CN110229926B - 甘薯叶绿体ssr引物及其在甘薯集团杂交亲子鉴定的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘薯叶绿体SSR引物及其在甘薯集团杂交亲子鉴定的应用。本发明保护引物组合，由序列表的序列1至序列22所示的引物组成。本发明开发了甘薯叶绿体SSR引物，建立一套稳定可靠、简单快速的甘薯集团杂交亲子鉴定的方法。本发明对于甘薯品种和种质资源鉴别和亲子鉴定研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及农业技术领域，具体涉及一种甘薯叶绿体SSR引物及其在甘薯集团杂交亲子鉴定的应用。
背景技术
甘薯是一种重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。放任授粉和定向杂交是甘薯新品种选育的主要手段，其中通过放任授粉(集团杂交)方式选育的新品种数量最多。甘薯品种数量繁多，由于少数骨干亲本(南瑞苕和胜利百号等)作为亲本的广泛应用，导致20世纪90年代之前育成品种的94％具有南瑞苕和胜利百号血缘，狭窄的遗传基础造成品种的遗传多样性降低，选育突破性的新品种相当困难。
叶绿体微卫星是近年来发展起来的一种新型分子标记技术,具有共显性、多态性高、分布广等优点，又兼顾叶绿体基因组结构简单、相对保守、单亲遗传等特点，已被广泛用于鉴定种甚至亲缘关系很近的种，描述群体和个体水平的遗传差异。目前，甘薯的叶绿体基因组全序列已被测定，为甘薯叶绿体SSR引物的开发及甘薯集团杂交亲子鉴定的研究创造了条件。目前在甘薯品种和种质资源鉴别和亲子鉴定的研究，一般采用甘薯的细胞核基因组的遗传信息，但是采用叶绿体SSR标记鉴定甘薯品种(种质)和亲子关系未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘薯叶绿体SSR引物及其在甘薯集团杂交亲子鉴定的应用。
本发明首先提供了一种引物组合，由11对特异引物对组成；
引物对1由引物CPS4-F和引物CPS4-R组成；
所述引物CPS4-F为如下(a1)或(a2)；
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS4-R为如下(a3)或(a4)；
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
引物对2由引物CPS5-F和引物CPS5-R组成；
所述引物CPS5-F为如下(b1)或(b2)；
(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS5-R为如下(b3)或(b4)；
(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
引物对3由引物CPS6-F和引物CPS6-R组成；
所述引物CPS6-F为如下(c1)或(c2)；
(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS6-R为如下(c3)或(c4)；
(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
引物对4由引物CPS7-F和引物CPS7-R组成；
所述引物CPS7-F为如下(d1)或(d2)；
(d1)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS7-R为如下(d3)或(d4)；
(d3)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
引物对5由引物CPS9-F和引物CPS9-R组成；
所述引物CPS9-F为如下(e1)或(e2)；
(e1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS9-R为如下(e3)或(e4)；
(e3)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
引物对6由引物CPS10-F和引物CPS10-R组成；
所述引物CPS10-F为如下(f1)或(f2)；
(f1)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS10-R为如下(f3)或(f4)；
(f3)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子；
引物对7由引物CPS14-F和引物CPS14-R组成；
所述引物CPS14-F为如下(g1)或(g2)；
(g1)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列13具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS14-R为如下(g3)或(g4)；
(g3)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列14具有相同功能的DNA分子；
引物对8由引物CPS15-F和引物CPS15-R组成；
所述引物CPS15-F为如下(h1)或(h2)；
(h1)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(h2)将序列15经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列15具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS15-R为如下(h3)或(h4)；
(h3)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(h4)将序列16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列16具有相同功能的DNA分子；
引物对9由引物CPS17-F和引物CPS17-R组成；
所述引物CPS17-F为如下(i1)或(i2)；
(i1)序列表的序列17所示的单链DNA分子；
(i2)将序列17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列17具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS17-R为如下(i3)或(i4)；
(i3)序列表的序列18所示的单链DNA分子；
(i4)将序列18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列18具有相同功能的DNA分子；
引物对10由引物CPS18-F和引物CPS18-R组成；
所述引物CPS18-F为如下(j1)或(j2)；
(j1)序列表的序列19所示的单链DNA分子；
(j2)将序列19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列19具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS18-R为如下(j3)或(j4)；
(j3)序列表的序列20所示的单链DNA分子；
(j4)将序列20经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列20具有相同功能的DNA分子；
引物对11由引物CPS19-F和引物CPS19-R组成；
所述引物CPS19-F为如下(k1)或(k2)；
(k1)序列表的序列21所示的单链DNA分子；
(k2)将序列21经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列21具有相同功能的DNA分子；
所述引物CPS19-R为如下(k3)或(k4)；
(k3)序列表的序列22所示的单链DNA分子；
(k4)将序列22经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列22具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合的用途为辅助鉴定甘薯品种。
本发明还保护所述引物组合在辅助鉴定甘薯品种中的应用。
本发明还保护含有所述的引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为辅助鉴定甘薯品种。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种指纹图谱，是通过如下方式制备得到的：采用所述引物组合中的11个特异引物对分别对n种甘薯品种的叶片基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每个特异引物对对n种甘薯品种扩增的产物条带带型，即为n种甘薯的指纹图谱。
所述甘薯品种为鄂薯7号、薯绿1号、福薯7-6、川菜薯211、莆薯53、台农71、泉薯830、广菜薯6号、宁菜薯1号、鄂薯12、福菜薯18、鄂薯10号、广菜薯2号、鄂薯11、鄂菜薯2号和鄂菜薯1号中的一种或多种。
本发明还保护所述指纹图谱在辅助鉴定甘薯品种中的应用。
本发明还保护一种辅助鉴定甘薯品种的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测甘薯的叶片基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的叶片基因组DNA为模板，采用所述引物组合中的11个特异引物对分别对模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每个特异引物对对待测甘薯扩增的产物条带带型；
(3)以16种甘薯品种的叶片基因组DNA为模板，采用所述引物组合中的11个特异引物对分别对模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每个特异引物对对每种甘薯品种扩增的产物条带带型；
(4)将步骤(2)的结果与步骤(3)的结果进行对比，如果待测甘薯与16种甘薯品种中的A种甘薯的扩增产物存在10个或11个条带带型完全相同，则待测甘薯与A种甘薯为相同品种或近似品种的甘薯；
所述16中甘薯品种分别为：鄂薯7号、薯绿1号、福薯7-6、川菜薯211、莆薯53、台农71、泉薯830、广菜薯6号、宁菜薯1号、鄂薯12、福菜薯18、鄂薯10号、广菜薯2号、鄂薯11、鄂菜薯2号和鄂菜薯1号。
本发明还保护一种辅助鉴别两种甘薯是否为同一品种或近似品种的方法，包括如下步骤：
(1)提取两种待测甘薯的叶片基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的叶片基因组DNA为模板，采用所述引物组合中的11个特异引物对分别对模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每个特异引物对对两种待测甘薯扩增的产物条带带型；
(3)将步骤(2)的结果进行分析，如果两个甘薯品种的11个扩增产物条带中存在10个或11个条带的带型完全相同，则这两个甘薯为相同品种或近似品种的甘薯；如果两个甘薯品种的11个扩增产物条带带型存在大于等于2个的差异，则这两个甘薯为不同品种的甘薯。
本发明还保护所述引物组合，或，所述试剂盒，或，所述指纹图谱，或，以上任一所述方法，在甘薯种质资源鉴定或亲子鉴定中的应用。
以上任一所述待测甘薯具体可为鄂薯7号、薯绿1号、福薯7-6、川菜薯211、莆薯53、台农71、泉薯830、广菜薯6号、宁菜薯1号、鄂薯12、福菜薯18、鄂薯10号、广菜薯2号、鄂薯11、鄂菜薯2号或鄂菜薯1号。
叶绿体微卫星标记是基于叶绿体基因组开发的一种标记，兼具核基因组SSR和叶绿体基因组的特点，高多态性、多等位性、共显性等特点，而且呈单亲遗传模式，兼顾到叶绿体基因组结构简单、相对保守等特点。叶绿体SSR技术已广泛应用于植物群体遗传结构、胞质遗传特性、物种演化、谱系地理等方面研究。本发明开发了甘薯叶绿体SSR引物，建立一套稳定可靠、简单快速的甘薯集团杂交亲子鉴定的方法。本发明对于甘薯品种和种质资源鉴别和亲子鉴定研究具有重要意义。
附图说明
图1为采用CPS4、CPS5和CPS6进行扩增得到的电泳结果。
图2为采用CPS7、CPS9和CPS10进行扩增得到的电泳结果。
图3为采用CPS14、CPS15和CPS17进行扩增得到的电泳结果。
图4为采用CPS18和CPS19进行扩增得到的电泳结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Easy-Taq DNA聚合酶：北京全式金生物技术有限公司。
鄂薯7号：参考文献：杨新笋，雷剑，杨年堤，等.2009.食用型甘薯新品种鄂薯7号的选育与栽培要点.杂粮作物,29(02):83-85.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
薯绿1号：参考文献：曹清河，季志仙，李强，等.2017.菜用甘薯新品种薯绿1号的选育.中国蔬菜，(03):70-72.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
福薯7-6：参考文献：李伟星，蔡南通.2003.叶菜专用型甘薯新品种——福薯7-6.农业科技通讯，2003(07):42.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
川菜薯211：参考文献：谭文芳，杨松涛，李明，等.2015.种植密度和采摘频率对川菜薯211茎尖产量及食用品质的影响.江苏农业科学，43(03):136-138.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
莆薯53：参考文献：崔纪超，中奕，钟玉扬，等.2012.叶菜型甘薯“莆薯53”不同栽植方式产量分析.福建农业科技，(09):44-45+52.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
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鄂薯12：参考文献：江甜，李佳，杨宁，等.2019.紫薯花色苷在贮藏过程中的降解特性.食品科学，40(07):88-94.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
福菜薯18：参考文献：黄浩清.2014.福菜薯18号甘薯.蔬菜，(12):66-67.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
鄂薯10号：参考文献：王连军，雷剑，苏文瑾，等.2015.2005-2014年甘薯品种国家鉴定情况分析.湖北农业科学，54(12):2844-2849.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
广菜薯2号：参考文献：王连军，雷剑，苏文瑾，等.2015.2005-2014年甘薯品种国家鉴定情况分析.湖北农业科学，54(12):2844-2849.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
鄂薯11：参考文献：王连军，雷剑，苏文瑾，等.2015.2005-2014年甘薯品种国家鉴定情况分析.湖北农业科学，54(12):2844-2849.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
鄂菜薯1号：参考文献：杨新笋.2010.菜用红薯新品种——鄂菜薯1号.农家顾问，(11):48.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
鄂菜薯2号：参考文献：董玲霞，苏一钧，戴习彬，等.2018.基于SSR分子标记的甘薯地上部专用品种遗传多样性分析.江苏农业学报，34(4):741-746.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
广菜薯6号：参考文献：董玲霞，苏一钧，戴习彬，等.2018.基于SSR分子标记的甘薯地上部专用品种遗传多样性分析.江苏农业学报，34(4):741-746.；公众可以从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。
本发明中采用的16份甘薯种质材料如表1所示。
表1 16份甘薯种质材料
实施例1、甘薯叶绿体SSR引物的开发
针对不同甘薯品种的叶绿体基因组序列进行序列分析，设计了若干对用于鉴定甘薯品种的SSR引物，经过特异性筛选，得到表2所示的11对SSR引物。
表2 cpSSR引物序列信息
实施例2、cpSSR指纹图谱的构建
供试材料：表1所示的16份甘薯种质材料。
1、提取供试材料新鲜幼嫩叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用表2中所示的11对引物进行PCR扩增，每份材料获得11个扩增产物。
PCR扩增的反应体系：10×buffer(Mg2+)5.0μL，dNTPs(10mmol/L)4.0μL，正向引物1.0μL(10μmol/L)，反向引物1.0μL(10μmol/L)，基因组DNA(50～60ng/μL)1.0μL，Easy-TaqDNA聚合酶0.5μL，ddH2O补至总体积为50μL。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，然后在4℃保存5min。
2、将步骤1得到的扩增产物在0.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上电泳，105V电泳4h，0.1％AgNO3染色，1.5％NaOH溶液和甲醛溶液组成的显影液显影，进行拍照，记录结果。
采用CPS4、CPS5和CPS6进行扩增得到的电泳结果如图1所示(图1中，每一组泳道由左至右依次对应maker及表1中编号1至16的甘薯材料)。
采用CPS7、CPS9和CPS10进行扩增得到的电泳结果如图2所示(图2中，每一组泳道由左至右依次对应maker及表1中编号1至16的甘薯材料)。
采用CPS14、CPS15和CPS17进行扩增得到的电泳结果如图3所示(图3中，每一组泳道由左至右依次对应maker及表1中编号1至16的甘薯材料)。
采用CPS18和CPS19进行扩增得到的电泳结果如图4所示(图4中，每一组泳道由左至右依次对应maker及表1中编号1至16的甘薯材料)。
结果如表3所示。使用11对引物在16份供试甘薯种质材料进行扩增，总共获得43条条带，引物CPS10扩增条带数最多为7条，单对引物平均扩增的条带数为3.91，多态性条带35个，平均多态性条带数3.18，多态性百分率为81.4％。
表3 cpSSR引物扩增结果
3、对步骤2得到的cpSSR的扩增条带进行统计分析，采用人工读带的方法，在凝胶相同位置，扩增出条带的记为“1”，无条带的记为“0”，构成(0,1)矩阵。
使用引物CPS4对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表4所示。
使用引物CPS5对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表5所示。
使用引物CPS6对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表6所示。
使用引物CPS7对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表7所示。
使用引物CPS9对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表8所示。
使用引物CPS10对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表9所示。
使用引物CPS14对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表10所示。
使用引物CPS15对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表11所示。
使用引物CPS17对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表12所示。
使用引物CPS18对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表13所示。
使用引物CPS19对16种甘薯品种构建的指纹图谱如表14所示。
汇总指纹图谱如表15所示。
表4引物CPS4对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表5引物CPS5对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表6引物CPS6对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表7引物CPS7对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表8引物CPS9对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表9引物CPS10对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表10引物CPS14对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表11引物CPS15对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表12引物CPS17对17种甘薯品种构建的指纹图谱
表13引物CPS18对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表14引物CPS19对16种甘薯品种构建的指纹图谱
表15 11对引物构建的指纹图谱
实施例3、SSR引物及指纹图谱的应用
根据上述实施例的结果，利用构建的指纹图谱建立鉴定甘薯品种的方法：
1、提取待测甘薯叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别采用表2中所示的11对引物进行PCR扩增，获得11个扩增产物。
PCR扩增的反应体系和反应程序见实施例2的步骤1。
2、将步骤1得到的扩增产物在0.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上电泳，105V电泳4h，0.1％AgNO3染色，1.5％NaOH溶液和甲醛溶液组成的显影液显影，进行拍照，记录结果。
3、根据步骤2记录的条带结果进行分析，分析方法如下：
如果待测甘薯的11个扩增产物条带中存在10个或11个条带带型与表15中的甘薯品种A完全相同，则待测甘薯与甘薯品种A为相同品种或近似品种；
如果待测甘薯的11个扩增产物条带与表15中任意一种甘薯品种的条带带型都存在大于等于2个的差异，则待测甘薯品种与表15中的甘薯品种均不同；
在对任意两个甘薯进行检测时，如果两个甘薯的11个扩增产物条带中存在10个或11个条带的带型完全相同，则这两个甘薯为相同品种或近似品种；
在对任意两个甘薯进行检测时，如果两个甘薯的11个扩增产物条带带型存在大于等于2个的差异，则这两个甘薯是不同品种的甘薯。
序列表
<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所
<120> 甘薯叶绿体SSR引物及其在甘薯集团杂交亲子鉴定的应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttcgcaata actcgggatt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaatccaag gcaaggttgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggggtgtag ctaccgaaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggggtcat ggaaagaaca 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaccaaaaac gcatctcctt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tccgtagcgt ctaccgattt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acttttgatc gatccgggta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agttggccta tgcctgtttg 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcatttcgtc tttttggtct ca 22
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccctcttac tgagcatttc c 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatgagcccc tcgaaaactt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaaatcgtgg ttgggaaggt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggaagggct gtagcacaaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atccggcaga acaactcaaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atccgatcga ttgcgtaaag 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctcctcggt ccacagagac 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctcctcggt ccacagagac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atccgatcga ttgcgtaaag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atccggcaga acaactcaaa 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aggaagggct gtagcacaaa 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aattgaattg ggtccacgaa 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caaaatcaaa atcaaaatga gatga 25
Claims (7)
1.一种引物组合，由11对特异引物对组成；
引物对1由引物CPS4-F和引物CPS4-R组成；
所述引物CPS4-F为序列表的序列1所示的单链DNA分子；
所述引物CPS4-R为序列表的序列2所示的单链DNA分子；
引物对2由引物CPS5-F和引物CPS5-R组成；
所述引物CPS5-F为序列表的序列3所示的单链DNA分子；
所述引物CPS5-R为序列表的序列4所示的单链DNA分子；
引物对3由引物CPS6-F和引物CPS6-R组成；
所述引物CPS6-F为序列表的序列5所示的单链DNA分子；
所述引物CPS6-R为序列表的序列6所示的单链DNA分子；
引物对4由引物CPS7-F和引物CPS7-R组成；
所述引物CPS7-F为序列表的序列7所示的单链DNA分子；
所述引物CPS7-R为序列表的序列8所示的单链DNA分子；
引物对5由引物CPS9-F和引物CPS9-R组成；
所述引物CPS9-F为序列表的序列9所示的单链DNA分子；
所述引物CPS9-R为序列表的序列10所示的单链DNA分子；
引物对6由引物CPS10-F和引物CPS10-R组成；
所述引物CPS10-F为序列表的序列11所示的单链DNA分子；
所述引物CPS10-R为序列表的序列12所示的单链DNA分子；
引物对7由引物CPS14-F和引物CPS14-R组成；
所述引物CPS14-F为序列表的序列13所示的单链DNA分子；
所述引物CPS14-R为序列表的序列14所示的单链DNA分子；
引物对8由引物CPS15-F和引物CPS15-R组成；
所述引物CPS15-F为序列表的序列15所示的单链DNA分子；
所述引物CPS15-R为序列表的序列16所示的单链DNA分子；
引物对9由引物CPS17-F和引物CPS17-R组成；
所述引物CPS17-F为序列表的序列17所示的单链DNA分子；
所述引物CPS17-R为序列表的序列18所示的单链DNA分子；
引物对10由引物CPS18-F和引物CPS18-R组成；
所述引物CPS18-F为序列表的序列19所示的单链DNA分子；
所述引物CPS18-R为序列表的序列20所示的单链DNA分子；
引物对11由引物CPS19-F和引物CPS19-R组成；
所述引物CPS19-F为序列表的序列21所示的单链DNA分子；
所述引物CPS19-R为序列表的序列22所示的单链DNA分子。
2.权利要求1所述的引物组合在辅助鉴定甘薯品种中的应用。
3.含有权利要求1所述的引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为辅助鉴定甘薯品种。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种辅助鉴定甘薯品种的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测甘薯的叶片基因组DNA；
（2）以步骤（1）得到的叶片基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合中的11个特异引物对分别对模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每个特异引物对对待测甘薯扩增的产物条带带型；
（3）以16种甘薯品种的叶片基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合中的11个特异引物对分别对模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每个特异引物对对每种甘薯品种扩增的产物条带带型；
（4）将步骤（2）的结果与步骤（3）的结果进行对比，如果待测甘薯与16种甘薯品种中的A种甘薯的扩增产物存在10个或11个条带带型完全相同，则待测甘薯与A种甘薯为相同品种或近似品种的甘薯；
所述16中甘薯品种分别为：鄂薯7号、薯绿1号、福薯7-6、川菜薯211、莆薯53、台农71、泉薯830、广菜薯6号、宁菜薯1号、鄂薯12、福菜薯18、鄂薯10号、广菜薯2号、鄂薯11、鄂菜薯2号和鄂菜薯1号。
6.一种辅助鉴别两种甘薯是否为同一品种或近似品种的方法，包括如下步骤：
（1）提取两种待测甘薯的叶片基因组DNA；
（2）以步骤（1）得到的叶片基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组合中的11个特异引物对分别对模板进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到每个特异引物对对两种待测甘薯扩增的产物条带带型；
（3）将步骤（2）的结果进行分析，如果两个甘薯品种的11个扩增产物条带中存在10个或11个条带的带型完全相同，则这两个甘薯为相同品种或近似品种的甘薯；如果两个甘薯品种的11个扩增产物条带带型存在大于等于2个的差异，则这两个甘薯为不同品种的甘薯。
7.权利要求1所述的引物组合或权利要求3所述的试剂盒或权利要求5或6所述的方法在甘薯种质资源鉴定或亲子鉴定中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20220218 |