CN112941218B

CN112941218B - 用cpSSR分子标记法对山药种质资源真实性进行鉴别的方法

Info

Publication number: CN112941218B
Application number: CN202110154132.XA
Authority: CN
Inventors: 王连军; 杨新笋; 张静珍; 柴沙沙; 雷剑; 宋峥
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112941218A

Abstract

本发明公开了一种用cpSSR分子标记法对山药种质资源真实性进行鉴别的方法。本发明公开的一种用于辅助鉴定山药种质资源真实性的引物组，由SY69、SY104、SY108、SY158、SY161、SY196、SY216、SY280、SY302、SY326中的至少两种引物对组成。本发明SY161，SY326构建64份供试种质资源的指纹图谱，使得山药种质资源真实性的鉴定简便、快捷、重复性和稳定性好，为cpSSR分子标记技术更广泛地用于山药种质资源真实性鉴定打下良好的基础。

Description

用cpSSR分子标记法对山药种质资源真实性进行鉴别的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，本发明涉及用cpSSR分子标记法对山药种质资源真实性进行鉴别的方法。

背景技术

山药(DioscoreaoppositeacThunb)，是百合目(Liliales)薯蓣科(Dioscoreaceace)薯蓣属(Dioscorea)一年生或多年生缠绕性藤本植物，药食两用。我国山药种质资源在长期种植过程中，由于生态环境的变化、人工选择、历史变迁，品种资源丰富，如铁棍山药，佛手山药，日本小叶山药，嘉祥细长毛山药等。山药种质资源复杂多样，地区间引种，真假山药无法有效鉴定，分类鉴定难度大。山药也是临床配方常用中药，它的主要功能是：益气养阴，补脾肺肾，山药的混伪品大量存现于市场，而且混伪品加工作伪手段越来越高明。

山药的真实性和纯度是衡量山药质量的重要指标，直接影响山药的产量和品质。生产上如何快速、准确鉴定山药真实性是一个突出的问题。传统的形态鉴定法依赖于品种表型差异，而形态性状的表现受环境影响较大，稳定性差，误鉴率较高。

分子标记技术具有丰富的多态性和环境稳定性，且操作简便，已开始广泛应用于作物品种鉴定与纯度检测中。叶绿体微卫星(chloroplastSSR,cpSSR)，是一种新型高效的微卫星子标记技术结合了SSR和cpDNA的优点，重复性好，多态性高，显性遗传，分布广泛且进化缓慢、结构简单，分子量小，单亲保守遗传，cpSSR标记已被广泛应用于遗传多样性研究。在山药中，应用cpSSR分子标记分析山药种质资源遗传多样性已有报道，但应用cpSSR分子标记技术进行山药品种真实性鉴定的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快捷、重复性和稳定性好的对山药种质资源真实性进行鉴别的方法。

本发明提供一种获取DNA山药指纹图的引物组合物，所述引物组合物由引物对SY161和引物对SY326，其中，引物对SY161由SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的两条单链DNA组成；引物对SY326由SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的两条单链DNA组成

本发明还提供一种获取山药DNA指纹图谱的成套引物对，由述的引物组合物和下述引物对中的至少一种组成：

A1)由SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的两条单链DNA组成的名称为SY69的引物对；

A2)由SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的两条单链DNA组成的名称为SY104的引物对；

A3)由SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的两条单链DNA组成的名称为SY108的引物对；

A4)由SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的两条单链DNA组成的名称为SY158的引物对；

A5)由SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的两条单链DNA组成的名称为SY196的引物对；

A6)由SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示的两条单链DNA组成的名称为SY216的引物对；

A7)由SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示的两条单链DNA组成的名称为SY280的引物对；

A8)由SEQIDNo.19和SEQIDNo.20所示的两条单链DNA组成的名称为SY302的引物对。

本发明提供一种获取山药DNA指纹图谱的产品，所述产品含有所述的获取山药DNA指纹图谱的引物组合物或所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对。

上述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统，如由上述获取山药DNA指纹图谱的引物对、上述获取山药DNA指纹图谱的成套引物对A或上述获取山药DNA指纹图谱的成套引物对B和下述至少一种试剂和/或仪器组成的系统：进行PCR扩增所需的其它试剂、进行凝胶电泳所需的试剂、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统和照相机。

本发明还提供一种制备所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对的方法，包括将任一所述引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。

本发明还提供一种获取山药DNA指纹图谱的方法，包括：

1)以山药的基因组DNA为模板，用所述的获取山药DNA指纹图谱的引物组合物或所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

2)将1)中得到的所述PCR扩增产物进行电泳，得到所述山药的DNA指纹图谱。

上述方法中的PCR扩增体系为：dNTPs(10mmol/L)2.0μL，10×buffer(Mg2+)2.5μL，正向引物1.0μL，反向引物1.0μL，基因组DNA(50～60ng/μL)1.0μL，Easy-TaqDNAPolymerase0.5μL，最后加水至25μL；PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52-55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

利用上述的方法得到的山药DNA指纹图谱也应在本发明的保护范围之内。

所述的获取山药DNA指纹图谱的引物组合物或2所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对在获取山药DNA指纹图谱中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述的获取山药DNA指纹图谱的产品在获取山药DNA指纹图谱中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述的山药DNA指纹图谱在分析山药种质资源中的应用也应在本发明的保护范围之内。

本发明利用cpSSR分子标记成功构建了山药种质资源单一引物的指纹图谱表，使得山药种质资源真实性的鉴定简便、快捷、重复性和稳定性好，为cpSSR分子标记技术更广泛地用于山药种质资源真实性鉴定打下良好的基础。

附图说明

图1为引物SY161对64个山药种质资源的扩增产物电泳图。

图2为引物SY326对64个山药种质资源的扩增产物电泳图。

图3为山药种质资源的UPGMA聚类图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

EasyTaqDNAPolymerase购自北京全式金生物技术有限公司。

64种山药种质资源，公众可从湖北省农业科学院粮食作物研究所获得。

铁棍山药、太谷山药在文献“腊贵晓，理向阳，郭红霞，等.2017.铁棍山药和太谷山药代谢成分差异研究.河南农业科学,46(5),116-119.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。高阳小白嘴、日本青森、神农山4号、_怀山药在文献“张文芳.2018.基于怀山药转录组测序的SSR分子标记的开发与应用.河南师范大学”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。沁阳野山药、山西永济山药、村太谷山药、沁阳太谷山药在文献“王智，鲁传涛，刘红彦.2004.山药品种资源白涩病抗性鉴定.河南农业科学,6,63-65.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。牛腿山药在文献“樊祖立，范金华，唐兴发.等.2017.安顺市山药引种适应性及食用品质分析.耕作与栽培,4,20-22.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。河北小白嘴山药、河北棒药在文献“王雪，苗泽兰，孙志梅.等.2019.冀中平原主栽山药品种的生长发育和养分累积特征.植物营养与肥料学报,25(3),510-518.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。佛手山药在文献“植飞，邢琪昌，汪莹.等.2017.佛手山药多糖对2型糖尿病大鼠糖脂代谢及氧化应激的影响.食品科学,38(5),262-266.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。水晶山药在文献“吴志刚，范传颍，包晓青.等.2014.山药种质资源核糖体rDNA-ITS区序列分析.中草药,45(8),1136-1142.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。紫玉淮山药在文献“范育明，张宝玉，张立伟.等.2017.紫玉淮山药浅槽定向优化栽培生产技术.农业开发与装备,5,144-145.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。中国台湾紫山药在文献“张武君，陈菁瑛，刘保财.等.2017.紫山药研究进展.福建农业学报,32(4),461-467.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。芹峰淮山药在文献“张育业.等.2019.芹峰淮山品种特征特性及栽培技术.福建农业科技,10,42-44.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。嘉祥细长毛山药丰产栽培在文献“韩宗礼.等.1989.嘉祥细长毛山药丰产栽培.北方园艺,5,11-13.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。白山药在文献“张虹，白红丽，王宝森.等.2009.云南红河紫山药与白山药中微量元素的比较分析.江苏农业科学,4,164-165.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。日本白山药在文献“王飞，刘红彦，鲁传涛等.2005.5个山药品种资源的农艺性状和营养品质比较.河南农业科学,3,58-60.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。安砂小叶薯在文献“邓永宁.等.2019.安砂小叶薯无公害高产栽培技术.福建农业科技,3,28-29.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。明淮1号在文献“陈芝华，华树妹，李丽红.等.2016.淮山药新品种“明淮1号”的选育及应用.湖南农业科学,7,18-20，23.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。永丰淮山药在文献“尹明华，徐志坚，黄玮.等.2019.江西山药种质资源遗传多样性及其组培苗遗传稳定性的RAPD检测.中草药,47(19),3486-3493.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。瑞昌山药在文献“詹寿发，杨丽，彭琴.等.2014.野生山药内生真菌对瑞昌山药促生作用研究.广东农业科学,10,23-26.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。阳明山山药在文献“陈芝华，华树妹，李丽红.等.2019.阳明山山药浅生槽高效集约化栽培技术.植物营养与肥料学报,2,24-26.”中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。苏蓣4号在https://www.nlmy.com.cn/article/usvtsu.html中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。苏蓣6号在http://newiic.jaas.ac.cn/show-199-351-1.html中公开过，公众可从湖北省农科院粮食作物研究所获得。

实施例1、用于山药种质资源品种鉴定的cpSSR指纹图谱表的构建

选取64份山药种质资源如表1所示。采取枝条上无病虫害的新鲜嫩叶，低温保存带回实验室，-80℃保存备用。

表1 64份山药种质资源

DNA提取及引物筛选

以表1所示的64种不同生长出来山药种质资源的叶片为材料，分别采用SDS法提取DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测各山药的总DNA纯度、质量以及完整性。用紫外分光光度计测定提取的DNA在260nm和280nm处的吸光值，确定DNA的纯度及浓度。将各品种甘薯的DNA稀释至50-100ng/μL，于-20℃保存备用。

cpSSR-PCR扩增

参考薯蓣(Dioscoreaopposita)叶绿体全基因组(Gen-Bank登录号KY996494)^[17]，共设计了21对cpSSR引物，由天一辉远公司合成。筛选出10对引物用于全部供试样品的PCR扩增(表2)。

PCR扩增体系：dNTPs(10mmol/L)2.0μL，10×buffer(Mg²⁺)2.5μL，正向引物1.0μL，反向引物1.0μL，基因组DNA(50～60ng/μL)1.0μL，Easy-TaqDNAPolymerase0.5μL，最后加水至25μL；PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52-55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

PCR产物检测：0.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，105V电泳3h，用0.1％AgNO₃溶液进行染色，在1.5％NaOH溶液和甲醛溶液组成的显影液中显影，拍照，记录结果。

表2试验所用cpSSR引物序列信息

数据处理及分析

根据PCR产物的电泳结果，对cpSSR的扩增条带进行统计分析，采用人工读带的方法，在凝胶相同位置，扩增出DNA条带记为“1”，同一位置无条带或条带模糊记为“0”，构建原始矩阵。构建与指纹编码相对应的山药种质资源的DNA指纹图谱。根据筛选的10对cpSSR引物的扩增结果，构建64份种质资源的DNA数字指纹图谱，如表4所示，从表4中可以看出，任何一对引物都不能单独将所有供试种质资源完全区分。结合扩增条带型统计的难易程度及引物可重复性的高低等因素，将核心引物进行排序，首先用排在第一位的引物进行品种鉴定，如不能将所有供试种质资源区分，依序再加一个引物进行组合鉴别，依次类推，直至将所有种质区分开。本研究最少采用2对引物即可将所有供试种质资源完全区分，最终选用SY161，SY326构建64份供试种质资源的指纹图谱如表3所示，根据其构建的聚类分析图如图3所示。

表3引物SY161及SY326构建64份山药种质资源DNA指纹图谱

表4采用10对cpSSR引物构建64份种质资源的DNA数字指纹图谱

本发明利用cpSSR分子标记成功构建了山药种质资源单一引物的指纹图谱表，使得山药种质资源真实性的鉴定简便、快捷、重复性和稳定性好，为cpSSR分子标记技术更广泛地用于山药种质资源真实性鉴定打下良好的基础。当需要鉴定某一山药的种质资源的时候，可以根据上述方法采用引物SY161及SY326进行扩增，并将结果与上述表3中的结果比对，根据比对结果得到待鉴定山药的种质资源。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 用cpSSR分子标记法对山药种质资源真实性进行鉴别的方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctccctct ttctcctttg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaatgaaaa gggatcggat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatatcgcg gaacaataaa a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgattcccc atcaagtaaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggtcgtgct cgaaaagtta 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgagtcctcg aaaagggatg 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgagtagatc cgaatagtct ttcc 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaccaagcat tgcctgaact 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attgtccttg aatgagtgca t 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggatttgaa ccgatgactt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aatcgtgagg gttcaagtcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggtgacacg aggattttca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aacgattttg gattggctca 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgagagatca aatgagttct tca 23

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gatgctggtt cgaaagcaat 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcgcattcc aaaataactc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcgattcttc cacaatggac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaggaactcc cgaacatttg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgagtcgggt tcttctccta 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

taaggcaaag ggtcgagaaa 20

Claims

1.一种获取山药DNA指纹图谱的引物组合物，所述引物组合物由引物对SY161和引物对SY326，其中，引物对SY161由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的两条单链DNA组成；引物对SY326由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条单链DNA组成。

2.获取山药DNA指纹图谱的成套引物对，由权利要求1所述的引物组合物和下述引物对中的至少一种组成：

A1)由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的两条单链DNA组成的名称为SY69的引物对；

A2)由SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的两条单链DNA组成的名称为SY104的引物对；

A3)由SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的两条单链DNA组成的名称为SY108的引物对；

A4)由SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的两条单链DNA组成的名称为SY158的引物对；

A5)由SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的两条单链DNA组成的名称为SY196的引物对；

A6)由SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的两条单链DNA组成的名称为SY216的引物对；

A7)由SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的两条单链DNA组成的名称为SY280的引物对；

A8)由SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示的两条单链DNA组成的名称为SY302的引物对。

3.获取山药DNA指纹图谱的产品，其特征在于：所述产品含有权利要求1所述的获取山药DNA指纹图谱的引物组合物或权利要求2所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对。

4.制备权利要求2所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对的方法，包括将任一所述引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。

5.一种获取山药DNA指纹图谱的方法，包括：

1)以山药的基因组DNA为模板，用权利要求1所述的获取山药DNA指纹图谱的引物组合物或权利要求2所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

6.权利要求1所述的获取山药DNA指纹图谱的引物组合物或权利要求2所述的获取山药DNA指纹图谱的成套引物对在获取山药DNA指纹图谱中的应用。

7.权利要求3所述的获取山药DNA指纹图谱的产品在获取山药DNA指纹图谱中的应用。