表
五、利用构建的DNA指纹图谱表进行甘薯品种的真实性鉴定
在步骤四的条件下用引物HBAAS-001、HBAAS-815和HBAAS-825分别对待测甘薯种薯的叶片的DNA进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到PCR产物条带；
PCR产物条带X由如下（1）-（3）所示的PCR产物条带组成：
（1）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用上述HBAAS-001引物扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xa；
（2）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用上述HBAAS-815引物扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xb；
（3）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用上述HBAAS-825引物扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xc；
若PCR产物条带Xa与表2中16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xb与表3中16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xc与表4中16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xa与表2中16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，PCR产物条带Xb与表3中16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，PCR产物条带Xc与表4中16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，则待测甘薯种薯为A种甘薯。

Claims (6)

1.一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的引物组，由HBAAS-001引物、HBAAS-815引物和HBAAS-825引物组成；
HBAAS-001引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
HBAAS-815引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
HBAAS-825引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的试剂盒，该试剂盒由权利要求1所述的引物组、PCR扩增缓冲液，dNTP，DNA聚合酶和ddH2O组成。
3.一种用于辅助鉴定甘薯种薯真实性的方法，分别以权利要求1所述引物组的三条引物对待测甘薯种薯进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到PCR产物条带；
PCR产物条带X由如下（1）-（3）所示的PCR产物条带组成：
（1）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用权利要求1所述的HBAAS-001扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xa；
（2）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用权利要求1所述的HBAAS-815扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xb；
（3）以待测甘薯种薯的叶片的DNA为模板，用权利要求1所述的HBAAS-825扩增得到的PCR产物条带，记作PCR产物条带Xc；
若PCR产物条带Xa与以权利要求1所述的HBAAS-001为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则所述待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xb与以权利要求1所述的HBAAS-815为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则所述待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xc与以权利要求1所述的HBAAS-825为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种的PCR产物条带均不相同，则所述待测甘薯种薯不属于16种甘薯品种的任一种；
若PCR产物条带Xa与以权利要求1所述的HBAAS-001为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，PCR产物条带Xb与以权利要求1所述的HBAAS-815为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，PCR产物条带Xc与以权利要求1所述的HBAAS-825为引物，分别以16种甘薯品种的叶片的DNA为模板得到的16种甘薯品种中的A种甘薯的PCR产物条带完全相同，则所述待测甘薯种薯为A种甘薯；
所述琼脂糖凝胶的浓度为4%，琼脂糖与电泳缓冲液的比例为4g：100ml；
所述16种甘薯品种为广薯菜2号、商薯19、尚志12、徐紫薯1号、鲁薯3号、徐薯26、徐薯43-14、苏薯10号、苏薯3号、苏薯11号、徐薯55-2、徐紫8008、莆薯53、台农71、徐22-5、台农66。
4.权利要求1所述的引物组在辅助鉴定甘薯种薯真实性中的应用或在辅助鉴定甘薯品种真实性中的应用。
5.权利要求2所述的试剂盒在辅助鉴定甘薯种薯真实性中的应用或在辅助鉴定甘薯品种真实性中的应用。
6.权利要求3所述的方法在辅助鉴定甘薯种薯真实性中的应用或在辅助鉴定甘薯品种真实性中的应用。
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